Abstract
medulloblastoma (MB) er den vanligste ondartet pediatrisk hjernesvulst. Mens veier som er deregulert i MB gjenstår å bli fullstendig karakterisert, forsterkning og /eller overekspresjon av
MYCN
genet, som er har en avgjørende rolle i lillehjernen utvikling som en regulator av neural stamcelle skjebne, har vært identifisert i flere MB undergrupper. Fenotypisk, er avvikende uttrykk for MYCN forbundet med stor celle /anaplastisk MB variant, som står for 5-15% av tilfellene, og er assosiert med aggressiv sykdom og dårlig klinisk utfall. For bedre å forstå hvilken rolle MYCN i MB
in vitro Hotell og
in vivo
og for å bidra til utviklingen av MYCN målrettede behandlingsformer vi etablerte tumor-avledet neurosfære cellelinjer fra GTML (
Glt1-TTA /TRE-MYCN-Luc
) genmodifisert mus modell. En fraksjon av GTML neurosfærer ble funnet å være vekstfaktor uavhengig, uttrykt CD133 (en markør av nevrale stamceller), klarte ikke å differensiere ved MYCN uttak og var svært tumorgene når orthotopically implantert i lillehjernen. Prinsipal komponent analyser ved hjelp av enkelt celle RNA-analyse data antydet at den kliniske kandidat aurora-A kinase inhibitor MLN8237 konverterer GTML Neurosfærene å ligne ikke-MYCN uttrykkere. Korrelere med dette, MLN8237 utvidet betydelig overlevelsen av mus med GTML MB allografts. I sammendraget, våre resultater viser at MYCN spiller en avgjørende rolle i ekspansjon og overlevelse av aggressive MB-spre celler, og etablere GTML Neurosfærene som en viktig ressurs for utvikling av nye terapeutiske strategier
Citation. Ahmad Z, Jasnos L, Gil V, Howell L, Hallsworth A, Petrie K, et al. (2015) Molekylær og
In Vivo
Karakterisering av kreftfremmende celler avledet fra MYCN-Dependent medulloblastoma. PLoS ONE 10 (3): e0119834. doi: 10,1371 /journal.pone.0119834
Academic Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, SPANIA
mottatt: 11 juli 2014; Godkjent: 16 januar 2015; Publisert: 18 mars 2015
Copyright: © 2015 Ahmad et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra institutt for kreftforskning, American Institute for Cancer Research (11-0301), Cancer Research Storbritannia (C34648 /A12054 ), og hjernesvulst Charity (SDBTT 6/88). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hos barn medulloblastoma (MB) er den hyppigst forekommende primitive neuroectodermal tumor (PNET) med opprinnelse i hjernen og har blitt klassifisert i fire store subtyper basert på kopi nummer variasjon og transkripsjons profiler: MB
WNT , MB
SHH (Sonic pinnsvin), MB
Group3 og MB
Group4 [1,2]. Til tross for fremskritt gjort i MB molekylær klassifisering, i de fleste barne MB (med unntak av avvikende SHH og Wnt trasé) onkogene signalveier som er terapeutisk målrettes gjenstår å bli identifisert. Nyere forskning har imidlertid vist at MB husing MYCN amplifisering og /eller overekspresjon kan også være rettet [3]. Forsterkning av
MYCN
genet er assosiert med dårlig prognose [4,5], er observert i MB
SHH, MB
Group3 og MB
Group4 subtyper [6-10] og er avvikende uttrykt i de fleste humane MB [11]. Til tross for den økende betydningen av MYCN som et terapeutisk mål i MB, men vi har fortsatt en dårlig forståelse av hvordan avvikende
MYCN
uttrykk forvandler nevrale stilk /stamceller til svulster. Vi har tidligere rapportert om en genmodifisert mus modell (GEMM) av MYCN-drevet MB (GTML:
G
LT1-TTA /
T
RE-
M
YCN-
L
uc
) hvor MYCN uttrykket styres av doksycyklin (DOX) (Tet-off). Ved hjelp av dette systemet vi viste at målrettet uttrykk for MYCN induserer både klassisk og stor celle anaplastisk (LCA) patologi uavhengig av SHH [11]. Undergruppe klassifikasjon basert på genuttrykk profiler som stammer fra menneskelige medulloblastoma prøver i forhold til transgene mus foreslo at GTML og GTML /Trp53
KI /KI mus vises uttrykk profiler karakteristisk for menneskelig MB
Group3 [3]. Neurosfære linjer etablert fra GTML mus sprer robust, uttrykke nevrale markører, og danne svulster når orthotopically implantert i hjernen til mus [12]. Disse resultatene tyder på at GTML neurosfære kulturer inneholder tumorceller som forplanter seg, noe som gjør dette til en potensielt nyttig system med hvilket transformerende rolle MYCN i MB genese kan bli klarlagt.
I denne sammenheng, gjennomførte vi en serie av molekylære og cytologiske undersøkelser for å karakterisere neurosfære kulturer etablert fra GTML mus. Enkelt celle analyse viste utvidelse av en homogen cellepopulasjon er avhengig av MYCN uttrykk for overlevelse. Disse kuler er motstandsdyktig mot differensiering, og har karakteristiske trekk ved delvis opptatt av nevrale stamceller og forløperceller med MYCN uttrykket, inkludert oppregulering av nestin, CD133, Otx2, og Musashi, ekspresjon av disse er forbundet med opprettholdelse av en udifferensiert tilstand, og typisk av MB-stammen /stamfedre. Lillehjernen implantasjon av GTML Neurosfærer subpopulasjoner viste at svulsten spre potensial bodde i CD133 + men ikke CD15 + eller CD15- celler. Videre behandling av svulster med MLN8237, en aurora-A kinase inhibitor som induserer MYCN oncoprotein degradering [13], effektivt forlenget overlevelse på GTML mus med aggressive MB. Disse resultatene avklare rollen MYCN i cellulær transformasjon og progresjon av MB, styrke hypotesen om at MYCN driver utvidelse og berikelse av CD133 + kreftfremmende celler stand til å generere aggressiv MB.
Materialer og Metoder
mus drifta
GTML musemodell har blitt beskrevet tidligere [11]. Alle mus prosedyrene ble godkjent av Institute of Cancer Research Etisk Komité følgende UK hjemmekontoret retningslinjer (Prosjekt Lisensnummer: 70/7945). Alle operasjoner ble utført under bedøvelse isoflurothane, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
neurosfære isolasjon og kultur
Vevet ble isolert fra GTML svulster eller postnatal P5, P8, P21 lillehjernen og midthjernen og overføres til kaldt HBSS (Invitrogen). Vevene ble deretter skåret i 2-3 mm
2 deler og enzymatisk dissosiert ved 37 ° C ved anvendelse av Liberase Blendzyme 1 (0,62 Wunsch enheter /ml, Roche) i PBS i 15-45 min. Enzymreaksjonen ble stoppet ved anvendelse av 10% volum føtalt kalveserum (FCS, PAA) før cellene ble triturert i DMEM /F12 medium inneholdende B27 og filtrert gjennom en 70μm mesh. Deretter ble cellene dyrket i DMEM /F12-medium (Invitrogen) supplert med 2% B27 supplement (Invitrogen), 20 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF, Sigma), 20 ng /ml fibroblast vekstfaktor (bFGF-basis, Invitrogen) og 100 enheter /ml penicillin /streptomycin.
For å undersøke celledelingsrate, neurosfærene ble dissosiert ved pipettering, og celler farget med trypanblått ble talt opp ved hjelp av en hemocytometer. Alternativt kan celler ble tellet ved bruk av Guava PCA-96 instrument etter farging med Guava ViaCount Flex-reagens (01:50, Millipore), i henhold til produsentens protokoll.
For vurdering av differensiering potensialer, ble cellene sådd ut på dekk belagt med poly-D-lysin (0,1 M, Sigma), 0,1% gelatin eller laminin (0,5 ug-2.0μg /ml, Invitrogen) og dyrket under betingelser differensiering i opptil 14 dager. Differensiering medium er sammensatt av DMEM /F12-medium supplert med 10% FCS, B27, med eller uten 1 pg /ml retinsyre (Sigma Aldrich). Vi har også belagt ferske sortert GTML celler i nærvær av 0.5-1.0mg /ml kollagen (Invitrogen, A1048301). I pro-differensiering Neurobasal media med serum
ortotopiske implantasjon
For å undersøke den karsinogent potensial, celler direkte oppnådd fra primære tumorer, GTML kuler, eller deres derivater ble resuspendert i neurosfære media og injiseres i lillehjernen av FVB /N hunnmus: følgende antall celler ble implantert: primære tumorer (25 eller 100 celler /reiser ), M10519 celler (passasjer 10-27, 25 til 10 000 celler /språk) eller fersk sortert celler (10 celler /språk).
Mus i alderen 6-8 uker ble bedøvet ved hjelp av innånding av bedøvelse isoflurothane. Et innsnitt (1 cm
2) ble tatt opp i midtlinjen av hodebunnen over lillehjernen, og et lite hull med en diameter på 1 mm ble laget i skallen ved hjelp av en dental drill ved en posisjon 1 mm sideveis fra midtlinjen og mellom 1 og 2 mm posteriort for lambdoidal sutur unngå eventuelle åpen blodkar. Celler ble injisert i en dybde på 2 mm ved hjelp av en 10 pl Hamilton-sprøyte i en stereotaksisk ramme. Nålen ble igjen på plass for ytterligere 2 minutter for å unngå refluks. Nålen ble fjernet forsiktig for å unngå å flytte tumorceller. Hodeskallen ble deretter forseglet ved hjelp av kirurgisk lim. Etter implantasjon tumorprogresjon ble overvåket ukentlig bruker IVIS levende bilde System (Caliper Life Sciences) i henhold til produsentens instruksjoner. Luciferase avbildning ble utført som tidligere beskrevet [11] med unntagelse av at D-luciferin kaliumsalt (Parkin Eimer) i PBS ble anvendt ved 15 mg /kg.
Doksycyklin behandling ble utført som beskrevet i vår tidligere papir [11] . I korthet mus med utviklet tumorer målt med et signal fra 1×10
9 fotoner /s ble foret med chow (TestDiet) inneholdende doxycyclin ved 200 mg /kg for å gi en daglig dose på omtrent 32 mg /kg. Tumor byrde ble bestemt av bioluminesens.
Immunohistochemistry og Immunocytochemistry
For immunocytochemistry Neurosfærene ble forankret i oktober montering media (BDH) og fryses sakte ved hjelp av isopropanol avkjølt i flytende nitrogen. Deretter 4 um tykke frysesnitt ble montert på poly-lysin belagte objektglass (VWR) og fiksert med 4% paraformaldehyd (PFA, Sigma) i PBS i 10 minutter. Etter etterfølgende vaskinger med TBS ble seksjonene deretter blokkert med 10% bovint serum albumin (BSA, Sigma), 15 mM glycin (Sigma) og 0,02% Triton x100 (Sigma) i TBS i 1 time ved romtemperatur. For mus antistoffer seksjonene ble blokkert ved hjelp av MOM blokkere kit (Vector Laboratories) i henhold til produsentens anvisninger. Seksjoner ble inkubert med primært antistoff over natten i blokkeringsoppløsning (0,1% BSA-PBS) ved romtemperatur, og etter etterfølgende vaskinger med TBS Glassene ble merket med sekundære antistoffer konjugert med Alexa Fluor (1: 500, Molecular Probes). Lysbilder ble kontra med DAPI (Sigma) og deretter ble montert med Fluoromount G (Southern Biotech).
For immunhistokjemi, ble tumorprøver fiksert i 4% paraformaldehyde i PBS i 24 timer til 7 dager. Prøvene ble avkalkes med 0,3 M EDTA og deretter behandlet med Leica ASP300S vev prosessor for å lage en parafinvoks blokk. Seksjoner ble kuttet på 4 um for hematoxylin og eosin farging og immunhistokjemi ble gjennomført som tidligere beskrevet [14]
Antistoffer brukes for immunhistokjemi og immunocytochemistry var:. MYCN (OP-13, Calbiochem), Ki67 (556003, BD Pharmingen ), GFAP (Z0334, DAKO), CD15 (332778, BD Bioscience), Tuj1 (BAM1195, R . D), kløyvde caspase 3 (9664, Cell Signaling)
immunoblotanalyse
neurosfærer ble dyrket under normale og differensierings betingelser i nærvær eller fravær av 1 ug /ml doksycyklin. Sfærer ble høstet, og deretter suspendert i cellelyseringsbuffer (Cell Signaling Technology) i overensstemmelse med fabrikantens protokoll. Immunoblot-analyse ble utført som beskrevet [14]. Følgende antistoffer ble brukt: MYCN (OP-13, Calbiochem), c-MYC (SC-40, Santa Cruz), nestin (ab5968, Abcam), beta-aktin (4967, Cell Signaling Technology) og GAPDH (2118, Cell Signaling -teknologi).
Strømningscytometri og fluorescens-aktivert cellesortering
For cellesyklusanalyse, GTML sfærer ble behandlet med 1 ug /ml doksycyklin og prøver ble tatt ved 0, 2, 4, 6, 8, 24 og 48 timer. Prøvene ble fiksert med 70% iskald etanol, og deretter ble lagret ved 4 ° C i minst 30 min. Da celler ble farget med propidiumjodid (PI) (40μg /ml, Invitrogen) ved 37 ° C i 30 minutter, og deretter ble lagret ved 4 ° C i 24 timer. Cellesyklus profiler ble analysert ved hjelp av en Becton Dickinson LSR II fluorescens-aktivert celle analysator.
For å isolere CD15 + og CD15- eller CD133 + og CD133- populasjoner, M10519 GTML Neurosfærene ble dissosiert til enkeltceller, og deretter ble farget med anti-CD15 konjugert med FITC (1: 100, Millipore) eller anti-CD133 konjugert med PE (1: 100, Miltenyi Biotec) i 30 minutter på is, vasket med PBS inneholdende 0,3% bovint serumalbumin med antibiotika. Cellene ble deretter motfarget med 0,5 ug /ml av DAPI i PBS og sortert gjennom en Becton Dickinson FACS Aria. Celler ble sortert i DMEM /F12 medium inneholdende vekstfaktorer og B27. Renheten av hver populasjon ble vurdert ved slutten av hvert slag ved hjelp av samme analysatoren.
Rensing av CD133 +/- celler ved hjelp av magnetiske kuler
M10519 GTML neurosfærer ble dissosiert til enkeltceller ved hjelp av neurosfærene dissosiasjon kit P (Miltenyi Biotec) etter produsentens anvisninger. Etter dissosiasjon, ble cellene sentrifugert ved 500 x g i 10 minutter og deretter ble pelleten resuspendert i 1 ml PBS supplert med 2% FBS og 1 mM EDTA (buffer sortering). Isolering av CD133 + og CD133- populasjoner ble opprinnelig utført gjennom magnetisk separasjon (Easysep, Stemcell Technologies), etterfulgt av en siste rensetrinn ved hjelp av FACS ARIA (BD Biosciences). Cellesuspensjon (0,5 ml, 2×10
7-celler) ble inkubert med 50 ul av anti-CD133 (Prominin-1) PE-konjugert antistoff (Miltenyi Biotec) eller anti-IgG
1 konjugert med PE (Miltenyi Biotec) for 10 min ved 4 ° C. Cellene ble deretter vasket med sortering buffer og inkubert med 100 ul av PE-utvalg cocktail (EasySep PE utvalg kit, Stemcell Technologies) per 1 ml av sorterings buffer i 15 minutter ved værelsetemperatur etter tilsetning av EasySep 50 ^ nanopartikler per 1 ml av cellesuspensjonen før magnetisk atskillelse. For å forbedre renheten, ble det magnetiske separasjonsprosessen gjentas totalt tre ganger. Renheten av perle-bundet eller -unbound fraksjoner ble vurdert ved hjelp av FACS LSRII analysator (BD Biosciences). Både CD133 + og CD133- fraksjoner ble ytterligere renset fra bead-bundne og ubundne-fraksjonene, henholdsvis, ved hjelp av FACS Aria (BD Biosciences). 7AAD (Beckman Coulter) ble benyttet for å ekskludere døde celler i FACS-analyser. Levende celler ble telt med trypanblått flekker før orthotopic implantering (10 celler per område).
Begrenset fortynning analyse
M10519 celler (100, 10, og en celle (r) per 100 ul av Neurobasal media i nærvær av vekstfaktorer) ble platet inn i en 96-brønners plate for langvarig kultur. Cellene ble overvåket bi-ukentlig for å vurdere sfære formasjon, og deretter den endelige anslaget ble gjort ca 4 uker etter såing.
Grunning for enkeltcelleanalyser
For denne studien, vi først utformet 48 primere for (i) faktorer som kommer til uttrykk i tre distinkte MB subtyper [5,15-17], (ii) kjente nevrale stamcellemarkører, (iii) kjent kreftmarkører og (iv) MYCN målene. Vi undersøkte disse sammen med 93 primere vi brukte for mus embryonale stamceller i våre tidligere studier [18,19] for primer godkjenning ved cDNA fra GTML og mus embryonale stamceller. Ut av 141 primere, vi valgte 96 primere som passerte primeren validering, prosessen som har blitt beskrevet tidligere [18].
Cell sortering for enkelt celle analyser
Nøyaktigheten av sorteringsprosessen ble bestemt som følger. Først 2×10
5 celler ble farget med 0.4μl carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl Ester (CFSE) fluorescerende fargestoff (Sigma Aldrich), og enkeltceller ble sortert ved hjelp av en celle sorter Becton Dickinson inn AG480F lysbilder (Beckman Coulter). Deretter tilstedeværelse av merkede celler ble inspisert under et fluorescerende mikroskop CKX41 (Olympus) for å bekrefte at bare én celle ble oppdaget ved en reaksjon stedet av raset. Dersom to celler ble funnet på en enkelt reaksjons område, ble kalibrering av sorteringsmaskinen startes på nytt fra begynnelsen. Når sortering nøyaktighet ble bekreftet, ble prøve celler merket med propidiumjodid, sortert i PCR-rør, og deretter frosset. Cellene ble deretter tint på is for å forstyrre cellemembraner.
revers transkripsjon og target-spesifikk amplifikasjon
Den eksperimentelle detalj er beskrevet i vår tidligere artikkel [18]. Kort sagt ble revers transkripsjon og cDNA-amplifisering utført som følger. Reaksjonen ble inkubert ved 50 ° C i 15 minutter, 95 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 18 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 4 minutter. Unincorporated primere ble senere fjernet ved behandling med Eksonuklease I (Exo jeg, NEB). En reaksjonsblanding inneholder 10 pl amplifisert cDNA, 0.4μl av 10 x Exo I buffer, 0.8μl Ekso I enzym (20U /mL), og 2.8μl av RT-PCR klasse vann. Reaksjonen ble holdt ved 37 ° C i 30 minutter, deretter ved 80 ° C i 15 minutter for å inaktivere av Exo I. slutt ble DNA Suspensjon Buffer (36μl) tilsatt til hver prøve (totalt 50 ul).
Analyser bruker BioMark system
Eksperimentelle detaljer er beskrevet i våre tidligere papirer [19] [18], bortsett fra at vi brukte 96×96 genuttrykk IFC Array plater (Fluidigm Corporation) i denne studien. Sample og primer-blandinger ble lastet inn separat til innløpene plassert på begge sider av matrisen. En BioMark qPCR reaksjon blanding besto av 2,5 pl av 2xTaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems), 0.25μl av 20x DNA Binding Dye Sample Loading Reagens (Fluidigm Corporation), 0.25μl av 20x EvaGreen DNA-bindende fargestoff (Biotium) og 2 ul av Exo I-behandlet cDNA prøven. En primer reaksjonsblandingen var sammensatt av 2,5 pl av 2xAssay Laster Reagens, 1.25μl av DNA Suspension buffer, og 1.25μl av en 20 uM primer par. Prøve lasting ble gjort i henhold til bruksanvisningen for BioMark system.
Datavalidering
For å vurdere dannelsen av ikke-spesifikke forsterkning produkter på grunn av primer-dimer dannelse eller uspesifikke gløding vi gjennomførte smelting kurve analyser for hver primer som tidligere beskrevet [18].
Statistisk analyse
Cq verdier høyere enn terskelen for pålitelig CQ verdier (Cq
terskel, S1 Table) var utelatt fra de statistiske analysene som beskrevet [18]. Prinsipalkomponentanalyse og hierarkisk clustering analyse (Ward metode) ble utført ved bruk av R. Det skal bemerkes at for klyngeanalyse og prinsipal komponent analyse, Cq-verdier høyere enn Cq
terskel ble behandlet som upålitelige verdier, og således ble alle erstattet med Cq
terskel + 1d. Den Kolmogorov-Smirnov-testen ble brukt til å evaluere forskjellene i korrelasjonskoeffisient fordelinger av datasett utledet fra to prøvesettene, på grunn av tilstedeværelsen av skjevheten i fordelingen og ujevnt antall observasjoner mellom sammenlignet grupper, som begge var ikke egnet for å gjennomføre sterkere tester. The Log-rank test ble brukt for å evaluere forskjellen på overlevelse distribusjoner av to prøvegrupper.
Resultater
Etablering av GTML neurosfære linjer
I denne studien vi forsøkte å identifisere tumorfremmende celler i MB, og for å etablere en effektiv pre-klinisk studie system for å undersøke potensialet av små molekyler i å hindre tumorutvikling. Vi utnyttet
Glt1-TTA /TRE-MYCN-luciferase plakater (GTML) transgen musemodell, der undertrykkelse av menneske MYCN og luciferase er oppnåelig i en DOX avhengig måte i hjernevev [11,12] ( S1 fig.). I dette systemet er svulst utvikling forebygges ved DOX, og tumorprogresjon er synlig ved hjelp av
in-vivo
bioluminescent imaging (S1 fig.); både tumorbelastning og
in vitro
cellevekst er lineært korrelert med luciferase signalintensitet (S1 fig.) [11].
Primære vev ble kirurgisk isolert fra voksende svulster overvåkes av ukentlig luciferase imaging ( fig. 1A og S1 fig.). Det utskårede tumorer ble dissosiert og dyrket i serumfrie Neurobasal medier inneholdende EGF og bFGF [20], og etablerte neurosfærer i løpet av 3-7 dager (fig. 1A), i motsetning til eksplantater av midthjernen eller lillehjernen fra villtype-mus (som hadde en begrenset levetid på 7-10 passasjer). Celler etablert fra minst 6 forskjellige primære tumorer ved ulike aldre var udødelig og oppviste en doblingstid på omtrent 24 timer. (S2 Bord og S1 fig.). Tatt sammen tyder disse data på at det eksisterer en meget proliferativ, transformert celle mest sannsynlig drevet av MYCN transgen ekspresjon.
(A) Etablering GTML kuler i kultur. Primære celler ble isolert fra GTML svulster, som ble identifisert gjennom bioluminescence signaler (øverst til venstre) og morfologi, og ble deretter dissosiert til enkeltceller. M10519 GTML Neurosfærer kultivert etter 10 dager er også vist. Skala: 100 um. (B) Effekt av MYCN uttak på cellevekst. M10519 GTML sfærer ble sådd ved tetthet av 1×10
5 celler /ml i nærvær eller fravær av 1 ug /ml av DOX, og spredning av sfærer ble målt ved hjelp av WST-1 metabolske analysen. Feilfelt, ± SD. (C) Virkning av MYCN uttak på cellesyklusen. M10519 GTML neurosfærer ble behandlet med DOX før cellesyklus analyser ved hjelp av FACS. (D) Western-analyser. M10519 GTML kuler ble dyrket med 1 ug /ml DOX.
For å undersøke hvilken rolle MYCN i veksten av GTML celler, vi behandlet M10519 GTML Neurosfærene (samt flere cellelinjer, se S2 Fig .) med DOX, og funnet klare bevis på at veksten er avhengig av MYCN (fig. 1B). Cellecyklus-analyser ved bruk av strømningscytometri viste klart opphopning av vekstbegrensede celler i G1 fase, i løpet av 4 til 6 timer etter behandling (fig. 1C), Growth begrensning var sammenfallende med fullstendig undertrykkelse av MYCN, men ikke c-Myc-proteinet (S1 Fig . og S3 fig.), reduserte nivåer av Ki67, en spredning markør, og nestin, en neural stilk og /eller stamfar markør, 48 timer etter seponering av MYCN (fig. 1D og S1 fig.). Interessant, i motsetning til våre tidligere etablerte GTML linjer med villtype
Trp53 product: [12], som ble arrestert GTML celler raskt utvidet etter fjerning av DOX (S1 fig.), Noe som tyder på at MYCN tilbaketrekking er cytostatisk på en brøkdel av disse cellene og at veksten arrest er reversibel. Den inkonsistens mellom GTML cellene som benyttes i de to studiene kan skyldes, i det minste delvis, på det faktum at alle GTML celler etablert i den foreliggende undersøkelse havnen spontane mutasjoner i området ved
Trp53
genet som koder p53 DNA-bindende domene [3]. Vi foretok analyser for å fastslå hvorvidt kompenserende oppregulering av mus c-Myc-proteinet er involvert i frigjøring fra cellesyklus-stans og funnet at c-myc-nivåer var konstant (S1 Fig. Og S3 fig.), Noe som tyder på at i det minste i våre neurosfære kulturer , c-Myc ikke kompenserer for reduksjonen av MYCN (som tidligere er rapportert å forekomme i nevrale stamceller [21]). Klonogene potensialer av M10519 celler, en av GTML linjer, ble undersøkt gjennom videregående sfære analyser, viser at 42% av enkelt M10519 cellene var i stand til å danne kuler i kultur (S4 figur).
MYCN uttrykk driver utvidelse av celler uttrykker markører typiske for nevrale stilk og /eller stamceller og MB
for å karakter GTML neurosfærer, undersøkte vi uttrykket av nevrale stilk /stamcellemarkører ved immunocytochemistry. Vi fant at nestin, en markør for nervestammen /stamceller, og da spredning Ki67 ble uttrykt i GTML neurosfærer i en MYCN avhengig måte (fig. 2A). Ekspresjon av et neuron-spesifikk markør progenitor Tuj1 [22] ble imidlertid ikke synlig endret av MYCN tilbaketrekning (fig. 2A), noe som tyder på at uttømming av MYCN ikke dramatisk innvirkning på graden av differensiering i kultur. I motsetning til vår tidligere observasjon i GTML vev [11], ingen fremtredende reduksjon av Spaltet Caspase 3, en markør for apoptose, ble observert på MYCN tilbaketrekning (fig. 2A og S3 fig.). For å få et mer detaljert bilde av genekspresjon på celle-nivå, vi analysert en M10519 linjen (vi fant GTML linjene vi etablerte i denne studien var bemerkelsesverdig lik) ved hjelp av 96-dannede enkelt celle QRT-PCR (S5 Fig. Og S6 Fig .). Denne analysen viste at vanlige markører for MB og nevrale stamceller inkludert NeuroD1 [23], CD133 (Prominin 1) [24-27], Otx2 [11,28], og Musashi [29] ble nedregulert av MYCN tilbaketrekking (Fig. 2B og S5 fig.). Frekvensen av celler som uttrykker markører inkludert CD133 og Musashi ble også redusert med DOX, mens andre stamcellemarkører inkludert Sox2 var upåvirket av MYCN tilbaketrekking (Fig. 2C og S5 fig.). Uttrykk av markører for astrocytter og ependymal celler (GFAP) [30], astrocytter (S100b) [31], granulat Nevron forfedre og gliom (Olig2) [32-34] var knapt synlig (S5 fig.) Eller sjelden observert (S5 Fig .) i én celle-analyser. Korrelere med den raske veksten i kultur, MYCN uttrykk oppregulert mester regulatorer for cellecyklusprogresjonen, E2F1 og E2F2, som begge er MYCN mål [35] (S5 fig.). CD133, en markør for S, G2 og M fasene av nevrale stamceller [36] (fig. 2B og 2C). MYCN, som forventet, var knapt synlig i M10519 celler behandlet med DOX (Fig. 2B og 2C). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at MYCN uttrykk resulterer i utvidelsen av celler med markører som er typiske for nevrale stamceller og /eller stamfedre forbundet med MB tumorigenesis.
(A) M10519 GTML kuler ble behandlet med eller uten DOX for 17 dager. Immunofluorescens-analyse ble utført på cryosectioned kuler med anti-Ki67, anti-nestin, eller anti-Tuj1, anti-GFAP, og anti-c-Caspase 3 sammen med anti-MYCN. Kjerner ble kontra med DAPI. Bar, 50 pm. (B) En varme kartet for gjennomsnitts uttrykk nivåer (CQ verdier, n = 96) av 13 nevrale stamcelle genene er vist. (C) Prosent av celler som uttrykker CD133, Musashi, Sox2, MYCN, og CD15 vises. Vi undersøkte WT1 og WT2 celler (se teksten), ubehandlede M10519 kuler (M10519), M10519 kuler behandlet med DOX i 24 timer (Dox), eller M10519 kuler behandlet med MLN8237 i 24 timer (MLN8237).
96-genet (se S3 tabell og Janos
et al product: [19]) uttrykk profiler for 96 enkelt M10519 celler viste en grad av heterogenitet (S6 fig.). Enkelt celle BioMark HD uttrykk data er vist i S3 tabell. For å evaluere forskjellen på korrelasjonskoeffisient distribusjoner av datasett avledet fra to populasjoner, ved hjelp av Kolmogorov-Smirnov test vi beregnet parvise korrelasjonskoeffisienter av uttrykk nivåer i 96 gener i en gitt celle befolkning. Gjennomsnittlig korrelasjonskoeffisient (
R
) for M10519 Neurosfærene var 0,77, og forskjellen mellom M10519 celler og WT1 (
R
= 0,71, N
M10519 = 1081, N
WT1 = 990, D = 0,2662,
P
= 2.2×10
-16) eller WT2 (
R
= 0,60, N
M10519 = 1081, N
WT2 = 990 D = 0,57,
P
= 2.2×10
-16) celler var statistisk signifikant. Disse data indikerer at mens uttrykket profiler av de enkelte celler i M10519 neurosfære populasjon er ikke helt homogene i naturen, de transkripsjons profilene blant celler i WT1 og WT2 neurosfære kulturer avledet fra normal cerebella er betydelig mer heterogene. Videre MYCN trekning resulterte i en betydelig reduksjon av heterogenitet indeks (
R
= 0.69, N
M10519 = 1081, N
M10519 + Dox = 990, D = 0,27,
P
= 2.2×10
-16). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at MYCN uttrykk hever nivået på mobil homogenitet og utvider cellene med nevrale stamceller og progenitorceller markører.
MYCN stasjoner utvidelse av celler som er resistente mot differensiering stimuli i kultur
Interessant, til tross for stamcelle og /eller stamfar lignende transkripsjon profilen til de utvidede celler i neurosfære kulturer, GTML celler som uttrykker MYCN vises kun begrenset differensiering potensial
in vitro
. Etter 8 dager med vekst i serumholdig pro-differensiering media, fant vi at tre GTML linjer beholdt morfologiske trekk som er typiske for udifferensierte celler (S2 ill.), Selv om vi fant at det nevrale stammen /progenitor markør nestin ble nedregulert etter 2 dager med MYCN tilbaketrekning (fig. 1D). I motsetning til de samme betingelser indusert differensiering av neurosfærer etablert fra villtype cerebella (S2 fig.). Den tilsynelatende tap av differensiering potensial i GTML celler tyder på at genetisk eller epigenetisk endring kan oppstå etter langvarig MYCN aktivering. Vi fant også at GTML celler kunne ikke fullt ut differensiere under en rekke forskjellige forhold (for eksempel behandling med retinsyre, en sterk induser av differensiering (S2 fig.), Eller dyrking i medier som inneholdt 0,5 mg-1 mg /ml kollagen (data ikke vist )). Når M10519 celler ble dyrket i pro-differensierings medier inneholdende serum og retinsyrer, mens vi observerte nedregulering av MYCN, som blir styrt av
Glt1
promoter som er aktivert i progenitorer, og nestin ved 48-96 timer ser vi ingen betydelige endringer i nivåene av neuronal markører synaptophysin og Tuj1 og gliaceller markør GFAP (S3 fig.). Tatt sammen tyder disse resultater på at MYCN ekspresjon resulterer i anrikning av celler med markører som er typiske for stilk og /eller progenitorceller, driving utvidelse av sterkt formerende celler som er resistente mot differensierings stimuli. Den tilsynelatende tap av differensiering potensial i GTML kuler er i kontrast med Neurosfærene avledet fra humant MB (som
MYCN
status ble ikke undersøkt) [27] eller
Ptc Anmeldelser – /- mus modell [37], noe som tyder på at vedvarende uttrykk for MYCN driver irreversible satsing på utvidelse av celler med nevrale stamceller og progenitorceller markører.
MYCN-drevet GTML neurosfærene beholde egenskapene til primære svulster
in vivo
Vi har nylig vist at neurosfærer avledet fra GTML mus er istand til å danne svulster i en MYCN avhengig måte når orthotopically implantert i cerebella av ikke-transgene kullsøsken [12]. Som forventet, tilsetning av DOX til diett raskt redusert bioluminescens (Fig. 3A) og tumorbelastning (fig. 3B) i mus implantert med M10519 celler. For å evaluere effekten av MYCN tilbaketrekking
in vivo
, undersøkte vi uttrykket av biomarkører i ortotopiske svulster. Kjerner ble kontra med DAPI.
