Abstract
Bakgrunn
Mange vitamin-D-analoger utstilt fattige responsrater, høye systemiske toksisitet og hyperkalsemi i menneskelige forsøk for å behandle kreft. Vi identifiserte den første ikke-hypercalcemic anti-kreft-vitamin D analog MT19c ved å endre A-ringen av ergocalciferol. Denne studien beskriver terapeutisk effekt og virkningsmekanismen til MT19c både
in vitro Hotell og
in vivo
modeller.
Metodikk /Principal Finne
Antitumor effekten av MT19c ble evaluert i eggstokk-kreft celle (SKOV-3) xenotransplantater i nakne mus og en syngeniske rotter eggstokkreft modell. Serumkalsiumnivåer MT19c eller Calcitriol behandlede dyr ble målt. In-silico molekylær docking simulering og en cellebasert VDR reporter analysen avslørte MT19c-VDR interaksjon. Genomewide mRNA analyse av MT19c behandlet svulster identifisert narkotika mål som ble verifisert av immunoblotting og mikroskopi. Kvantifisering av cellulær malonyl CoA ble utført ved HPLC-MS. En bindingsstudie med PPAR-y-reseptor ble utført. MT19c redusert eggstokkreft vekst i xenograft og syngene dyremodeller uten å forårsake hyperkalsemi eller akutt giftighet. MT19c er en svak vitamin-D reseptor (VDR) antagonist som forstyrret samspillet mellom VDR og coactivator SRC2-3. Genome-wide mRNA analyse og western blot og mikroskopi av MT19c behandlet xenografttumorer viste hemming av fettsyre syntase (FASN) aktivitet. MT19c redusert cellulære nivåer av malonyl CoA i Skov-3 celler og hemmet EGFR /phosphoinositol-3kinase (PI-3K) aktivitet uavhengig av PPAR-gamma protein.
Betydning
Antitumor effekter av ikke- hypercalcemic agenten MT19c gi en ny tilnærming til design av vitamin-D basert kreft molekyler og en begrunnelse for å utvikle MT19c som et terapeutisk middel for ondartede ovarietumorer ved å målrette onkogene
de novo
lipogenese.
Citation: Moore RG, Lange TS, Robinson K, Kim KK, Uzun A, Horan TC, et al. (2012) Effekten av en ikke-Hypercalcemic Vitamin-D2 Avledet middel mot kreft (MT19c) og Hemming av fettsyrer i en Eggstokkreft Xenotransplantat Model. PLoS ONE 7 (4): e34443. doi: 10,1371 /journal.pone.0034443
Redaktør: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians-universitetet, Tyskland
mottatt: 6 juli 2011; Akseptert: 2 mars 2012; Publisert: 03.04.2012
Copyright: © 2012 Moore et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser. RKS og LB er oppført som co-oppfinnere på en patentsøknad. Heterosykler og derivater derav og metoder for produksjon og terapeutisk bruk US 2009/0221529 A1. Patentet har blitt tildelt til kvinner og spedbarn Hospital av RI, den nåværende arbeidsgiver forfatter RKS, TSL, KKK, RGM, NK, TCH, KR, JFP, MDP, SC, og NH. Ingen annen rådgivning, produkter under utvikling knyttet til denne agenten eksistere. Ingen av de fakta som er nevnt ovenfor endre forfatternes adherance til alle de PLoS ONE retningslinjer om deling av data og materialer.
Innledning
ovarialcancer (EOC) er den ledende dødsårsaken fra gynekologiske kreftformer. Tidlig stadium kreften er stort sett asymptomatiske, og de fleste av de diagnosene på presentasjonen detect etablert regionale eller fjernmetastaser [1]. Størstedelen av pasientene vil oppleve tilbakevendende sykdom, så vel som resistens overfor kjemoterapeutiske midler. Den lave overlevelsesraten til avansert stadium eggstokkreft har gjort tidlig oppdagelse, forståelse av etiologien av sykdommen og målretting av spesifikke karakteristiske trekk, som de viktigste prioriteringene i kreftforskningen [1].
Økt
de novo
fettsyresyntesen er et kjennetegn på kreft [2], [3]. Otto Warburg først observert forbedret anaerob glykolyse i kreftceller [4]. Normale menneskelige vev bruke kosten fett for syntese av nye strukturelle lipider, mens ustanselig prolifererende kreftceller for ukjente grunner unngå utnyttelse av kosten fett og utføre selvstendig
de novo
fettsyrer å kontinuerlig sørge for membran produksjon, energiproduksjon og lipid modifisering av proteiner [4].
De novo
fettsyresyntese innebærer to viktige enzymer; acetyl Co-A karboksylase (ACC) og fettsyre syntase (FASN). ACC karboksylater acetyl-CoA for å danne malonyl CoA. Den malonyl-CoA produkt blir videre omdannes ved FASN til langkjedede fettsyrer. Nylig syntetiserte fettsyrer er lagret av lipolytisk PPAR-gamma for å unngå fettsyre toksisitet. Derfor deregulerte funksjoner av lipogenic enzymer FASN og ACC involvert i
de novo
fettsyresyntese i forbindelse med lipolytisk PPAR-gamma spiller en viktig rolle i å fremme tumorcelleoverlevelse på flere nivåer.
Tallrike studier har vist at overekspresjon av FASN i human epitelial kreft i eggstokkene (EOC) [5] – [8] og kreft i bryst [9], prostata [10], tykktarm [11], lunge [12], endometrium [13] og papillært thyroid [14]. Et oligonukleotid mikromatriser som består av mer enn 6000 menneskelige gener identifisert fettsyre syntase (FASN) som en potensiell terapeutisk eller molekylære mål i EOC [15]. Deretter en farmakologisk målretting av FASN av naturlig produkt cerulenin og et syntetisk molekyl C75 trykkes vekst av eggstokkreft og brystkreft hos dyremodeller [16] – [17]
I denne studien, viser vi at MT19c er en ny klasse av antitumormiddel som er rettet mot kritiske komponenter av
de novo
fettsyrer maskiner i eggstokkreft xenografttumorer og eggstokkreft celler. MT19c er en roman vitamin-D2 avledet agent som utøvde ingen hypercalcemic effekter og vises veldig høye sikkerhets indekser i nakne mus. MT19c er en svak VDR antagonist som forstyrrer VDR-coactivator interaksjoner og viste ikke klassiske kalsitriol-VDR interaksjoner [18]. Ved lave doser av MT19c, eggstokkene xenografttumorer eller syngene rotter viste delvis å full respons og utvidet overlevelse signifikant sammenlignet med kontrolldyrene. Denne studien skisserer en ny tilnærming til design sikker og effektiv klasse av vitamin-d cytostatika som er blottet for hyperkalsemi samt klassiske vitamin-D-type toksisitet. Videre data gitt heri bekreftet at nåværende vekt på målretting
de novo
fettsyrer enzym maskiner for å behandle kreft i eggstokkene er en levedyktig tilnærming til behandling av humant eggstokkreft, og basert på denne studien MT19c har blitt identifisert som en lovende kandidat for klinisk evaluering i humane kreftpasienter på eggstokkene.
Resultater
effekt~~POS=TRUNC studier~~POS=HEADCOMP av MT19c i dyre EOC modeller
Den anti-tumor effekt av MT19c (fig. 1A) var studert ved bruk av human EOC celle avledet xenografter i nakne (nu /nu) mus og rotte eggstokk-kreft basert syngenisk rottemodell i Fisher-344 rotter. For det første studiet SKOV-3-celler suspendert i matrigel ble inokulert subkutant i en flanke av hvert dyr. Dyrene ble plassert i en behandling (n = 20) eller en kontrollgruppe (n = 10). Kjøretøy eller MT19c (5 mg /kg kroppsvekt) ble administrert IP annenhver dag i 60 dager for mus som bærer SKOV-3-avledede tumorer. Dyrene ble veid (figur 1B, nedre panel) og tumorstørrelse målt (figur 1B, øvre panel) hver 5 dag. Normal vektøkning for både kjøretøy og narkotika behandlet mus ble observert under behandling. Tumorstørrelse økt i kontrolldyrene med en gjennomsnittlig 2-gangers økning av tumordiameter i prøveperioden. I behandlingsgruppen, redusert tumorstørrelse betydelig i løpet av de siste 15 dagene av behandling med fem av åtte dyr som viser komplett respons (Fig. 1B, øvre panel). Animal overlevelse var signifikant forskjellig mellom behandlings- og kontrollgrupper (p = 0,0001, Fig. 1C) basert på Kaplan-Meier analyse. I løpet av evalueringsperioden, kjøretøy behandlet mus nådd punktet enden (10 mm svulst diameter) innen 20 dager etter behandling, mens en del av MT19c behandlede dyrene overlevde til studiens slutt.
(A) kjemiske strukturen MT19c. (B) Anti-cancer aktiviteten til MT19c i en EOC-modell i mus. Nakne mus (20 behandlet og 10 styrer) som bærer SKOV-3 deriverte tumorxenografter ble dosert (IP) med enten bærer eller kontroll MT19c (5 mg /kg kroppsvekt) på annenhver dag i 60 dager. Tumorstørrelsen ble beregnet (øvre panel) ved hjelp av et skyvelære hver 5. dag og vekt målt (lavere panel). (C) Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse for MT19c og kjøretøy-behandlede mus ble utført ved hjelp av Stata 9 (StataCorp, College Station, TX) og SAS 9.1 programvare (SAS Institute, Cary, NC). (D) Effekt av MT19c i en syngen EOC-modell i rotter. Fisher 344 rotter (3 dyr /behandlingsgruppen) ble injisert IP med rotte EOC celler Nutu-19. Etter 3 uker ble enten MT19c (100 eller 500 pg /kg kroppsvekt) eller bærer injisert IP daglig i 12 dager. Tumorvev ble høstet og oment vekt (D-1), ascitisk volum (D-2) og kroppsvekt (D-3) registrert. Mean oment vekt og volum ble sammenlignet med t-test med ulike variasjoner. Det nedre panel viser responsen indeksen (D-4).
Som en uavhengig metode for å bestemme den anti-kreft-aktivitet av MT19c
in vivo
vi benyttet et veldefinert syngene rotte EOC modell [19] Fisher 344 rotter ble delt i to behandlingsgrupper på 3 dyr hver og en kontrollgruppe. Nuţu-19 rotte EOC celler ble injisert IP. Etter 3 uker, ble enten 0,1 eller 0,5 mg MT19c /kg bwt eller kjøretøy injisert IP daglig. Et gjennomsnitt på 22 ml bukvæske ble samlet inn i kontrolldyrene ved studieslutt (Fig. 1D, ascites volum). Flere små tumorer (0,1-1,5 cm i diameter) ble observert på omentum, tarm, pessar, peritoneal vegg, og overflaten av alle andre abdominale organer. MT19c behandling doseavhengig redusert gjennomsnittlig ascites-dannelse ved 0,5 mg /kg bwt og undertrykket tumor nodul formasjonen. Tilsvarende MT19c behandling doseavhengig redusert gjennomsnittlig omental vekt (Fig. 1D). I denne studien ble det benyttet en meget lav dose av MT19c sammenlignet med den akutte toksisitetsstudie (400 mg /kg kroppsvekt) eller den ovenfor angitte mus xenograft modell og langtidstoksisitetsstudie (5 mg /kg bwt; 10 x større). Bemerkelsesverdig, ved en dose på 0,5 mg MT19c /kg bwt alle 3 dyrene behandlet viste tumorregresjon (fig. 1D, respons indeks). Ett dyr viste en fullstendig respons. Animal vekter i både kontroll- og behandlingsgrupper økte i dette forsøket (Fig. 1 D).
MT19c effekt på serumkalsiumnivåer og toksisitetsstudier i dyremodeller
Foreløpig kjent Calcitriol /vitamin-D3-analoger forårsake hyperkalsemi. Vi undersøkte derfor om MT19c kan føre til hyperkalsemi hos dyr til tross for endrede A-ring konformasjon. I dyr, gjorde MT19c ikke forårsake hyperkalsemi under 35days av dyr rettssak. Calcitriol viste signifikant høyere serumkalsiumnivå (15,5 mg /dl) ved slutten av behandlingen enn MT19c behandlet mus (~ 10 mg /dL) som var nærmere kalsiumnivåer i kontrollgruppen (p 0,05) (Fig. 2A).
(A) serumkalsiumnivåer i mus etter MT19c behandling. 8 mus hver ble behandlet med MT19c (5 mg /kg kroppsvekt) eller kalsitriol (10 ug /kg kroppsvekt) eller bærer (EtOH) i 35 dager, blod oppsamlet og serumkalsium analysert på dag 35. Endring i gjennomsnittlig serum kalsium var signifikant ( P 0,05) sammenlignet mellom grupper ved t-test med ulike avvik (B) Akutt giftighet studie av MT19c. MT19c eller vehikkel ble administrert til nakne mus, og dyrene ble overvåket i enhver observerbar toksisitet. (C) MT19c i en VDR-agonist eller antagonist screening. VDR-over-uttrykker VDR-UAS-bla HEK 293T celler ble behandlet i 5 timer med kalsitriol /vitamin-D3 (12:01-1 nM, venstre panel) eller MT19c (1 nM-1 mikrometer; midtre panelet) og VDR-aktivering ble analysert. Å analysere antagonistiske effekter analysen ble utført (SelectScreen® Cell-baserte Nuclear Receptor Profilering Services: https://www.invitrogen.com) etter celle stimulering med kalsitriol /vitamin-D3 (120 pM) og behandling med MT19c (1 nM -1 uM, høyre panel;) i 5 timer. (D) Oppsummering av fremtredende trekk ved MT19c og relaterte forbindelser. Sammenligning av MT19c med å kalsitriol og andre klinisk relevante vitamin-D-derivater.
En akutt giftighet studie for å fastslå sikkerheten MT19c ble utført av National Cancer Institute (NCI) i atymiske nakne mus. MT19c ble administrert intraperitonealt (IP) i doser på 400, 200, ble 100 mg /kg bwt (en dyr /dose), og dyrene overvåkes i en periode på 13 dager (Fig. 2B) for å ta opp enhver observerbar toksisitet (se Hjelpemiddel Informasjon S1) . MT19c viste ingen toksisitet ved en av tre doser som ble testet. Akutt toksisitet måler konsentrasjonen som vil påvirke dyrenes helse, og letalitet er den mest vanlige endepunktet.
MT19c påvirker ikke VDR transkripsjon i celler
MT19c viste en svak antagonistisk virkning i en fluorescens polarisasjon analyse ved hjelp av VDR ligandbindende domene og et fluorescens-merkede peptid coactivator [20]. For å bestemme transcriptional regulering av VDR i cellene ved MT19c behandling vi ansatt en cellebasert funksjonell-VDR-reporter analysen (GeneBLAzer® Technology, www.invitrogen.com) ved hjelp omgjort HEK293 celler (se Hjelpemiddel Informasjon S1). Disse HEK293T celler uttrykker et fusjonsprotein av VDR-LBD-GAL4 DNA-bindende domene, som aktiveres av calcitriol og induserer transkripsjon av et beta-laktamase-reportergen. Den transkripsjonelle aktivering av VDR i nærvær av MT19c ble bestemt etter 5 timers forbehandling med kontroll calcitriol (0,1 PM-1 nM) (figur 2C;. Venstre panel). Eller MT19c (1 nM-1 uM) (fig 2C midtre panelet). Calcitriol forårsaket VDR-aktivering ved 22:00 (IC
50~30 PM). MT19c viste ingen agonistisk aktivitet i de konsentrasjonene som ble testet. For å analysere antagonistiske effekter, ble celler stimulert med kalsitriol (120 pM) ble behandlet med MT19c (1 nM-50 uM) (figur 2C;. Høyre panel) i 5 timer. MT19c hemmet kalsitriol-indusert VDR-aktivering bare ved relativt høye konsentrasjoner (IC
50~30 mm). Dermed MT19c dukket opp som en ekstremt svak VDR antagonist når ikke biologisk betydning. MT19c er omtrent 1000 ganger mindre potent VDR antagonist enn TEI-9647 eller ZK159222 [21].
Molecular Docking Simulering (MDS) av VDR og MT19c samhandling
Mesteparten av tiden er kjent kalsitriol /vitamin D3-analoger er VDR-agonister. For molekylær innsikt i en mulig interaksjon mellom MT19c med VDR vi ansatt en MDS basert på strukturen i MT19c og VDR liganded til kalsitriol (PDB ID: 1DB1) [22] utnytte Autodock 4.0 programmet [23]. Mulige protein-ligand-kompleksene ble valgt basert på deres bindings fri-energi og konformasjonen med lavest energi forankret ble valgt som en mulig kandidat for MT19c /VDR interaksjon. Fig. 3A viser MDS for VDR og kalsitriol (venstre panel) eller MT19c (høyre panel). I bindingslommen av VDR, ble de rester som er i kontakt med calcitriol anvendt som en referanse (Fig. 3B) og for MT19c de samme rester ble valgt for å karakterisere interaksjoner. Vi observerte at MT19c kjøpt en omvendt overnatting i VDR ligandbindende domene forhold til kalsitriol. MT19c er den første vitamin-D klasse av molekylet for å demonstrere dette unike VDR-LBD interaksjon. Up-side innkvartering av MT19c i VDR-LBD var svært følge at funksjonshemmede den klassiske kalsitriol-VDR lignende interaksjoner som definerer de genomiske funksjoner av vitamin-D. Videre, nøkkelen plass mellom spiralene 11 og 12 i den VDR ligand-bindende domene hvor kalsitriol eller antagonisten ZK168281 sidekjeden (C-25) bind (Fig. 3D, venstre panel) er okkupert av A-ringen av MT19c (Fig . 3D, panel til høyre). Interessant, MT19c avslørte en tettere hydrogen binding mellom dens karbonyl av A-ringen med VDR rest H397 (2,05 Å) (fig. 3E, høyre panel) sammenlignet med den 25-hydroksygruppen av kalsitriol (2,8 Å) (Fig. 3E , venstre panel). Flere effekter som er beskrevet ovenfor, inkludert den forstørrede endret A-ringstruktur av MT19c som forstyrret den naturlige konformasjon av spiralene 11,12 og 13 på snudd oppføring i VDR-LBD, biologisk irrelevante interaksjoner med 15 nøkkelaminosyrerester VDR-LBD, og forvrengning i helikser 11, 12 og 13 som gjør at VDR-coactivator interaksjoner kan forklare hvorfor MT19c er ikke-hypercalcemic i dyr [21].
(A) 3D strukturer av VDR /kalsitriol og VDR /MT19c komplekser.
Venstre panel:
VDR /kalsitriol kompleks (Calcitriol i sentrum, helix 11 = hvit farge).
Høyre panel:
VDR /MT19c kompleks (MT19c i sentrum, 11 = lys grønn). MDS ble utført ved bruk av Autodock 4,0 program med strukturen for MT19 og av kalsitriol-liganded VDR levert av Protein Data Bank. Bilder av strukturer ble generert ved hjelp UCSF Chimera. (B) Sekvens av VDR ligand binding nettstedet. Gul farge-kode representerer helikser i strukturen. Grønn fargekode representerer aminosyrer med direkte interaksjon med ligand (kalsitriol). (C) Interaksjon sammenligning.
Venstre panel:
Samspill mellom Leu227 og kalsitriol.
Høyre Panel:
Samspill mellom Leu227 og MT19c. (D) Sammenligning av helix 12 og helix 11 interaksjoner med ligander.
Venstre panel:
Samspill mellom helix 11 (lilla), helix 12 (gul), og kalsitriol.
Høyre Panel:
Samspill mellom helix 11 (hvit), helix 12 (gul) og MT19c. I begge paneler samspillet mellom His397 på helix 11 og ligand er avbildet. (E) Avstander mellom hans 397 og ligander.
Venstre panel:
Samspill mellom His397 og kalsitriol.
Høyre Panel.
Samspill mellom His397 og MT19c
MT19c hemmer EGFR signaliserer både in vitro og in vivo, men påvirker ikke PPAR-gamma uttrykk
For å identifisere de molekylære mål av MT19c i eggstokkreft celler, en Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) analyse av genomet brede mRNA kjøretøy behandlet (kontroll) og MT19c behandlet svulster på dag-8, dag-16 og dag 30 ble gjennomført i tre paralleller ved hjelp av Affymetrix Menneskelig Gene 1,0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Uttrykket data har blitt deponert på adressen www.ncbi.nlm.nih.gov (acc = GSE23616). MT19C behandlet xenografttumorer konsekvent viste lavere uttrykk nivåer for gener som er involvert i energiomsetningen (p ,00000000055). Basert på uttrykket nivåer med høyere statistisk signifikans (p = 0,00000005; cutoff point), gruppert vi viktige metabolske gener som ble rammet av en Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA). Differensial ekspresjon av EGFR, PI3K, PRKAA2, THRSP, SREBF1, malonyl Co-A karboksylase, acetyl CoA karboksylase og Fettsyre syntase i kontroll- og behandlingsgruppe på dag-8, dag 16 og dag 30 er vist i fig. 4A.
(A) Genomisk analyse av naive eller MT19c behandlet xenografttumorer. SKOV-3-xenotransplantater ble behandlet med bærer eller MT19c (5 mg /kg kroppsvekt) og tumorvev ble høstet på dag 8, 16 og 30. Den mRNA fra tumorer ble analysert ved Affymetrix microarray chips i triplikat og ekspresjon av gener ble gruppert etter GSEA analyse. Forskjellen i ekspresjon av genene fra MT19c behandlede tumorer ble uttrykt i% av kontrollen (±). (B) uttrykk for atom EGFR (nEGFR) i Skov-3 xenograft vev behandlet med kjøretøy eller MT19c. SKOV-3-xenotransplantater ble behandlet med MT19c eller kjøretøy. Parafin innebygd vev ble behandlet og farget med Alexafluor-konjugert fosfor-EGFR antistoff og analysert ved konfokalmikroskopi som beskrevet i Materiale og metode delen. EGFR er vist i det grønne sammen med atom flekk DAPI. Forstørrelse: 40 × 2 (C) Western blot analyse av fosfor-EGFR og fosfor-PI-3K og uttrykk for kjernefysisk EGFR (nEGFR) i Skov-3 celler. (Venstre panel): Skov-3 celler ble behandlet med 250 nM MT19c. PAGE og Western blot analyse av cellelysatene ble utført. Aktivert fosfor-EGFR og fosfor-PI-3K ble visualisert ved immunoblotting hjelp primære antistoffer som gjenkjenner spaltes fragmenter. Som en indre standard for lik belastning (50 ug totalcelleprotein /kjørefelt) Blottene ble probet med en (-tubulin antistoff (høyre panel). Ekspresjon av kjerne EGFR (nEGFR) i kjøretøy (øvre panel), kalsitriol (2 uM, midtre panelet) og MT19c (250 nM, nedre panel) behandlet Skov-3 celler ved immunfluorescens mikros EGFR er vist i grønne og høyre kolonne viser DNA (blå) Forstørrelse:.. 40. (D) MT19c trykt PI-3K kinase aktivitet i SKOV-3-celler. SKOV-3-celler ble behandlet med MT19c (0, 250 nM) for angitte tidsintervaller. Cellelysater ble immunoutfelt med et antistoff som er spesifikt for fosfo-tyrosin og PI3K-aktivitet ble bestemt ved in vitro lipid-kinase-analyse. PIP . 3 (phosphoinositide 3-fosfat), den fosforylert sluttproduktet er vist baren grafen viser densitometriske skanning resultatene av en representant eksperimentet (E):.. Identifisering av samspillet mellom MT19c og PPARy med fluorescens polarisering Forstyrrelse av binding mellom PPARγ- LBD og fluorescerende DRIP2 peptid ved MT19c ble undersøkt i ▪ tilstedeværelse og • fravær av agonist GW929. Kontrollene var bilen DMSO (▴ med agonist, ○ uten agonist), ▾ umerket DRIP2 peptid (positiv kontroll) og ♦ fluorescerende DRIP2 peptid av seg selv (positiv kontroll).
Kreftceller organisere energibehovet ved snu lipogenic /lipolytic stoffskiftebalanse for å sørge for og opprettholde kreft vekst ved å redefinere funksjoner av EGFR, PPAR-gamma, og syntesen av fettsyrer og glykolyse maskiner [24]. Målretting EGFR og andre komponenter i metabolismen har derfor postulert til å forbedre eggstokkkreftterapi utfall [6], [25]. For å forstå effekten av MT19c på EGFR og dens nedstrøms signalkaskade i eggstokkreft, undersøkte vi effekten av MT19c på EGFR og PI-3kinase aktivitet i Skov-3 celler ved western blot analyse, mikroskopi og en
in vitro
PI-3kinase aktivitetsanalyse.
Gene uttrykk (GSEA) analyse viste at MT19c trykt EGFR uttrykk i svulster behandlet på dag-8. Videre svulster behandlet opp til dag-30 viste signifikant nedregulering av EGFR mens mindre aktivering av EGFR i svulster behandlet opp til dag-16 indikerer counter innsats mot narkotika handling ble observert (Fig. 5A). Deretter validert vi microarray data på EGFR ved immunohistokjemisk analyse av behandlede SKOV-3-xenografter som ble behandlet med bærer eller MT19c (5 mg /kg kroppsvekt). Lysbildene av snap frosne høstet svulster fra kjøretøyet eller legemiddelbehandlede dyr i fig. 1B ble immuno-farget med et FITC-EGFR-antistoff (R (Midtre panel): retensjonstid på malonyl CoA i kjøretøyet behandlede Skov-3 celler; (Høyre panel): oppholdstid på malonyl CoA i MT19c (500 nM) behandlet Skov-3 celler
For å studere den funksjonelle effekten av MT19c på EGF reseptor uttrykk i eggstokkreft celler vi undersøkt EGFR. lokalisering i Skov-3 celler
in vitro
ved behandling med MT19c. SKOV-3-celler ble behandlet med MT19c (100 nM) eller kalsitriol (2 uM) i 12 timer i serumfrie forhold. Cellene ble behandlet som beskrevet i Materialer og metode, avsnitt. En mikroskopisk undersøkelse av kjøretøyet behandlede celler viste klart og intakt celle morfologi med trans EGFR flekker i selskap med noen kjerner tett farget (fig. 4C, øvre venstre panel). En DAPI farging viste også intakte strukturelle integriteten av DNA og kromatin (Fig. 4C, panel øverst til høyre). I motsetning til kjøretøy, Calcitriol behandlede celler viste svært intens og spesifikk nukleær farging grunn av atom translocalization og demonstrert manglende trans farging (fig. 4C, midtre paneler). På den annen side, i motsetning til kalsitriol, MT19c behandling ikke fremme EGFR atom translocalization og en sterk transmembrane EGFR farging mellom cellepopulasjon som ligner på bærerbehandlede celler ble observert (fig. 4C, nedre paneler). Noen atomkjerner med tett atom flekken i MT19c behandlet cellepopulasjonen, faktisk, var minner om apoptose enn kjernefysisk translokasjon. Det ble bemerket at xenografttumorer viste sterkere cytosoliske farging enn transmembranfarging observeres for dyrkede SKOV-3 eggstokk-kreft celler, muligens indikerer differanse tumor mikro-miljø i både type celler (Fig. 4B og 4C). En western blot analyse av narkotika behandlet Skov-3 celler viste at MT19c trykt EGFR aktivering innen 12 timer med behandling (fig. 4C, venstre panel).
Siden EGFR direkte regulerer mange kritiske funksjoner av PI-3kinase [ ,,,0],5], for å analysere PI-3kinase aktivitet i Skov-3 celler på begjæring fra MT19c (250 nM) vi utført en PI-3kinase aktivitet [26]. Den PI3-kinase (PI3K) pathway regulerer mange cellulære prosesser som celle metabolisme, celleoverlevelse, og apoptose i kreft og phosphotidylionositol-3,4,5-trifosfat (PIP-3) er nøkkelen formidler av PI-3kinse signaltransduksjon [ ,,,0],27]. PIP-3 er syntetisert fra phosphotidylionositol-4,5-difosfat (PIP-2) [28]. Basert på vår immunoprecipitation analysen, observerte vi at MT19c behandling (250 nM) downregulated PIP-3 produksjonen betydelig i løpet av 12 timer sammenlignet med kontrollgruppen (Fig. 4D). Pikseltetthet måling av laster flekk som representerer PIP-3 mengde av kontroll lysatet ble eluert via tynnsjiktskromatografi (TLC) var 14480 enheter, mens den MT19c behandlede prøve viste ni ganger mindre kvantitativ syntese av PIP-3 (pikseltetthet 1304) (fig. 4D, nedre panel). Overraskende, PIP-3-produksjon ble sterkt oppregulert 2-ganger i løpet av første 3 timer etter behandling indikerer pro-overlevelse trykk ved tilførsel av medikamentet. For ytterligere å forstå virkningen av MT19c på ekspresjonen av PI-3kinase, ble et Western blot utført. MT19c (250 nM) behandling viste nedregulering av PI-3kinase fosforylering i Skov-3 celler innen 12 timer, (fig. 4C, venstre panel).
MT19c påvirker ikke PPAR-gamma komponent i fettmetabolismen i eggstokkene kreftceller
EGFR overekspresjon aktiverer PPAR-gamma-funksjonen i kreftceller for å beskytte dem mot palmitat toksisitet [24]. PPAR-gamma er et mulig mål for forebyggelse og behandling av kreft [29]. Vi undersøkte samspillet av MT19c med kjernefysisk reseptor PPAR-gamma ved å gjennomføre en fluorescens polarisering analysen. I fravær av PPAR-gamma agonist (GW949) har vi ikke observert en interaksjon mellom PPARy og coactivator protein DRIP2. Tilsvarende, i nærvær av agonist GW949 ble observert noen avbrudd av samspillet mellom VDR og DRIP2.
MT19c trykkes Fettsyre syntase uttrykk i xenografttumorer
EGFR /PI-3Kinase øker lipogenese i kreft celler ved aktivering lipogenic fettsyre syntase (FASN) maskiner i forbindelse med PPAR γ [5]. Overekspresjon av FASN i human epitelial kreft i eggstokkene (EOC) har blitt vist [7] – [10]. En oligonukleotid-mikromatriser skjerm identifisert fettsyre syntase (FASN) som potensielt molekylære mål i EOC [17]. Genome-wide mRNA analyse av naive og MT19c behandlet xenografttumorer klart identifisert MT19c handling på FASN uttrykk i MT19c behandlet eggstokkreft xenograft (p = 0,00000000055) (fig. 4A) [30].
Vi har observert via immunoblotting at MT19c behandling undertrykket ekspresjon av FASN og acetyl Co-A-karboksylase (ACC) i SKOV-3-celler (fig. 5A) tidsavhengig. Vi undersøkte om MT19c regulerer FASN og ACC i behandlede xenografttumorer. Høstet xenografter av naive og MT19c behandlingsgruppene ble immuno-farget med FASN antistoff og analysert ved fluorescens mikroskopi for å skille FASN flekker i kontrollgruppen versus behandlingsgruppen. Mens kjøretøy behandlet svulster viste intens og homogen flekker rundt lipid dråper innebygd i vev (Fig. 5D, venstre øvre panel), MT19c behandlet svulster viste betydelig mangel på flekker eller delvis /gjenværende flekker (Fig. 5E, høyre øvre panel). Vi har observert at nærvær av 2 fettstoffer felt i det hele vev delen som ble tett farget i kontrollen. På tilsvarende måte bare to fett feltene ble detektert i medikamentbehandlet xenograft-delen og den FASN farving rundt dem var signifikant lavere enn kjøretøy-behandlede kontroll vev. Vi har utført den fluorescens-intensitet målinger av hele vev deler av både kontroll- og medikamentbehandlet vev og beregnet middelverdi og Integrated Optical Density (IOD). Som vist på fig. Fig.
