Abstract
Kolon microbiota gjære ikke-absorbert kostfiber å produsere uhyre mengder av kortkjedede fettsyrer (SCFAs) som gagner verten gjennom et mylder av metabolske, trofiske, og chemopreventative effekter. De chemopreventative virkningene av SCFA butyrat er delvis mediert ved induksjon av p21-genekspresjon. I denne studien, vurderte vi rollen som mikroRNA (miRNA) i smørsyre er induksjon av p21 uttrykk. Uttrykket profiler av mirnas i HCT-116 celler og i humane sporadiske tykktarm kreft ble vurdert av microarray og kvantitativ PCR. Regulering av p21 genuttrykk av MIR-106b ble vurdert ved 3 «UTR luciferase reporter analyser og transfeksjon av spesifikke miRNA etterligner. Butyrat endret ekspresjon av 44 mirnas i HCT-116-celler, hvorav mange var avvikende uttrykt i kolon kreft vev. Medlemmer av MIR-106b familie ble redusert i det tidligere og økt i det siste. Smørsyre-indusert p21 protein uttrykk ble dempet ved behandling med en MIR-106b ligne. Muterte p21 3’UTR-reporter konstruerer uttrykt i HCT-116 celler bekreftet direkte MIR-106b målgruppe. Butyrat redusert HCT-116 proliferasjon, en effekt reverseres med tillegg av MIR-106b etterligne. Vi konkluderer med at mikrobe-avledet SCFAs regulere vert genuttrykk involvert i intestinal homeostase samt kreftutvikling gjennom modulering av miRNAs
Citation. Hu S, Dong TS, Dalal SR, Wu F, Bissonnette M, Kwon JH, et al. (2011) The mikrobe-Avledet Short Chain Fatty Acid Smørsyre Targets miRNA-Dependent p21 Gene Expression i Human tykktarmskreft. PLoS ONE 6 (1): e16221. doi: 10,1371 /journal.pone.0016221
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 23 august 2010; Godkjent: 16 desember 2010; Publisert: 20 januar 2011
Copyright: © 2011 Hu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra human mikrobiomer Project (DK083993, HG004858), R37 DK47722 (EBC), K08 DK078046 (JHK), Digestive Disease Forskning Kjerne Senter DK-42086 ved University of Chicago, og mage-tarm Research Foundation Associates «Board (SRD). Traineer ble støttet av en Stipendiat Award fra Crohns og Foundation kolitt of America (SH), T35 DK62719 (TSD), og T32 DK07074 (SRD). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
De fleste menneskelige sporadiske tykktarm kreft utvikles gradvis som akkumuleres endringer i genuttrykk forvandle normal kolonepitelet til adenokarsinom. Denne prosessen innebærer et samspill mellom genetiske og miljømessige faktorer, sistnevnte støttes av epidemiologiske sammenhengen mellom økt forekomst av kolorektal kreft og faktorer som økt levetid, eksponering av kreftfremkallende, og dietter i høyt industrialiserte land [1]. Blant de foreslåtte diettrisikofaktorene er lavt fiberinnhold, noe som kan redusere biotilgjengeligheten av kortkjedet fettsyrer (SCFAs) som er dannet ved mikrobiell anaerob fermentering av kostfiber [2]. Disse fettsyrene slik som acetat, propionat, butyrat og er produsert i uhyre mengder, og er de mest tallrike anioner i colonic luminal væske og avføring [3]. Disse mikrobiell produkter ikke bare gi en viktig kilde til energi for å kolonepitelet, men har også omfattende trofiske effekter som inkluderer regulering av verts gener involvert i vedlikehold av intestinal homeostase [4].
I udifferensiert, svært proliferative ondartet celler, hemmer proliferasjon butyrat og induserer differensiering gjennom en rekke mekanismer, inkludert endringer i DNA-metylering, selektiv hemning av histon-fosforylering og histon deacetylering (HDAC), og modulering av intracellulær signalerings kinase [5] – [7]. I en human colonic epithelial cellelinje (HT29), ble 221 butyrat responsive gener involvert i proliferasjon, differensiering og apoptose identifisert [6]. Blant de gener endret ved butyrat behandling ble mange involvert i cellesyklusregulering, slik som cyklinavhengig kinase inhibitor p21, GADD45A, og PTEN [6].
Under normale forhold, proliferasjon er strengt regulert ved virkningen av cykliner, cyklinavhengige kinaser (CDK) og CDK-inhibitorer som regulerer overgangene fra G1 til S-fasen og G2 til mitose og fungerer som kontrollpunkter for å forhindre replikasjon hvis DNA er skadet [8]. Som reaksjon på signaler som indikerer DNA-skade, p21 og p27 bindes til cyklin-CDK-komplekser og indusere cellesyklusrest [8], [9]. Imidlertid, i cancer, denne regulert prosess med celledeling og vekst tapt. For eksempel, har tap av funksjon av G1 sjekkpunkt cyclin avhengig kinase inhibitor p21 vært knyttet til kreftutvikling og p21 tap er observert i 79% av tykktarmskreftsvulster ved immunhistokjemi [10], [11].
butyrate induserer p21-genet transkripsjon via en p53 uavhengig vei som involverer ikke-kompetitiv inhibering av HDAC [12] – [14]. Imidlertid er muligheten for at noen av butyrat handlinger på p21-genekspresjon kan bli formidlet gjennom miRNA avhengig translasjonelle mekanismer har ikke tidligere blitt utforsket. HDAC-inhibitorer er nylig blitt studert som en ny gruppe av anticancer epigenetiske behandlingsverktøy, og en HDAC-inhibitor, suberoylanilide hydroksamsyre (Saha), er FDA-godkjent for behandling av kutan T-cellelymfom [15]. Videre har HDAC-inhibitorer vært implisert i regulering miRNA i flere typer av maligniteter. Behandling av brystkreft cellelinje SKBR3 med hydroxaminsyren HDAC hemmer LAQ824 ført til betydelige endringer i ~40% av cellens uttrykt mirnas [16]. Saha behandling av det humane lunge carcinoma cellelinje A549 ført til betydelige endringer i ekspresjonen av 64 mirnas [17]. Påvirkningen av HDAC hemmer og mikrobiell produkt smørsyre på miRNA uttrykket i tykktarm kreft vev er ikke undersøkt.
mirnas er ~22 nucleotide, ikke-kodende RNA som spiller en viktig rolle i å regulere celleproliferasjon, apoptose, og differensiering [18]. Mer enn 1000 mennesker mirnas har blitt identifisert, og de fleste er antatt å målrette hundrevis av gener [19]. Feilregulering av miRNA uttrykket kan bidra til kreftutvikling ved å øke proto-onkogen uttrykk eller ned-regulerer tumor dempere [20]. For eksempel mirnas regulere mange viktige proteiner i signalveier av tykktarmskreft, f.eks Mir-106b familien reduserer p21 uttrykk og påvirker cellesyklusprogresjon [21] – [23]. Blant MIR-106b spådd mål, stanse av p21 med siRNA tettest phenocopies MIR-106b gevinst på funksjon [22].
I denne studien hypotese vi at anti-kreft effekt av mikroben avledet SCFA butyrate kan være mediert delvis via endringer i miRNA uttrykk. Vi utførte miRNA microarray studier på humane tarmkreft HCT-116 celler behandlet med smørsyre og funnet signifikante endringer i miRNA profiler, inkludert redusert uttrykk av MIR-106b familien. miRNA microarray analyse av sporadisk-type menneske tykktarm kreft funnet økt uttrykk av Mir-106b familien. Butyrat ble funnet å indusere p21-ekspresjon, som var assosiert med en signifikant reduksjon i celleformering. Tillegg av en MIR-106b ligne reversert den økte p21 uttrykk og redusert celleproliferasjon indusert av smørsyre. Disse funnene har avdekket en unik mekanisme for mikrobiell interaksjon med verts genuttrykk som innebærer endringer av miRNA profiler for å begrense celle sykling og hemme kreft i tykktarmen celleproliferasjon.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Operasjon menneskelige colonic biopsier ble innhentet fra tykktarmskreftpasienter ved University of Chicago Medical Center under en protokoll godkjent av Institutional Review Board. Skriftlig informert samtykke ble innhentet før innsamling av vevsprøver. Alle kliniske undersøkelser ved hjelp av menneskelig fag ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen.
Cell Kultur
Menneske HCT-116 tykktarm kreft celler ble kjøpt fra ATCC. Celler ble dyrket ved 37 ° C i høy glukose DMEM-medium (Invitrogen) inneholdende 10% (volum /volum) føtalt bovint serum, 50 ug /ml L-glutamat, 50 ug /ml streptomycin, og 50 U /ml penicillin. Celler ble behandlet med 1-2 mM butyrat i 24 til 48 timer før høsting for hver enkelt analyse. Cellene ble skylt to ganger og skrapet inn i is-kald fosfat-bufret saltvann (PBS), pelletert (14 000 g x 20 sek), og deretter lysert for RNA og proteinutvinning.
Menneskelige colonic biopsier
Operasjon human colonic biopsier fra tumorvev og omgivende normal vises i kolon mukosa (minst 5 cm tumor grensen) ble oppnådd ved en tykk- kirurg. Etter fjerning, ble biopsier øyeblikkelig plassert på is og skylt i iskald PBS før cellelyse for RNA-ekstraksjon.
miRNA microarray
Total RNA ble ekstrahert fra HCT-116-celler og human colonic vevsprøver ved hjelp av Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion) i henhold til produsentens protokoll. HCT-116 celle miRNA ble analysert ved hjelp av miRCURY LNA ™ microarray v.11.0 (Exiqon) som inneholder oppfangingsprober rettet mot alle mirnas for human, mus eller rotte registrert i miRBase versjon 13 på Sanger Institute. Alle prøver ble slått sammen for å lage en felles referanse. En mikrogram total RNA fra hver prøve og samlet felles referanse var merket med miRCURY ™ LNA Array makt merking kit (Exiqon, Danmark). Den Hy3 ™ -merket prøver og en Hy5 ™ -merket henvisning RNA prøve ble blandet parvis og hybridisert til miRCURY ™ LNA arrays. Microarray lysbilder ble skannet med Agilent G2565BA Microarray Scanner System (Agilent Technologies, Inc., USA) og bildeanalyse ble utført ved hjelp av Imagene 8.0-programvaren (BioDiscovery, Inc., USA). De kvantifiserte signalene ble bakgrunn korrigert (Normexp med offset verdi 10) og normalisert ved hjelp av den globale Lowess (lokalt Vektet scatterplot Smoothing) regresjonsalgoritmen [24]. Dataene er uttrykt som normaliserte log2 transform Hy3 /Hy5-forhold.
På en lignende måte ble det humane tarmvev mirnas analysert ved hjelp av Mirvana miRNA Bioarrays V.2 (Ambion), som benytter versjon 8.0 av miRBase sekvens database. Prøvene ble merket med Mirvana miRNA merking kit og hybridisert til miRNA bioarrays per produsentens instruksjoner. Arrays ble skannet med GenePix4000B i University of Chicago Funksjonell genomforskning Kjerne Facility. I alt 12 miRNA profiler ble samlet inn 6 sammenkoblede colonic vevsprøver.
Real-time PCR for mirnas
Total RNA ble ekstrahert fra pelleterte HCT-116 celler ved Trizol (Invitrogen, Grand Island , NY) i henhold til produsentens instruksjoner. Komplementær DNA ble syntetisert fra total RNA prøver ekstrahert fra HCT-116 celler eller menneskelige kolon vev ved hjelp av NCode ™ miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen). Real-time PCR ble utført med en iCycler (Bio-Rad) bruker iQSYBR Grønn PCR SuperMix (Bio-Rad) med miRNA spesifikke primere og en universell qPCR primer i henhold til produsentens protokoll for NCode Kit (tabell S1). De to-trinns kvantifisering sykling-protokollen (45 sykluser av 95 ° C i 15 sekunder, og deretter 60 ° C i 15 sekunder) ble anvendt. Den Ct-verdien er definert som den syklusen nummeret som fluorescensen krysser en fast terskel over grunnlinjen. En liten nukleolært RNA, RNU48, ble målt som endogent kontroll [25]. For en relativ kvantifisering, ble fold endringer målt ved hjelp av ΔΔCt metoden. For hver prøve ble Ct verdien av hver miRNA målt og sammenlignet med RNU48 som ΔCt, (ΔCt = Ct
miRNA – Ct
RNU48). Fold endring av miRNA i eksperimentelle prøver i forhold til kontrollprøver ble bestemt av to
-ΔΔCT, hvor ΔΔCt = ΔCt
Unknown -ΔCt
Kontroll [26]
.
Fast -time PCR for p21 mRNA
Total RNA ble ekstrahert fra pelleterte HCT-116 celler med Trizol. Komplementært DNA ble syntetisert ved anvendelse av Superscript III (Invitrogen) og en tilfeldig hexonucleotide primer. Deteksjons og antisens primere for p21 (CDKN1A, NM_000389.3) er: 5′-TCACTGTCTTGTACCCTTGTGCTT-3 «og 5′- AGAAATCTGTCATGCTGGTCTGCC-3′; for GAPDH: 5»-GGCAAATTCAACGGCACAGT-3 «og 5′-AGATGGTGATGGGCTTCCC-3». Real-time PCR ble utført med en iCycler hjelp iQSYBR Grønn PCR SuperMix (Bio-Rad). For hver prøve ble Ct verdien av p21 mRNA målt og sammenlignet med GAPDH endogen kontroll som ΔCt, (ΔCt = Ct
p21 – Ct
GAPDH). Den ganger endring av miRNA i eksperimentelle prøver i forhold til kontrollprøvene, ble bestemt ved to
-ΔΔCT.
Western Blot
Pelleterte HCT-116 celler ble homogenisert i 10 mM Tris, pH 7,4 , 5 mM MgCl
2, fullstendig protease inhibitor cocktail (Roche Molecular Biochemicals), 50 U /ml DNAse (Amersham), og 50 U /ml RNAse (Ambion). Protein ble kvantifisert ved hjelp av bicinchoninic syre metoden. Protein ble solubolized i 3X Laemmli stopp oppløsning ved oppvarming til 65 ° C i 10 minutter.
Tyve mikrogram proteinprøver ble separert ved SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner i 25 mM Tris, pH 8,8 ; 192 mM glycin; 15% vol /vol metanol. Membranene ble blokkert med 5% vekt /volum fettfri tørrmelk i tween-tris-bufret saltløsning (TTBS). Primære antistoffer spesifikke for p21 (BD Biovitenskap), Hsc70 (SPA815, Stressgen) og β-aktin (Cell Signaling), ble tilsatt og inkubert over natten ved 4 ° C. Membranene ble vasket med TTBS, inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert arts passende sekundære antistoffer (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) i 1 time ved romtemperatur, og utviklet ved hjelp av et forbedret kjemiluminescens system (Supersignal, Pierce, Rockford, IL).
Kvantifisering av bilder ble gjort ved å skanne densitometry hjelp NIH Image J 1,54 programvare (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).
Cell Proliferation Assay
Celleproliferering ble målt ved hjelp av WST-1 reagens (Roche Applied Science) i henhold til produsentens protokoll. HCT-116-celler ble dyrket på en 96 brønners flatbunnet plate. Etter å ha nådd 50% sammenflyting ble brønnene behandlet med den angitte konsentrasjon av butyrat i 24 timer. Platene ble avlest på en mikroplateleser ved 450 nm før og 45 minutter etter at WST-1 reagens. Referanse bølgelengde var 650 nm. Celleproliferasjon prisene ble beregnet i henhold til produsentens protokoll.
Cell transfeksjon med miRNA
Transit-LT1 (Mirus, WI) transfeksjon reagens ble brukt til å transfektere HCT-116 celler med en konstruert speil 106B (Ambion Pre-mir Mirna forløpermolekyler) i henhold til produsentens protokoll. En kontroll miRNA (MIR-C), med identisk GC-innhold, men ingen sekvenshomologi med MIR-106b, ble anvendt som en kontroll. Cellene ble transfektert i 48 timer før høsting.
luciferaserapportørplasmid Analyser
Modifisert pGL3 konstruerer med p21 3’UTR nedstrøms ildflue luciferase kodende sekvens ble en generøs gave fra Dr. V. Narry Kim ved Institutt for biologi, Seoul National University [27]. Seks timer etter smørsyre behandling, ble HCT-116 celler transient transfektert med modifiserte pGL3 konstruerer og PRL-TK plasmider (Renilla luciferasepreparater drevet av tymidin kinase promoter, E2241, Promega) ved hjelp av Transit LT-en transfeksjon reagens. Cellene ble høstet ved rysting i 500 ul lyseringsbuffer (Promega). Firefly og
Renilla
luciferasepreparater aktiviteter i lysat ble bestemt i tre eksemplarer med en Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem, i henhold til produsentens instruksjoner (Promega). Firefly luciferase aktiviteten ble normalisert til
Renilla
luciferase aktivitet.
Statistical Analysis
Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM til angitt antall forsøk. Resultatene av flere eksperimenter ble analysert ved t-test eller ANOVA bruker Bonferroni korreksjon for multiple sammenligninger.
For miRNA arrays, en to-tailed T-test beregnet mellom prøven og referansegrupper identifiseres mirnas med p -verdier lavere enn 0,05. Disse mirnas ble deretter valgt for videre studier med RT-PCR.
Resultater
Smørsyre endrer miRNA uttrykket i menneskelige tykktarmskreft HCT-116 celler, inkludert medlemmer av MIR-106b familie
for å studere effekter av smørsyre på miRNA uttrykket i colonic kreftceller, ble uttrykket profiler av mirnas i butyratproduserende behandlet HCT-116 celler målt ved hjelp av en microarray. Vehikkelbehandlede HCT-116 celler ble analysert som en kontroll. Førti-fire mirnas viste signifikante endringer i uttrykk som svar på smørsyre behandling. Endringene i uttrykket for 13 av de 26 mirnas at redusert og fem av de 18 mirnas at økt ble bekreftet ved hjelp av real-time, kvantitativ PCR (figur S1). Tretti-en av de 44 mirnas med endringer i uttrykket vises i varmen kartet på venstre panel i figur 1A. Flere medlemmer av MIR-17-92a, MIR-18b-106a, og MIR-25-106b klynger ble betydelig redusert som følge av smørsyre.
A) miRNA microarray-profiler ble utført på RNA hentet fra HCT- 116 celler behandlet med bærer eller 1 mM butyrat og humane tykktarm vev fra pasienter med sporadisk tykktarmskreft og tilstøtende normal-vises vev. Data ble normalisert ved hjelp av den globale Lowess regresjonsalgoritmen og er uttrykt som logaritmen med base 2 transformerte forhold av prøvesignalet til kontrollreferanse-bassenget signal. Varme kart er representert. Den røde fargen på kart varmen representerer økt ekspresjon i forhold til den sammenslåtte referansekontroll, og grønn representerer redusert ekspresjon i forhold til den samlede kontroll. Endringer i uttrykk av MIR-17 – 106b familie ble bekreftet ved real-time PCR i B) HCT-116 celler og C) menneskelige kolon vev. Resultatene er midler ± SE, n = 4. * indikerer p. 0,05 for prøven i forhold til kontroll
Expression nivåer av disse mirnas ble også vurdert i humane sporadiske tykktarm kreft og omkringliggende normale vises kolon ved microarray og vises i panelet i figur 1A høyre. De mirnas redusert i butyratproduserende behandlet HCT-116 celler ble dramatisk økning i tumorvev i forhold til normale kontroller. Mirs-17, ^ 20, -20b, -93, -106a -106b og var redusert som svar på butyrat behandling. Disse mirnas har samme frø region sekvens og dermed målrette de samme bindingsseter i 3’UTRs av målet mRNA. Ved hjelp av real time PCR, bekreftet vi at smørsyre nedregulert disse mirnas i HCT-116 celler (Figur 1b). Vi bekreftet også at disse mirnas var høyt over-uttrykt i humane tarmkreft prøver (figur 1C), noe som tyder på at noen anti-kreft effekt av smørsyre formidles ved å undertrykke de mirnas som er oppregulert i tykktarmskreft.
MIR -106b hemmer butyrat-indusert p21 protein ekspresjon
Tidligere undersøkelser viste at 3′-UTR av p21, som regulerer kreftcelleformering, inneholder to bindingsseter for MIR-17 – 106b frø sekvens (figur 2A) og hemmes av disse mirnas i ulike typer av kreft [gjennomgått i 13-15, 22]. Vi har derfor analysert virkningene av smørsyre og en MIR-106b ligne på p21 mRNA og proteinnivåer i HCT-116 celler. Som vist i figur 2B og 2C, butyrat økt p21-protein ekspresjon fire ganger etter 24 timers behandling. Et eksogent MIR-106b mimic fuktet butyrat-indusert p21-protein ekspresjon sammenlignet med celler behandlet med butyrat alene, mens tak miRNA molekylene hadde ingen effekt på p21 ekspresjon.
A) Skjematisk fremstilling av vanlige frø områder i mir-17 – 106b familie som målrette p21 3’UTR på to steder. HCT-116 celler ble behandlet med smørsyre (2 mm) eller kjøretøy og ble transfektert med MIR-106b etterligne eller kontroll miRNA (MIR-C) i 24 timer før innhøsting. B) Western blot for p21, β-aktin og Hsc70 vises, og er representative for 4 individuelle eksperimenter alle med lignende resultater. C) densitometry resultatene av Western blot av p21 normalisert p-aktin. D) p21 mRNA overflod ble analysert ved real-time PCR. Resultatene er midler ± SE, n = 4. * indikerer p 0,05 sammenlignet med basal. # Indikerer p 0,05 sammenlignet med kontroll
For å bestemme effekten av smørsyre og miRNAs på p21 genekspresjon, ble celle p21 mRNA nivåer målt ved real-time PCR (figur 2D).. Smørsyre induserte en 3,6 ganger økning i p21 mRNA abundancy. I kontrast, Mir-106b ligne hadde ingen effekt på p21 mRNA uttrykk.
Den 3’UTR av p21 formidler translasjonsforskning regulering av smørsyre og MIR-106b
For å undersøke effekten av speil 106b på translasjonell regulering av p21 ekspresjonen, HCT-116 celler ble transient transfektert med modifisert luciferase reporter-vektorer inneholdende enten villtype p21 3’UTR eller p21 3’UTRs inneholdende mutasjoner i enten en eller begge av MIR-106b bindingsseter (figur 3A). Ildflue luciferase-ekspresjon ble brukt for å vurdere cis regulering via p21 3 «UTR. PRL-TK vektor uttrykker Renilla luciferase var kotransfektert å kontrollere for transfeksjon effektivitet. Under basale forhold, mutasjoner i de enkelte MIR-106B target regioner i p21 3’UTR på nukleotider 468-474 og nukleotider 1148-1154 resulterte i en økning i luciferase aktivitet 28% og 26% henholdsvis (figur 3B). Videre er mutasjoner i både MIR-106B målregioner resulterte i en 57% økning i luciferase-aktivitet, noe som antyder at begge bindingssetene mediere miRNA inhibering av basal p21-ekspresjon i kreftceller.
A) Skjematisk av luciferase reporter konstruksjonene inneholder p21 mRNA 3’UTR, som inkluderer to bindingsseter for MIR-17-106b familien. Mutasjoner ble generert i disse MIR-106B målse. HCT-116 celler ble transient ko-transfektert med Firefly luciferase pGL3 vektorer som inneholder villtype eller mutert p21 3’UTR og PRL-TK Renilla luciferase kontroll vektor. Celler ble også behandlet med smørsyre (2 mm) eller kjøretøy og MIR-106B etterligne eller kontrollere miRNA molekyler (MIR-C). Cellene ble høstet for måling av luminescens 48 timer etter transfeksjon. B) Basal luciferase uttrykk for reporter konstruerer med villtype eller mutert p21 3’UTR. * Indikerer p 0,05 sammenlignet med p21 3’UTR C) Luciferase uttrykk i celler etter smørsyre og miRNA behandling. * Angir p 0,05 sammenlignet med kontroll. Resultatene er midler ± SE, n = 4.
Smørsyre stimulert luciferaseaktivitet 85% over kontrollen i HCT-116 celler transfektert med luciferase inneholder p21 3 «UTR vektor (Figur 3C). Butyrat s virkninger på luciferase-ekspresjon ble reversert ved tilsetning av eksogene MIR-106B etterligner, men ikke kontroll miRNA molekyler (MIR-C). Videre er luciferase-aktiviteten av HCT-116-celler transfektert med det kimære vektor inneholdende både muterte MIR-106B målsetene ble ikke forandret med butyrat behandling eller med butyrat i nærvær av eksogent MIR-106b.
butyrat effekt på celleproliferasjon hemmes av MIR-106b
Siden p21 hemmer cellesyklusprogresjon, vi undersøkte rollen MIR-106b på butyratproduserende anti-proliferative effekter. HCT-116-celler ble behandlet med flere fortynninger av butyrat i 24 timer og en WST-1 proliferasjonsanalyse ble utført. Som vist i figur 4A, butyrat doseavhengig hemmet celleproliferasjon. Den anti-proliferative butyrat-konsentrasjoner var i det fysiologiske området fra 0,5 til 20 mM [28], [29]. Celler transfektert med eksogent MIR-106b eller kontroll i 24 timer før til 2 mm butyrate eksponering ble også analysert (figur 4B). Den butyrat-indusert hemming av celleproliferasjon ble reversert ved tilsetning av MIR-106B ligne molekyler på en doseavhengig måte (figur 4B). I motsetning til dette, styrer miRNA molekyler (MIR-C) viste ingen effekt på den butyrat-indusert inhibering av celleproliferasjon.
HCT-116 celleproliferasjon hastigheten ble målt med WST-1 proliferasjon kit. A) HCT-116-celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av butyrat eller bærer i 24 timer før WST-1-måling. * Indikerer p 0,05, sammenlignet med basal B) HCT-116 celler ble transfektert med MIR-106b etterligne eller kontrollere miRNA (MIR-C) med de angitte konsentrasjoner umiddelbart før behandling med 2 mM smørsyre. Celler som ble behandlet bare med butyrat ble analysert som kontroll. * Indikerer p 0,05 sammenlignet med smørsyre alene. Resultatene er midler ± SE, n = 5.
Diskusjoner
I denne studien har vi identifisere, for første gang, en viktig vekstregulerende rolle for colonic epiteliale mirnas i mediere virkningene av mikrobe-avledede kortkjedet fettsyre-butyrat på verts genekspresjon. Interessant, i HCT-116 celler, smørsyre trykt mange av de samme mirnas økte i humane tykktarm kreft. En av disse mirnas, MIR-106b, ble funnet å målrette p21. Smørsyre og MIR-106b behandling av en p21 3’UTR luciferase reporter konstruere i HCT116 cellene indikerer at smørsyre stimulert p21 uttrykk er translatorisk hemmet delvis av MIR-106b. Dette delvis hemming av MIR-106b bekrefter tidligere rapporter som smørsyre regulerer også p21 uttrykk via en miRNA uavhengig mekanisme, gjennom sin hemming av HDAC [7], [13], [14]. Vi foreslår at det mikrobielle produktet butyrate regulerer cellesyklus gjennom både epigenetisk og translasjonell regulering gjennom sin dobbeltrolle som HDAC hemmer og hemmer av MIR-106b uttrykk (figur 5).
Smørsyre hemmer histone deactylases (HDAC) , slik at økt histon acetylering, redusert høyere orden kromatin folding, og økt transkripsjon av p21. Smørsyre reduserer også uttrykk for MIR-106b, og flere andre mirnas med samme frø sekvens region. Mir-106b familie hemmer p21 oversettelse, og dermed redusert uttrykk av MIR-106b familie fører til økt p21 oversettelse.
Resultatene har viktige implikasjoner for intestinal homeostase og kreftutvikling. Disse data tyder på at disse mirnas spille en rolle i colonic karsinogenese og at deres reduksjon av butyrat er en viktig mekanisme for sin anti-kreft effekt. Seks av disse miRNAs er i samme miRNA familie (MIR-17, MIR-20a, MIR-20b, MIR-93, MIR-106a, og MIR-106b), dele en identisk frø sekvens, og dermed målrette de samme bindingsseter i 3’UTRs av målet mRNA. Derfor kan undertrykkelse av deres målgener i løpet av kreftfremkallende prosessen representerer en mønstret cellerespons for å fremme celleproliferasjon og /eller vedlikehold av udifferensierte tilstand.
Fordi mange mirnas er også plassert i intronic regionene som koder for gener, i miRNA respons er sannsynlig koordinert med transciptionally aktivert gener som bidrar til den totale prosessen med kreftutvikling. Som et eksempel relevant for våre funn, er MIR-106b-25 polycistron ligger innenfor intron 13 av MCM7 gen på kromosom 7q22.1 [23]. MCM7 (minichromosome vedlikehold protein 7) regulerer DNA-replikasjon i S-fasen. I hvilende celler, humane MCM7 mRNA-nivåer er nesten umulig å oppdage, men dets ekspresjon induseres som celler inn i cellesyklus. Den MCM7 arrangøren har tre E2F-seter, tre GC bokser, og en E boks [30]. I hepatocellulær karsinom (HCC), ekspresjon av MIR-106b forløper korrelerer sterkt med MCM7 ekspresjon, noe som indikerer at MIR-106b-25 polycistron er coordinately transkribert under påvirkning av den MCM7 promoteren. Høye nivåer av uttrykk av transkripsjonsfaktoren E2F1 i HCC også korrelert med økt MIR-106b uttrykk [31]. I magekreftceller, synes E2F1 også å regulere MIR-106b-25 uttrykk parallelt med økningen i MCM7 uttrykk [32]. I musefibroblastere transformert med EIA og Ras onkogener, smørsyre reduserer E2F1 utskrifter og protein samt arrangøren aktivering [33]. Dermed kan butyrat utøve sin virkning på MIR-106b uttrykk via redusert E2F1 uttrykk, skjønt videre studier i HCT-116-celler for å undersøke denne muligheten.
Som nevnt tidligere, feilregulering av miRNA uttrykk kan påvirke carcinogenese når Mirna målene er tumor suppressors eller onkogener. Mens behandling med MIR-106b fører til redusert p21 protein uttrykk, p21 mRNA nivåer endres ikke, som er konsistent med tidligere rapporter som MIR-106b regulerer p21 gjennom translasjonsforskning hemming snarere enn mRNA stabilitet [32]. Selv om MIR-106b regulering av p21-ekspresjon er blitt beskrevet i mange celletyper, er det motstridende data om mekanismen for denne interaksjonen. I human mammary epitel-celler og normale lungefibroblaster, redusert MIR-106b på p21 mRNA med ca. 40% [22]. I motsetning til i HCC, p21 uttrykk viste ingen sammenheng med uttrykk for den miR106b-25 klyngen, og synes ikke å være et mål av disse miRNAs i denne celletypen [31]. I en menneskelig gastrisk karsinom avledet cellelinje, MIR-106b trykt p21 protein uttrykk, men ikke føre til en betydelig endring i p21 mRNA nivåer [32].
I sammendraget, vi har oppdaget en ny virkningsmekanisme for butyratproduserende anti-kreft effekt som involverer modulering av miRNA profiler og oversettelse avhengig genuttrykk. Som ett eksempel, induserer butyrat ekspresjon av p21, en viktig regulatorisk molekyl av cellesyklus-stans, ved å undertrykke medlemmer av MIR-106b familien. Smørsyre hemming av MIR-106b er også forbundet med en betydelig reduksjon i kreftcelle spredning priser. Sistnevnte reverseres ved tilsetning av MIR-106B etterligner. Disse funnene har avdekket et unikt eksempel på mikrobiell regulering av verts genekspresjon som forsinker celle sykling og hemmer tykktarmskreft celleproliferasjon.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Smørsyre endrer vesentlig uttrykk for førtifire mirnas i HCT-116 celler. HCT-116-celler ble behandlet med 1 mM butyrat i 24 timer. Isolert total RNA ble underkastet miRNA matrise hybridisering. Førti-fire mirnas viste signifikante endringer i uttrykk som svar på smørsyre behandling. Microarray data ble normalisert ved hjelp av den globale Lowess regresjonsalgoritmen og er uttrykt som logaritmen med base 2 transformerte forhold av prøvesignalet til kontrollreferanse-bassenget signal. Endringene i miRNA uttrykket ble bekreftet ved hjelp av real-time, kvantitativ PCR for 13 av de 26 mirnas at redusert og fem av de 18 miRNA s som økte
doi:. 10,1371 /journal.pone.0016221.s001 product: ( TIF)
Tabell S1.
