Abstract
Serous eggstokkreft (SEOC) er den dødeligste gynekologisk kreft. MicroRNAs (mirnas) er en klasse av små ikke-kodende RNA som regulerer genekspresjon og proteintranslasjon. Mirnas er også kodet av virus i den hensikt å regulere sine egne gener og de av de infiserte celler. Dette er den første studien vurdere virus mirnas i SEOC. Mirnas sekvense data fra 487 SEOC pasienter ble lastet ned fra TCGA nettstedet og analysert gjennom in-house sekvense rørledningen. Å kryss-validere TCGA analyse, målte vi uttrykk for MIR-H25 ved kvantitativ immunfluorescens i en ekstra kohort av 161 SEOC pasienter. Gene, miRNA uttrykk, og cytotoksisitet analysen ble utført på flere eggstokkreft cellelinjer transfektert med MIR-H25 og MIR-BART7. Utfallet analyse ble utført ved hjelp av multivariat Cox og Kaplan-Meier metoden. Virale mirnas er mer uttrykt i SEOC enn i normalt vev. Videre Herpes- lignende virus mirnas (MIR-BART7 fra EBV og MIR-H25 fra HSV-2) er betydelige og prediktive biomarkører for utfallet i multivariat Cox analyse. MiR-BART7 korrelerer med resistens mot første linje kjemoterapi og tidlig død, mens MIR-H25 ser ut til å gi en beskyttende effekt og langsiktig overlevelse. Integrert analyse av gen og virus mirnas uttrykk tyder på at Mir-BART7 induserer direkte cisplatin-motstand, mens MIR-H25 endrer RNA prosessering og påvirker uttrykket av skadelige menneskelige mirnas som MIR-143. Dette er den første undersøkelsen bindings viral miRNA uttrykk for eggstokkreft resultat. Viral mirnas kan være nyttig for å utvikle biomarkører for tidlig diagnose og som en potensiell terapeutisk verktøy for å redusere SEOC dødelighet
Citation. Pandya D, Mariani M, McHugh M, Andreoli M, Sieber S, S He, et al . (2014) Herpes Virus mikroRNA Expression og betydning i Serous eggstokkreft. PLoS ONE 9 (12): e114750. doi: 10,1371 /journal.pone.0114750
Redaktør: Pierre Busson, Gustave Roussy, Frankrike
mottatt: 12 juni 2014; Godkjent: 13 november 2014; Publisert: 08.12.2014
Copyright: © 2014 Pandya et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Analysen er utført på TCGA datasett som er fritt tilgjengelig på TCGA data portal (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/). Nivå 3 data er tilgjengelig uten restriksjoner, mens nivå 1 data og klinisk informasjon er tilgjengelig etter søknad er innkommet gjennom TCGA data portal. Retningslinjer for TCGA datatilgang forklares ved https://cancergenome.nih.gov/abouttcga/policies/policiesguidelines
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av en bevilgning fra AIRC (Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, IG11975 ), Associazione OPPO e le sue stanze ONLUS, av Ruth C. Donovan Cancer Research Program og av en liberal donasjon fra Mr. og Mrs. Ruggles. Dette arbeidet er dedikert til Monica DeFeo som mistet sin modige kamp mot kreft i en alder av 53. Sponsorer av studien ikke har noen rolle i studien unnfangelse og forvaltning
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Serous eggstokkreft (SEOC) er den mest dødelige gynekologisk kreft. På grunn av sin kliniske latskap, er de fleste av pasientene diagnostisert sent stadium når kirurgi alene ikke er tilstrekkelig for å fullstendig utrydde svulsten. Som en konsekvens, er kjemoterapi vanligvis nødvendig å ytterligere kontrollere sykdommen. Førstelinje kjemoterapi for eggstokkreft inkluderer vanligvis en platina (vanligvis carboplatin) og et taxan (vanligvis paclitaxel) [1]. Biomarkører som prospektivt prediktiv av følsomhet eller resistens mot kjemoterapi er desperat behov for å skikkelig individual behandlingsalternativer og unngå giftige behandlinger for de pasienter som vil være ildfast til kjemoterapi. Arbeidet med å utvikle slike biomarkører, problematiske for alle solide maligniteter, er spesielt irriterende for eggstokkreft hvor ekstrem klonal heterogenitet er normen og som det ikke kjører mutasjoner har blitt identifisert [2].
microRNAs (miRNAs) er en klasse av små, ikke-kodende RNA som regulerer genekspresjon og proteiner oversettelse og påvirker alle aspekter av mobilnettet fysiologi. Samle bevis indikerer at mange mirnas er avvikende uttrykt i kreft hos mennesker, og miRNA uttrykk profiler har utvidet prognostisk informasjon fra tradisjonelle klassifiseringsordninger knyttet til scenen og subtype [3], [4], [5]. Virus også kode mirnas og dermed påvirke funksjon av infiserte celler. I pattedyr er virusinfeksjon en potent trigger av interferon respons som inhiberer viral replikasjon og viral begrenser skade. Infeksjon av pattedyrceller etter RNA-virus, bortsett fra retrovirus, som fører til genereringen av lange dsRNAs løpet av viruset livssyklus. DNA-virus produsere dsRNAs av konvergent transkripsjon av deres kompakte virale genomer. Viral dsRNA er en potent trigger av interferon respons som fosforylerer oversettelsen faktor eIF2a og fører til global translasjonsforskning og apoptose [6], [7], [8]. Som en adaptiv strategi, har virus utviklet seg et variert utvalg av mottiltak for å blokkere interferon produksjon, og noen av disse er avhengige av virus mirnas som effektorer av cellular kontroll. Alle herpes virus kjente (human og ikke-human) koder for multiple mirnas [9]. Som et eksempel, inhiberer hCMV MIR-UL112-1 ikke bare viral IE1 utseende, men også cellulær MICB uttrykk for å fremme viral latens og unngå utrydding av naturlige dreperceller [10]. Derfor ser det ut til at herpes virus er i stand til å kapre den intracellulære kontroll av gen /protein uttrykk gjennom viral mirnas.
Herpes- lignende infeksjoner er sta vanlig og utbredt hos mennesker. EBV [11] og CMV [12] infeksjoner er til stede i minst 80% av befolkningen. Worldwide forekomst av herpes simplex virus (HSV) infeksjon, teller begge forkjølelsessår (HSV-1) og genital herpes (HSV-2), er mellom 65% og 90% [13]. Disse epidemiologiske data antyder en høy sannsynlighet for at kreftpasienter eggstokk er bærere av i det minste en eller flere av herpes-infeksjoner. På grunn av deres utbredte forekomsten og utholdenhet og evne til å påvirke transkripsjon og oversettelse i infiserte celler, hypotese vi at herpes virus mirnas er klinisk viktige formidlere av SEOC biologi med betydelig potensial som biomarkører og narkotika mål.
Resultater
uttrykk for viral miRNAs er høyere i SEOC enn i normalt vev
The Cancer Genome Atlas (TCGA) prosjektet [14] analysert og katalogisert messenger RNA uttrykk, miRNA uttrykket (Illumina Hiseq), arrangøren metylering og DNA kopiantall i 489 avanserte serøse eggstokkene adenokarsinomer og DNA-sekvensene av exoner fra kodende gener i 316 av disse svulstene. Denne banebrytende arbeid er en enestående ressurs for utvikling av nye og innovative strategier for eggstokkreft behandling. De TCGA miRNA studier publisert hittil brukt bare nivå 3 data som representerer de kartlagte mirnas bare ved hjelp av menneskelig (ikke viral) miRNAome som referanse. For å overvinne denne begrensningen, lastet vi nivå 1 rådata, og vi utførte miRNA-seq kartlegging for 487 pasienter som refererer både menneskelige
og
viral miRNAomes. Vi var vellykket i kartlegging 88,2% av lyder. Gjennomsnittlig antall kartlagt leser for hver pasient var 9,2 millioner. Som forventet, ble hovedandelen av leser kartlagt på den menneskelige miRNAome. Men en detekterbar og ganske anselig antall lese (n = 184 618) ble kartlagt på den virale miRNAome, og dermed demonstrere nærværet av virale mirnas i SEOC pasienter. Resultater ble normalisert for å ta hensyn til at det totale antall leser fra hver pasient var ikke identiske, og at, i fravær av normalisering, variasjoner i antall lesninger av individuell miRNA kan skyldes sekvense dybde. Derfor normalisert vi data som TPM (transkripsjoner per million) leser. Gjennomsnittlig antall virus miRNA leser for hver pasient var 45,6 TPM. De mest tallrike viral mirnas ble kartlagt i HSV-1 (n = 128 701) og HSV-2 genomet (n = 51 709). HH6VB og EBV utgjorde 986 og 1260 leser, henholdsvis. CMV (cytomegalovirus) og KSHV (Kaposis Sarkom Herpes Virus) var til stede med 96 og 178 leser, henholdsvis. TCGA omfatter ikke normal eggstokkvev kontroller for miRNA-seq. For å ha et referanseområde for ekspresjon av virale mirnas i noncancerous vev, nedlastes vi 607 normalt vev fra TCGA inkludert blære, bryst hode 0,0001, t-test). Mellom ekspresjonen av virale miRNA i SEOC i forhold til noncancerous vev. Data er uttrykt som summen av alle de virale mirnas. Data er uttrykt som TPM og bar på diagrammet tilsvarer gjennomsnittet av noncancerous vev (11,8) og SEOC (45,6).
Deretter vi utført en komparativ analyse av uttrykket nivåer av både MIR -H25 og MIR-BART7 og noen menneskelige mirnas vanligvis uttrykt i epiteliale komponenten i SEOC (MIR-21) [15], [16] og i røde blodceller (MIR-16) [17] (fig. 2). MiR-21 uttrykk nivåer var betydelig høyere enn de av MIR-16 (p 0,001, paret t-test). Et lignende mønster ble også observert for både MIR-H25 og MIR-BART7, som ble uttrykt i det vesentlige lavere nivå i forhold til MIR-21 (p 0,001, paret t-test). Sammenlignet med MIR-16, igjen både virale mirnas ble signifikant uttrykt ved lavere nivåer (p 0,001, paret t-test), selv om det i dette tilfellet er forskjellen i uttrykket var mindre konsistent enn det lagt merke til for MIR-21
kvinner ble kategorisert som negativt eller positivt for MIR-BART7 og MIR-H25 hvis TPM henholdsvis 0 eller TPM = 0,. I hver tomt tilsvarer den horisontale linjen til median, merket 25
th-75
th persentil og linjene til konfidensintervall (5
th-95
th persentil).
Prognostic rolle virus miRNAs i SEOC
for å kunne vurdere om uttrykk av virale mirnas var prognostisk, analyserte vi hver enkelt viral miRNA i en Cox regresjonsmodell. Analysen ble utført i univariat og multivariat analyse inkludert alder og stadium, siden disse variablene var signifikante univariate prediktorer. Den endepunktet var total overlevelse (OS) målt i måneder. En hazard ratio (HR) 1 indikerte en ødeleggende effekt på OS, mens HR 1 betydde en beskyttende effekt. Analysen ble utført ved bruk av ekspresjon av virale miRNA (TPM) som en kontinuerlig variabel. Den totale samlet analyse for hvert virus ikke gi betydelig prediktiv evne i Cox multivariate modellen (
p
0,05). Bare HSV-1 tendert mot en betydelig beskyttende effekt med en
p
-verdi i multivariat analyse av 0,053 (HR = 0,33; KI 0,03 til 1,01). Når begrensende bassenget, men å inkludere bare de HSV-2 virus mirnas vanligvis uttrykt i produktiv infeksjon (MIR-H9, MIR-H11, MIR-H12, MIR-H13, MIR-H19, MIR-H20, MIR-H21, MIR-H22, MIR-H23 og MIR-H25 [9]), den beskyttende effekten nådde statistisk signifikans (HR = 0,2, KI 0,04 til 0,89,
p
= 0,032). Spesielt, ble uttrykket av viral MIR-H25 (HSV-2) funnet i 233/487 (48% med TPM 0) av prøvene. Multivariat analyse utnytte Cox modellen viste at høy uttrykk for denne viral miRNA var knyttet til et bedre resultat (HR = 0,1; CI 0,01 til 0,55;
p
= 0,006). I tillegg er uttrykk for MIR-H25 var høyere hos pasienter med komplett kjemoterapi respons og lavere hos pasienter med progressiv sykdom (Fig. 3). Selv om mekanismen ikke er kjent, produktiv infeksjon av HSV-2 med tilhørende høy ekspresjon av MIR-H25 kan hemme kreftcellereplikasjon, direkte eller økning avliving av HSV-2-infiserte kreft celler av immunsystemet.
asterisker markerer signifikant minker av ekspresjonen av MIR-H25 hos pasienter med både PD og SD, sammenlignet med pasienter med CR. Dette funnet støtter en beskyttende rolle MIR-H25 uttrykk.
Deretter analyserte vi uttrykket av MIR-H25 i en ekstra kohort av 161 SEOC pasienter med klinisk funksjoner er oppsummert i tabell 1. For hver pasient, opp til 12 vev kjerner ble tatt fra forskjellige deler av hver kreft (933 kjerner i totalt), og disse ble avlest i en mikro vev array (TMA) format. Uttrykket av MIR-H25 (farget med skreddersydde Exiqon probe) i hver kjerne ble analysert med AQUA programvare som utnytter et forhåndsdefinert sett av algoritmer og uten tilsyn metode for å vurdere målet nivåer i ulike cellulære underrommene (eller «masker»). Cytokeratin og vimentin antistoffer farging gitt tumor og stromale masker henholdsvis, og DAPI tjente til å definere den kjernefysiske masken. En oppsummering av resultatene av AQUA scoring er rapportert i fig. 4. Generelle intensiteten av MIR-H25 var høyere i cytoplasma av kreftceller og lavere i stromal masken. Negative og positive kontroller ble oppnådd ved anvendelse av en oligonukleotid ikke rettet mot en region av det humane genom (SiC) og U6 små RNA, respektivt. SiC-probe viste ingen farging (figurene 5 og amp;. 6A). Som forventet, U6 sonden vist atom ekspresjon i nesten 100% av cellene (fig. 6B). Ekspresjon av U6 var høyere i de epiteliale kreftceller sammenlignet med nivåene lagt merke til i stromale celler (Fig. 6B). MiR-H25 sonden ble oppdaget med to mønstre av uttrykk. I den ene, ble proben fargingen begrenset til kjernen av tumorceller (Fig. 6C). I en andre, det var diffus cytoplasmisk farging av både tumor og stromale celler (fig. 6D). Andre tall for å beskrive ved høyere forstørrelse fargingsmønsteret er gitt som S1, S2, S3, S4 og S5 figurene. Multivariat Cox analyse inkludert alder og stadium avslørte at uttrykket av kjernefysisk MIR-H25 var predikere utfallet (HR 0,91, KI 0,65 til 1,24), mens uttrykket med en cytoplasmatisk fargemønster var signifikant assosiert med godt resultat (HR 0,56; CI 0,39 til 0,79;
p
= 0,0008). Dette AQUA analysen støtter fullt ut våre funn fra TCGA datasett, nemlig at produktive HSV-2 infeksjon (med samtidig cytoplasmatiske MIR-H25 over-uttrykk) gir beskyttelse til SEOC pasienter.
Hver prikk tilsvarer verdien av en individuell vev kjerne. AQUA score ble beregnet i stromal maske (blå prikker), i den kjernefysiske maske (røde prikker), i svulsten cytoplasma maske (grønne prikker) og i svulsten maske (gule prikker). De tilsvarende linjer viser til glattet gjennomsnitt for hver pasient og fargelegging er det samme av prikkene.
På toppen SiC sonde og nederst MIR-H25 sonde. Blå signal = DAPI. Gul = Cytokeratin. Grønn = vimentin. Pink = MIR-H25 sonde. Bar størrelse tilsvarer 100 mikrometer
Fra topp til bunn. Fusjonerte bildet, nukleær farging (DAPI), tumor maske (cytokeratin immunfarging), stromal maske (vimentin immunfarging) og RNA probe. Probene er SiC (kryptert interfererende kontroll) (A), U6 (positiv kontroll) (B), og MIR-H25 (C 0) ble kun påvist i 7,9% av prøvene samlet, det var overrepresentert hos pasienter med refraktær og resistent sykdom sammenlignet med kjemoterapi-sensitive gruppen (Fig. 7A og 7B) . Følgelig MIR-BART7 positive pasienter utstilt forkortet total overlevelse i Kaplan Meier (Fig. 7C) og Cox multivariat analyse (HR 3.4, CI 2.2 til 6.6,
p
= 0,002).
En Pasienter ble merket i henhold til PFI som ildfast (PFI 6 måneder), resistente (PFI 6-12 måneder) og sensitive (PFI 12 måneder). Uttrykk av MIR-BART7 er betydelig lavere i sensitive i forhold til ildfaste og resistente grupper (dobbel stjerne, p 0,001, t-test). B: Beredskapsanalyse (mosaikk tomt) av pasientene gruppert for uttrykk av MIR-BART7 (TPM 0 er positive (n = 38), blå søylene; TPM = 0 (n = 449) er negative, røde søyler) og i henhold til respons på kjemoterapi, som beskrevet i A. dobbeltsasterisker viser at andelen av sensitive pasienter er høyere i MIR-BART7 negativ gruppe (Fisher eksakte test, p 0,001, dobbelt stjerne). C: Kaplan-Meier-analysen av de TCGA pasienter (n = 487) i henhold til ekspresjonen av MIR-BART7. Den tidlige dødeligheten er vesentlig høyere i MIR-BART7 positive pasienter (Wilcoxon test, p = 0,01). OS (X-aksen) representerer total overlevelse uttrykt i måneder.
Identifikasjon av endringsmekanismer SEOC biologi
En av fordelene med TCGA datasettet er dens inkludering av både miRNA-seq og genuttrykk data. Denne funksjonen gjør det mulig ytelse med integrerte analyser for å identifisere kandidat gener reguleres av virus mirnas som tidligere beskrevet for menneske mirnas [18]. Vi hadde fokusert våre analyser på de to individuelle virus mirnas (MIR-H25 og MIR-BART7) som viste betydning i kliniske utfallet studier som beskrevet ovenfor. Vi lastet ned på nivå 2 datarapportering genuttrykk analyser utnytte Affymetrix U133 chips. For 414 pasienter (som ble randomisert til enten en trening eller prøving sett), vi får analysert både gen og viral miRNA uttrykk. Vi gruppert pasienter i henhold til uttrykket nivåer av de to virus mirnas av interesse (positiv = TPM 0 vs. negativ = TPM = 0). Genene vesentlig forskjellig mellom disse to gruppene ble identifisert på et konfidensnivå på
p
0,05 etter gjen hypotese korreksjon med Benjamini-Hochberg metoden. Ved hjelp av denne tilnærmingen, har vi funnet 262 gener forskjellig uttrykt for MIR-H25. I henhold til DAVID bioinformatiske ressursen [19], gruppert de inn i 12 uavhengige funksjonelle grupper, med RNA-prosessering, skjøting og transport som den mest signifikante (fig. 8). Virkningen på RNA-behandling ble fulgt av en signifikant modulering av ekspresjonen av enkelte humane miRNAs. For eksempel, kvinner med høye nivåer av MIR-H25 (fig. 9A), men ikke MIR-BART7 (Fig. 9B) viste en signifikant reduksjon i ekspresjonen av MIR-143. MiR-143 er en potent miRNA, som i TCGA studien, var relatert til dårlig resultat i multivariat Cox-modell (HR 14.8, KI 5,9 til 37,9,
p
0,001) og Kaplan-Maier analyse (fig. 9C). Effekten av MIR-H25 på MIR-143 synes ikke er relatert til ikke-spesifikk nedregulering av miRNA behandling, som ingen signifikant forskjell mellom MIR-H25 negative og positive pasienter i den totale ekspresjon av ikke-kodende RNA ble observert (fig. 9D). Påvirkningen av MIR-H25 på Mir-143 uttrykk kan faktisk være konkret og direkte; vi var i stand til å reprodusere det samme fenomenet in vitro benytte to SEOC cellelinjer (A2780 og Skov-3) transfektert med en syntetisk Mir-H25. Over-uttrykk for MIR-H25 ble testet på tre konsentrasjoner (0,1, 1 og 10 nM) ved hjelp av trans medium, en egge oligo ikke rettet mot en region av det menneskelige genom (SiC) og en viral miRNA ikke uttrykt i SEOC (speil UL112) som negative kontroller. Bare MIR-H25 produsert en betydelig nedregulering av MIR-143 uttrykk (Fig. 10).
Mir-H25 nettverk viser 35 gener som er involvert i RNA prosessering, spleising og transport. Utbygging av nettet i DAVID databasen er 15/35 (42%, svarte sirkler).
Box-whisker plott diagram som viser uttrykket av MIR-143 (TPM) i henhold til uttrykk av speil H25 (A) og Mir-BART7 (B). Pasientene ble definert som positiv for viral miRNA uttrykk hvis TPM verdien var 0 (n = 233). Pasienter med TPM = 0 ble definert negative (n = 254). Figuren viser en betydelig nedregulering av MIR-143 hos kvinner positive for MIR-H25 (p 0,001, t-test), men ikke hos pasienter positive for MIR-BART7. Kaplan-Meier-analysen av pasienter i henhold til ekspresjonen av MIR-143 (C). Pasienter med høyt uttrykk av MIR-143 utstillings et betydelig dårligere resultat i forhold til pasienter med lav Mir-143 uttrykk (P 0,001, Wilcoxon test). D: Analyse av ekspresjon av ikke-kodende RNA (som TPM) hos pasienter gruppert for MIR-H25 ekspresjon. Grønne linjer og diamanter skildre midlene og konfidensintervall av midler til de to gruppene. Forskjellen er ikke statistisk signifikant (
p
0,05, t-test).
I A-C og B-D uttrykket av MIR-H25 og MIR-143, henholdsvis. I A-B og C-D, A2780 og SKOV-3-celler, respektivt. Blå: kontroll med trans medium; Red: Egge kontroll syntetisk probe (SiC); Grønn: MIR-UL112 syntetisk; Svart: MIR-H25 syntetisk. Data viser at uttrykket av MIR-H25 (10 nM) undertrykker Mir-143 uttrykk i begge cellelinjer.
For at om MIR-BART7, vi utført det samme genet nettverksanalyse beskrevet ovenfor for MIR -H25. MiR-BART7 uttrykk gruppert med 221 gener i 6 funksjonelle grupper, den mest fremtredende av disse er T-celleaktivering pathway (Fig. 11). Også har vi identifisert et betydelig oppregulering av ADH1B genet. Dette genet koder for alkoholdehydrogenase 1B, nøkkelenzymet for omdannelse av ethanol til acetaldehyd, en substans som griper inn i DNA-reparasjon [20]. ADH1B øker betydelig hos kvinner uttrykker Mir-BART7 (Fig. 12A), mens det var uendret i kvinner uttrykker Mir-H25 (Fig. 12B). Støtte til MIR-BART7 prognostisk data presentert i Fig. 5, kvinner med høy uttrykk for ADH1B ble relativt overrepresentert blant pasienter ildfaste eller resistente mot førstelinje kjemoterapi (Fig. 12C). For å utforske sammenhengen mellom MIR-BART7 uttrykk og motstand mot cellegift, vi transfektert A2780 og Hey celler (to cellelinjer cisplatin-sensitive) med en syntetisk Mir-BART7 (10 nM, Fig. 13) eller en kryptert kontroll (SiC ). Effektivitet av transfeksjon ble bekreftet med qPCR (Fig. 13A). Virkningene av MIR-BART7 ble også vurdert i forhold til ADH1B induksjon på proteinnivå med western blot teknikk (Fig. 13B). MiR-BART7 produsert en betydelig økt uttrykk for ADH1B innen både mobilmodeller. Økningen ble kvantifisert med densitometrisk analyse i tre uavhengige forsøk og var 4,5 og 3,2 i A2780 og Hei celler, henholdsvis (
p
0,001 t-test). Etter 12 timer fra transfeksjonen ble cellene inkubert med cisplatin i 72 timer og deretter tellet. For å kvantifisere resultatene vi brukt cisplatin aktive området (%) som nylig beskrevet av Barretina og coll. [21]. Transfeksjon med MIR-BART7 ga en signifikant økning av cisplatin-motstand i begge cellelinjer (Fig. 13C og fig. 13D). Som bemerket hos pasienter på gennivå, MIR-BART7 induserte en betydelig økning av ADH1B uttrykk i begge cellelinjer. Dessuten ble det undersøkt virkningen av fomepizole, en kjent spesifikk hemmer av ADH1B aktivitet [22]. Fomepizole helt avskaffet effekten av MIR-BART7 på cisplatin toksisitet (Fig. 13E, 13F og 13G), og dermed demonstrerer at Mir-BART7 avtar cisplatin effekt ved å øke ADH1B aktivitet.
Mir-BART7 nettverk viser 67 gener involvert i T-celleaktivering. Utbygging av nettet i DAVID databasen er 47/67 (70%, svarte sirkler).
Box-whisker plott diagram som viser uttrykk for ADH1B ifølge uttrykk for MIR-BART7 (A) og MIR-H25 (B). Stjerne indikerer en betydelig overekspresjon av ADH1B i MIR-BART7 positive pasienter (
p
= 0,02, t-test), men ikke i MIR-H25 positive pasienter. Beredskaps analyse (C) (mosaikk plott) av pasienter stratifisert ifølge ADH1B uttrykket (blått og rødt er for høy og lav ekspresjon, henholdsvis) og følsomhet overfor kjemoterapi (ildfast, motstandsdyktig og sensitive kategorier som er beskrevet i fig. 5A). ADH1B uttrykk er betydelig høyere i ildfast og resistente pasienter (
p
0,05, Fisher eksakt test). Sammenlignet med den følsomme gruppen (tilsvarende MIR-BART7)
Representative qPCR-analyse av A2780-celler transfektert med et syntetisk MIR (10 nM) tilsvarende sekvensen av MIR-BART7 (grønn linje) (A). Kontrollene ble representert av celler behandlet med bare trans medium (blå linje) og en sekvens ikke rettet mot det menneskelige genom (SiC, rød linje). Representative western blot i celler behandlet som i (A). Behandling med det syntetiske MIR-BART7 indusert ekspresjon av ADH1B på proteinnivået i begge cellelinjer. GAPDH fungert som lasting kontroll (B). Linjediagram som viser virkningen av cisplatin i A2780 (C) og (D) Hei-celler transfektert som beskrevet i (A). Linjediagram som viser virkningen av cisplatin pluss fomepizole (10 uM) i A2780 (E) og (F) Hei-celler transfektert som beskrevet i (A). Stolpediagram (G) som viser det aktive området av cisplatin i A2780 og Hey celler. Celler ble behandlet som i (D-E). Cisplatin effekter ble overvåket etter 72 timer med kultur i nærvær (eller ikke) av fomepizole 10 mikrometer. Barer og feilfelt tilsvarer mener og SD av triplikatprøvene utført i duplikat. Doble stjernetegn merke en betydelig effekt på en
p
. 0,001 nivå (t-test)
Diskusjoner
SEOC er den dødeligste gynekologisk kreft. Pasientene vil ha nytte av å identifisere biomarkører som er nyttige for diagnose av tidlig (mer behandles) sykdom, og fra utvikling av målrettet terapi. Denne studien er, så vidt vi vet, den første detaljert undersøkelse av rollen viral miRNA uttrykk i eggstokkreft. Først, viser vi at ekspresjonen av totale virale mirnas er høyere i SEOC sammenlignet med normale vev. Som en del av strategier vedtatt av eggstokkreft celler å unnslippe anerkjennelse av immunsystemet, det er hemming av endogen interferon respons [23], [24], [25]. Den utilstrekkelig interferon reaksjon skaper et cellulært miljø støttende for viral vekst og replikasjon [8], for derved forklarer den økte nivåer av virale mirnas i SEOC vev. Siden mirnas er motstandsdyktige mot nedbrytning og kan påvises i perifert blod [26], hypoteser om vi at sirkulerende total viral mirnas vil være høyere i eggstokkreft populasjonen sammenlignet med kontroller. En begrensning av våre undersøkelser er at i TCGA datasettet er det ingen normale kontroller fra eggstokkene vev. Imidlertid tok i betraktning de normale ekspresjonsnivåer ble oppnådd i et stort panel av vev. På tvers av alle disse noncancerous vev var det ingen signifikant forskjell i uttrykket av viral miRNAs. Derfor tror vi svært lite sannsynlig at det i eggstokkene normalt vev for noen grunner er det økt uttrykk av viral miRNA.
For det andre, rapporterer vi at to individuell viral mirnas MIR-H25 og MIR-BART7, fungere som modulatorer av SEOC biologi. HSV-2 produktiv infeksjon induserer en høy grad av MIR-H25 [27] som korrelerer med et bedre resultat. Vi dokumenterer denne tilsynelatende beskyttende effekt i to uavhengige kliniske kohorter benytte to uavhengige tilnærminger, miRNA-sekvensering (TCGA) og kvantitativ immunfluorescens (AQUA). AQUA tillater cellulær subcompartment analyse, og denne fremgangsmåte viser at den beskyttende effekt av mir-H25 er åpenbart bare når dens ekspresjon er cytoplasmisk (og karakteristisk for produktiv HSV-2-infeksjon) i stedet for kjerne (antyde latent HSV-2-infeksjon). MiR-H25 kan utøve sin effekt ved å kapre verten RNA prosessering og ned-regulere menneskelig MIR-143, en potent miRNA i menneskelig cellular funksjon [28]. Faktisk gir vi direkte bevis for dette fenomenet i celler transfektert med en syntetisk Mir-H25. Selv om det har bruken av onkolytiske HSV-stammer som behandling av ovarialcancer pasientene tidligere blitt rapportert [29], [30], [31], med strategien innebar vaksinasjon med sikte på å begrense produktiv HSV infeksjon. Våre observasjoner foreslår, derimot, er at produktive HSV-2 infeksjon potensielt fordelaktig og kan utnyttes for å øke effekten av onkolytiske HSV stammer.
Mens MIR-H25 gir en tilsynelatende beskyttende effekt, er MIR-BART7 forbundet med høy tidlig dødelighet. I tråd med de siste funnene i nasofaryngeal karsinom [32], viser vi en rolle for MIR-BART7 i å få forkortet platina fritt intervall (PFI) i en liten undergruppe av pasienter der denne miRNA er uttrykt. Transfeksjon studier med en syntetisk MIR-BART7 ga en signifikant økning av cisplatin-resistente celler som er fullt tilbakestilles ved bruk av fomepizole, en kjent inhibitor av ADH1B. I vår analyse er både MIR-BART7 og ADH1B forhøyet hos pasienter ildfaste eller resistente overfor første linje kjemoterapi. Forholdet mellom MIR-BART7 og ADH1B er av interesse på grunn av rapporten fra ADH1B som en potensiell kilde til chemoresistance i eggstokkreft [33]. Fomepizole er for tiden godkjent for behandling av metanol- og etylenglykol intoksikasjoner med en tilsynelatende god toksikologisk profil [22]. Dermed ser det sannsynlig at pasienter med høye nivåer av MIR-BART7, kan ADH1B hemming resultere i et bedre svar på cisplatin.
Vår studie er den første rapporten som viser en mulig involvering av viral miRNA som drivere av eggstokkreft biologi. Vi kan forklare våre funn med tre ikke-eksklusiv patogenetiske modeller. I den første, viral infeksjon skjer i eggstokkreft celler med samtidig produksjon av viralt miRNA. Vi tror denne muligheten usannsynlig, for den høye forskjell i uttrykket nivåer av de virale mirnas sammenlignet med humant miRNA uttrykt i kreftceller som MIR-21. I den andre, oppstår infeksjon i ovarievev i stromale celler hvor det er kjent at viruset kan replikere, slik som B og nevrale celler for EBV og HSV-2, respektivt. En tredje modell er at infeksjonen ikke er oppstått i eggstokkvev, men i et eksternt område og viral miRNA er tatt av kreft gjennom sirkulasjon.
I konklusjonen, gir vi overbevisende bevis for rollen herpesviruses kodede mirnas i SEOC. Våre observasjoner som totalt viral miRNA og minst to spesifikke virus mirnas er økt i eggstokkreft pasienter kan bidra i utviklingen av biomarkører for tidlig sykdom og utforming av nye kreftstrategi.
Materiale og metode
