Abstract
microRNAs (mirnas) viktig for posttranskripsjonelt genekspresjon er involvert i initiering og progresjon av kreft hos mennesker. I denne studien, rapporterte vi at
MIR-26a
var over-uttrykt i menneske EOC prøver og uttrykket nivået av ekstracellulært
MIR-26a
i plasma kan skille pasienter fra friske kontrollpersoner i EOC. Ektopisk uttrykk for
MIR-26a
i eggstokkreft (OC) celler økt celledeling og klonal formasjon. Dette vekstfremmende effekten av OC cellevekst ble formidlet av
MIR-26a
hemming av posttranscription av ER-α. Videre inhibering av
MIR-26a
undertrykte tumordannelsen som genereres ved å injisere OC-celler i nakne mus. Våre resultater tyder på at abnormt uttrykt
MIR-26a
kan bidra til OC utvikling
Citation. Shen W, Song M, Liu J, Qiu G, Li T, Hu Y, et al. (2014)
MiR-26a
Fremmer Eggstokkreft spredning og tumorigenesis. PLoS ONE 9 (1): e86871. doi: 10,1371 /journal.pone.0086871
Redaktør: Jin Q. Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 17 juni 2013; Godkjent: 16 desember 2013; Publisert: 22 januar 2014
Copyright: © 2014 Shen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble sponset av tilskudd fra prosjekt nr 30571836 fra NNSF (National Natural Science Foundation) i Kina. I tillegg arbeidet som presenteres er en del av prosjekter med Prosjekt No.L2010681 finansielt støttet av stiftelsen av undervisningsavdeling i Liaoning-provinsen i Kina, og prosjektleder No.201202259 Science finansielt støttet av Foundation of Science and Technology Bureau of Liaoning-provinsen i Kina Science . Forfatter Min Song bidratt til eksperimentell conceiving og utforming, veiledning og diskusjon av prosjektet, slik at hun er co-korrespondanse forfatteren av denne artikkelen. Alle de andre finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
OC er den femte vanligste kreftformen hos kvinner, og den ledende årsak til kreft dødsfall fra gynekologisk kreft i vestlige land [1]. I 2012 er det 22,280 nye tilfeller og 15.500 dødsfall fra OC i USA i henhold til de nasjonale kreftstatistikken. EOC står for 85% -90% av eggstokkreft. Dessverre er den generelle prognosen dårlig og de molekylære hendelser som fører til utvikling av denne sykdommen er fortsatt lite kjent.
mirnas representerer en stor familie av endogene ikke-kodende RNA og posttranscriptionally regulere genuttrykket [2]. Nyere studier har vist kritiske funksjoner av mirnas i viktige prosesser, herunder proliferasjon, differensiering og celledød [3]. Endret ekspresjon eller mutasjon av mirnas har blitt rapportert i cancer, så som lungekreft, brystkreft, leukemi og andre karsinomer [4]. I lungecancerceller, over-ekspresjon av
la-7
hemmet veksten ved å målrette Ras [5], [6]. Videre
MIR-21
direkte rettet mot tumor suppressor PTEN i leverkreft [7]. Dessuten flere studier viste at mirnas kan fungere enten som kreftbeskyttelse (som er tilfellet for
MIR-15a-MIR-16-1
klynge [8]) eller onkogener (som er tilfellet for
MIR-21 product: [
ni
]).
Genome-wide miRNA uttrykket profilering viste
MIR-26a
feilregulering i ulike kreftformer [10]. I denne studien fant vi at
MIR-26a
er over-uttrykt i menneskelig EOC. Vi viser at hemming av
MIR-26a
redusert spredning av menneskelige EOC celler, og undertrykt vekst av EOC celler i nakne mus. I tillegg ERα ble nedregulert av
MIR-26a
i EOC celler. Videre fant vi at ekstracellulære
MIR-26a
nivåene i plasma kan skille pasienter fra friske kontroller i EOC. Vår studie tyder på at avvikende uttrykk for
MIR-26a
er avgjørende for utvikling av menneskelige EOC og måling av sirkulerende
MIR-26a
kan være en god tilnærming til EOC diagnose.
Materialer og metoder
pasienter
Kliniske prøver (inkludert vev og plasmaprøver) ble samlet inn fra pasienter registrert på The First Affiliated Hospital of China Medical University (Shenyang, Kina). Pasientene informasjonen er oppsummert i Tabell 1, Tabell S1 og Tabell S2.
Material
Antistoff mot ERα var fra Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA), antistoff mot α -tubulin fra Sigma (St Louis, MO, USA). Alle andre reagenser var fra Sigma. Anti-MIR-26a og tull av anti-MIR var fra GenePharma (Shanghai, Kina). Cel-MIR-39 ligner var fra IBS (Shanghai, Kina).
kvantitativ RT-PCR plakater (QRT-PCR, kvantitativ revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon)
Total RNA isolert fra kliniske prøver eller celler ved hjelp Trizol Reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ble revers-transkribert til cDNA i henhold til forrige rapport [11]. Isolering av RNA fra plasma og kvantifisering av miRNA ble utført som beskrevet i [12]. I korte trekk, ble 25 fmol av Cel-MIR-39 ligner lagt til 400 ul plasma. Real-time PCR ble utført ved hjelp av SYBR grønn PCR mester mix (Takara, Otus, Shiga, Japan). Forsterkning og påvisning ble utført ved hjelp av ABI Prism 7700 system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Cel-MIR-39 ble tatt som referanse genet for plasmaprøver. Primere benyttet var oppført i tabell S3.
Cell Kultur
Den menneskelige OC cellelinjer, Skov-3, ES2 (Cellbank, Shanghai, Kina) ble opprettholdt i McCoys 5a supplert med 10% (v /v) føtalt kalveserum (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Disse cellene ble inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2.
Vector Construction
Full-lengde human
MIR-26a
ble amplifisert fra humant genomisk DNA og klonet inn i pcDNA3.1 på KpnI og Xhol nettsteder i henhold til forrige rapport [13] og [14]. Det humane villtype ERα ble generert ved PCR fra cDNA og PCR-produktene ble innsatt i pcDNA3.1 som beskrevet i [15].
Cell Growth Assay
Cellevekst ble estimert ved bestemmelse av celletallet og kolonidannelse. Cellene ble transfektert med
MIR-26a
eller anti-speil
26a
hjelp Fugene HD (Roche, Indianapolis, IN) i henhold til produsentens protokoll. Etter dyrking i 24 timer ble cellene sådd ut ved en initial densitet på 1 x 10
5 per 35 mm fat. Cellene ble så høstet ved de angitte tider og tallene ble telt ved bruk av COULTERTM (Beckman, Fullerton, CA, USA).
Celler transfektert med
MIR-26a
ble sådd på 96 brønners platene på en konsentrasjon på 2,5 × 10
3 celler, og målt etter 48 timer ved hjelp av en WST-1-analysen (BOOSTER, Wuhan, Kina), utført i henhold til produsentens protokoll.
totalt 500 celler transfektert med
MIR-26a
eller tom vektor (Ctrl) ble sådd i 35 mm skåler separat i tre eksemplarer. Tre uker senere ble koloniene fiksert med 4% paraformaldehyde, gjennomsyret med 20% metanol og farget med krystallfiolett. De fargede celler ble eluert med 10% iseddik og OD595-verdier ble målt ved hjelp av spektrofotometer som indikator på celletallet.
Luciferase Assay Reporter
1,5 x 10
5 SKOV3 stabil celler i 35 mm skåler ble ko-transfektert med pGL3-ERα-WT (1 mikrogram) eller pGL3-ERα-Mut (1 mikrogram) og PRL-TK (1 mikrogram) bruker.
FuGENE® HD Transfeksjon Reagens (Roche, Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) etter produsentens protokoll. Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble luciferase-aktivitet målt ved hjelp av en dobbel luciferase-rapportøranalysesystemet (Promega) og normalisert til Renilla luciferaseaktivitet.
Western blotting
Proteinene ble separert på SDS-8% PAGE, overført til PVDF-membraner (Amersham, Buckinghamshire, UK) og probet med primære antistoffer og sekundære antistoffer konjugert med pepperrot-peroksydase. Proteinbåndene ble synliggjort ved Amershams ECL-systemet og skannet. Deres tettheter ble bestemt ved Imagequant 5.2 programvare (Amersham).
In vivo tumorigenesis
SKOV3 celler transfektert med
MIR-26a
eller anti-speil
26a
separat. Hver naken mus ble subkutant injisert med 2 × 10
6 transfekterte SKOV3 celler. Tretti eller trettifem dager etter injeksjon musene ble drept og svulstene ble tatt. Den lengste og korteste diameteren av tumoren ble notert som d1 og d2. Svulsten volumet ble beregnet ved hjelp av ligning: V = d1 × d2 × d2 /2. Tumor vekt ble deretter målt.
statistikker
Flere sammenligninger ble vurdert av SPSS statistisk programvare for statistisk analyse. Wilcoxon Test og Krusikal Wallis H Test ble brukt i statistisk analyse av pasientprøver. Andre sammenligninger mellom grupper for statistisk signifikans ble utført med Student t test og variansanalyse (ANOVA). Resultatene ble betraktet som signifikant forskjell på * P 0,05; ** P. 0,01
Etikk erklæringen
Forskningen oppfyller alle krav for etikk eksperiment. Kliniske prøver ble samlet med samtykke fra pasienter og friske frivillige og godkjenning av medisinsk forskningsetiske komité for First Affiliated Hospital of China Medical University. Alle deltakerne har gitt sitt skriftlige samtykke til å delta i denne studien. Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee of China Medical University.
Resultater
økt uttrykk av MIR-26a i prøver og Plasma i Human EOC
det er blitt observert at ekspresjonsnivået av
MIR-26a
ble minsket eller øket i humane ondartede sykdommer, for eksempel brystkreft [16], nasofaryngeal karsinom [17], [18], og glioblastom [19] , noe som indikerer en komplisert rolle
MIR-26a
i progresjon av malignitet. For å undersøke hvilken rolle
MIR-26a
i EOC utvikling, må vi først undersøkte uttrykk for
MIR-26a
i prøver og plasma i EOC av SYBR-grønn stilk-løkke QRT-PCR [20]. Vi undersøkte uttrykk for
MIR-26a
på 26 tumorprøver og 19 normale eggstokker. Som vist i figur 1A, uttrykket nivåer av
MIR-26a
i tumorprøver var mye høyere enn de hos normale eggstokk prøver. Tilsvarende konsentrasjoner av
MIR-26a
var høyere i plasma fra EOC pasienter (n = 17) enn i den fra friske kontroller (n = 13) (figur 1 B). Sammen utgjør disse resultatene gir oss første bevis for at
MIR-26a
kan spille en rolle i utviklingen av menneskets EOC.
(A) Kvantitativ analyse av uttrykket nivåer av
speil 26a
i EOC prøver normalisert til de av 18s rRNA ved QRT-PCR. Data for hvert punkt var middelverdien av en gjentatt prøve i tre uavhengige eksperimenter (normal, n = 19; svulst, n = 26). ** P 0,01 vs Normal. (B) Kvantitativ analyse av uttrykket nivåer av plasma
MIR-26a
ved QRT-PCR. Data for hver prikk var gjennomsnittsverdien av en sample gjentatt i tre uavhengige eksperimenter (normal, n = 13; svulst, n = 17).
Over-uttrykke MIR-26a Fremmes EOC cellevekst og Hemme MIR-26a Trykt EOC Cell Proliferation
Vi neste undersøkt om
MIR-26a
påvirker EOC cellevekst ved hjelp SKOV3 og ES2 celler som modeller. Som vist i figur 2A, ble veksten evne SKOV3 og ES2 celler økt med over-ekspresjon av
MIR-26a
. Tvert i mot var proliferasjonen av cellene transfektert med anti-MIR-26a markert redusert sammenlignet med den til cellene transfektert med nonsense (figur 2B). WST-1-analysen viste lignende resultater i celleproliferering (figur 2C). Disse resultatene tyder på at
MIR-26a
faktisk påvirket EOC cellevekst.
Vekstkurver av SKOV3 (A) eller ES2 (B) celler transfektert med
MIR-26a product: ( venstre panel) eller anti-MIR-26a (høyre panel). Celle tall ble normalisert til de i 0 hr. Data var gjennomsnitt ± bred singlett. av tre uavhengige forsøk in triplo. * P 0,05, ** p 0,01 vs tom vektor (Ctrl) eller negativ kontroll (NC). (C) Celleproliferering transfektert med
MIR-26a
ble målt med en WST-1-analysen. Data var gjennomsnitt ± bred singlett. av tre uavhengige forsøk in triplo. ** P 0,01 vs tom vektor (Ctrl) (D) Kvantifisering av koloniene dannet av Ctrl eller
MIR-26a
transfekterte celler. Data var gjennomsnitt ± bred singlett. av tre uavhengige eksperimenter. ** P. 0,01 vs Ctrl
Den oppfatningen ble ytterligere testet i klonal dannelsen analysen. Antallet og størrelsen på koloniene dannet ble markert økt i
MIR-26a
transfekterte celler (figur 2D). Sammen disse resultatene tyder på at
MIR-26a
var faktisk involvert i reguleringen av EOC cellevekst.
ERα var en Target Gene av MIR-26a i EOC Cells
Vi deretter undersøkt mekanismer som
MIR-26a
fremme EOC celleproliferasjon. Hos pasienter med leverkreft, uttrykk for
MIR-26a
var høyere hos kvinner enn hos menn [21]. Videre
MIR-26a
regulert levertumorcellevekst ved å målrette ERα [22]. Som vist i figur 3A, luciferase aktiviteten til pGL3-ERα-WT i SKOV3-celler stable1 (S1) var mye lavere enn i kontrollceller. Luciferase aktiviteten pGL3-ERα-Mut ble reddet i Stable1 celler. Vi neste undersøkt om
MIR-26a
kunne regulere endogen ERα uttrykk i EOC celler. Sammenlignet med kontroll, endogene ERα mRNA nivåer (Figur 3B) og protein nivåer (Figur 3C) var nedregulert når cellene ble transfektert med
MIR-26a
.
(A) Stabile 1 celler (S1) ble transfektert med pGL3-ERα-WT (WT) reporter vektor eller pGL3-ERα-Mut (MUT). Data var gjennomsnitt ± bred singlett. av tre uavhengige eksperimenter. ** P 0,01 vs kontrollceller (Ctrl). (B) Kvantitativ analyse av uttrykket nivåer av ERα i Stable1 (S1), Stable2 (S2) og kontroll (Ctrl) celler ble bestemt og normalisert til GAPDH mRNA nivåer. * P 0,05, ** P 0,01 vs Ctrl. (C) Western-blot-analyse av totale cellelysater ekstrahert fra angitte stabile celler ved hjelp av de angitte antistoffer. Data var representative for tre uavhengige eksperimenter og kvantifisering normalisert med Ctrl. Tubulin fungerte som en lasting kontroll. (D) Den vekstkurver av S1, S2 og Ctrl celler. Data var gjennomsnitt ± bred singlett. av tre uavhengige forsøk in triplo. * P 0,05, ** P 0,01 vs Ctrl. (E) Over-ekspresjon av ERα redusert vekst av S1-celler etter transfeksjon. Celle tall ble normalisert til Ctrl celler. Data var gjennomsnitt ± bred singlett. av tre uavhengige eksperimenter i tre eksemplarer.
MiR-26a Kontrollert spredning av EOC Cells gjennom ERα
Gitt det faktum at
MIR-26a
var involvert i spredning av EOC celler og ERα var et mål av
MIR-26a
, vi neste testet om over-uttrykk for ERα kunne redde fremme spredning av
MIR-26a
i EOC celler. Videre stabil uttrykk for
MIR-26a
i to SKOV3 cellekloner (S1 eller S2) økte veksten av cellene om 1,58 eller 1,37 ganger i henholdsvis (figur 3D). QRT-PCR-analyse viste at
MIR-26a
uttrykk nivå ble sterkt økt i S1 og S2 celler (Figur S1). Som vist i figur 3E, mens veksten av S1-celler transfektert med ERα, ikke var forskjellig fra den til kontrollceller. Disse resultatene indikerer at
MIR-26a
kontrollert spredning av EOC cellene gjennom regulering av ERα uttrykk.
MiR-26a fremmet utviklingen av Tumor i Nude Mice
For å gi direkte bevis at
MIR-26a
var ansvarlig for EOC utvikling, SKOV3 celler transfektert med enten
MIR-26a
eller anti-MIR-26a ble injisert i flanken av hårløse mus som beskrevet. En uke etter implantasjon, kan xenopodet tumorer sees. Etter tretti eller trettifem dager ble alle nakne mus drept og svulstene ble tatt ut og veid. Ved makroskopisk observasjon, ble forskjellene i tumorstørrelse og volum mellom de to gruppene indikert. Svulsten produsert volum fra tom vektor var 0,435 ± 0,042 (cm
3, P 0,01), som i
MIR-26a
gruppen var 0,829 ± 0,172 (cm
3, P 0,01) (Figur 4A), som i negativ kontrollgruppe var 0,941 ± 0,163 (cm
3, P 0,01), og at det i anti-MIR-26a var 0,248 ± 0,05 (cm
3, P 0,01) ( Figur 4B). Den gjennomsnittlige vekten av svulsten som genereres fra tom vektor var 0,433 ± 0,07, mens den gjennomsnittlige vekten av svulsten som genereres fra
MIR-26a
var 0,821 ± 0,02 (gram, P 0,01). Den gjennomsnittlige vekten av svulsten som genereres fra tull var 1,062 ± 0,169, mens den gjennomsnittlige vekten av svulsten som genereres fra anti-MIR-26a var 0,473 ± 0,05 (gram, P 0,01), henholdsvis. Ovennevnte Resultatene tyder på at
MIR-26a
var avgjørende for utviklingen av EOC
in vivo
.
Svulstdannelse generert av SKOV3 celler. (A) transfektert med
MIR-26a
eller anti-MIR-26a (B) Nude mus ble subkutant injisert med 2 × 10
6 transfekterte celler. Representative bilder, måling av det endelige volumet og vekten av tumorene dannes. Tumorstørrelsene ble målt og beregnet i Materialer og metoder. Data var gjennomsnitt ± s.d. av 4-6 mus. ** P. 0,01 vs tom vektor eller tull
Diskusjoner
I denne studien har vi vist at uttrykket nivået av
MIR-26a
ble sterkt økt i menneskelige EOC prøver og blodbaserte
MIR-26a
nivå kan skille pasienter fra friske kontrollpersoner i EOC. Våre resultater viste også at uttrykket nivået av
MIR-26a
påvirket EOC cellevekst i kultur. Videre ERα var et mål for
MIR-26a
i EOC celler. Videre uttrykk nivå av
MIR-26a
påvirket tumordannelse i nakne mus. Derfor våre resultater er konsistente med en idé som
MIR-26a
er avgjørende for utviklingen av menneskets EOC.
microRNAs er kjent for å regulere uttrykket av gener som er involvert i flere biologiske prosesser som utvikling, spredning, apoptose og stress respons [23]. Nyere studier viser en direkte kobling mellom mirnas og kreft hos mennesker [4], [24], [25], [26]. Mirnas kan være onkogene miRNA (oncomirs) eller tumor suppressor relevant for kreft. Som tidligere vist, tap av onkogene
MIR-21
, handle for å undertrykke RHOB uttrykk, er assosiert med en høyde på RHOB i leverkreft og brystkreft celler [13]. Betydningen av andre miRNAs, for eksempel
la-7
,
MIR-16
,
MIR-126 Hotell og
MIR-125b
har også vært demonstrerte [27]. Nye microarray profildata viser
MIR-26a
feilregulering i diverse kreft [4]. I leverkreft,
MIR-26a
beskytter normal levervev fra leverkreft fremmende betennelse [21], og ser ut til å motvirke menneske brystkreft [16] og rabdomyosakrom [28]. Tvert imot,
MIR-26a
letter glioblastom formasjon som et oncogen [19]. Våre resultater hentet fra gain-of-funksjon og tap-av-funksjon tilnærminger indikerte at
MIR-26a
forfremmet spredning og hemming av
MIR-26a
trykt EOC celleproliferasjon.
i eggstokkreft, ERα uttrykket har blitt studert for å korrelere til chlinico-patologiske parametre og prognose [29], [30]. Tidligere studie viste at det ikke avsløre eventuelle sammenhenger med histologisk type svulster og kreft gradering eggstokkreft [30]. Univariat overlevelse analyse viste at pasienter med positiv-ERα status hadde en betydelig bedre progresjonsfri overlevelse sammenlignet med pasienter uten uttrykk [31]. I våre resultater, uttrykk for
MIR-26a
i prøver og plasma i EOC var mye høyere enn i vanlige eggstokkprøver, og
MIR-26a
fremme EOC celleproliferasjon ved å målrette ERα. Det betyr at
MIR-26a
kan være en viktig faktor i overlevelse av eggstokkreft.
Sirkulasjons biomarkører benyttes til diagnostisk sykdom, overvåke terapeutisk effekt og forutsi tilbakefall i kliniske applikasjoner. Oppdagelsen av sirkulerende mirnas hos kreftpasienter viser sitt potensial søknaden som kraftige biomarkører i kreftdiagnostikk [32]. Nyere studier viser at kreftrelatert mirnas kunne stabilt påvises i plasma og serum som stammer fra cancervev [4], [33]. Våre resultater undersøke muligheten for
MIR-26a
brukes som en biomarkør i klinisk setting gjennom å undersøke uttrykket av
MIR-26a
i plasma av EOC pasienter.
I konklusjonen hemming av
redusert EOC cellevekst i kultur og i naken mus MIR-26a
.
MiR-26a
påvirket spredning av EOC celler ved å målrette ERα. En viktig implikasjon av denne studien er at
MIR-26a
kan være et potensielt mål for terapeutisk intervensjon for menneskers EOC.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
MiR-26a
uttrykk nivå ble sterkt økt i S1 og S2 celler. QRT-PCR bestemt uttrykket nivåer av
MIR-26a
i S1 og S2 celler. Data var gjennomsnitt ± bred singlett. av tre uavhengige forsøk in triplo. . ** P 0,01 vs Ctrl
doi: 10,1371 /journal.pone.0086871.s001 plakater (DOC)
Tabell S1.
clinicopathologic data og
MIR-26a
uttrykk grad av kontroll
doi:. 10,1371 /journal.pone.0086871.s002 plakater (DOC)
Tabell S2.
clinicopathologic data og
MIR-26a
uttrykk nivå av eggstokkreft pasienter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0086871.s003 plakater (DOC)
tabell S3.
Primere som brukes i kvantitativ RT-PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0086871.s004 plakater (DOC)
