Abstract
Focal heft montering og demontering er avgjørende for cellemigrasjon og kreft invasjon, men de detaljerte molekylære mekanismene som regulerer disse prosessene fortsatt ikke klarlagt. Fosfatidylinositol fosfat kinase typen Iγ (PIPKIγ) binder talin og er nødvendig for fokal adhesjonsdannelse i EGF-stimulerte celler, men dens rolle i regulering av kontaktklebe dynamikk og kreft invasjon er dårlig forstått. Vi viser her at overekspresjon av PIPKIγ fremmet fokale vedheft formasjon, mens celler som uttrykker enten PIPKIγ
K188,200R eller PIPKIγ
D316K, to kinase-døde mutanter, hadde mye færre fokusvoksninger enn de som uttrykker WT PIPKIγ i CHO-K1 celler og HCT116 tykktarmskreftceller. Videre overekspresjon av PIPKIγ, men ikke PIPKIγ
K188,200R, resulterte i en økning i både fokale vedheft monterings- og demonterings priser. Nedbryting av PIPKIγ ved hjelp shRNA sterkt hemmet dannelsen av fokale sammenvoksninger i HCT116 cellene. Overekspresjon av PIPKIγ
K188,200R eller uttømming av PIPKIγ redusert styrken på HCT116 celle adhesjon til fibronection og hemmet invasiv kapasiteter på HCT116-celler. PIPKIγ uttømming redusert PIP
2 nivåer til ~40% av kontroll og PIP
3 til ikke målbare nivåer, og hemmet vinculin lokalisering til Focal adhesjon. Til sammen PIPKIγ positivt regulerer fokale vedheft dynamikk og kreft invasjon, mest sannsynlig gjennom PIP
2-mediert vinculin aktivering
Citation. Wu Z, Li X, Sunkara M, Spearman H, Morris AJ, Huang C (2011) PIPKIγ Regulerer Focal Heft Dynamics og Colon Cancer Cell invasjon. PLoS ONE 6 (9): e24775. doi: 10,1371 /journal.pone.0024775
Redaktør: Maddy Parsons, Kings College London, Storbritannia
mottatt: 11 juli 2011; Godkjent: 17 august 2011; Publisert: 12. september 2011
Copyright: © 2011 Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av Markey Cancer Center Oppstart fond (University of Kentucky) (til Cai Huang) og delvis ved Migration Consortium tilskuddet (NIH GM64346) (til Ken Jacobson, University of North Carolina-Chapel Hill). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Focal voksninger (fettsyrer, også kalt celle-matrix sammenvoksninger) er bestemte typer store makromolekyl forsamlinger på ventral overflaten av cellene, som fungerer som både mekaniske machineries og reguleringssignal nav [1], [2]. Tid og rom regulering av brennvidde heft montering /demontering er nødvendig for cellemigrasjon [3]. I løpet av cellemigrering, er begynnende fokal adhesjon (også kalt kontakt komplekser) dannet for å stabilisere lamellipodia på forsiden av cellene mens brenn adhesjoner oppløses ved de bakre kanter av celler [4], [5].
fokal adhesjon montering og demontering er også innblandet i kreft invasjon, en forutsetning for metastasering. DRR (nedregulert i Nyrecellekarsinom) forbinder med aktin og mikrotubuli og stimulerer glioma invasjon ved å fremme brennvidde heft demontering [6]. Aktin kryssbinding protein filamin En undertrykker brennvidde heft demontering og brystkreft celle invasjon [7]. Rho /Rock signale fremmer svulst celle migrasjon og invasjon ved å regulere fokale vedheft dynamikken gjennom caveolin-en fosforylering [8]. FAK fremmer også fokal adhesjon demontering og kreft invasjon [9], [10], [11]. Focal vedheft dynamikk og signalveier som regulerer denne prosessen kan være derfor et attraktivt mål for kreftbehandling.
Mange molekyler har vist seg å regulere fokale vedheft dynamikken. FAK regulerer fokal adhesjon omsetningen [9], [12], sannsynligvis ved en dynamin og mikrotubuli-avhengige reaksjonsveien [13]. Paxillin, et samlings vedheft adapter, modulerer også fokale vedheft dynamikken av JNK og PAK-mediert fosforylering [14], [15]. Talin aktiverer integriner og initierer fokal adhesjonsdannelse [16], [17], [18], mens spalting av talin av kalpain medierer fokal adhesjon demontering [19]. Kalpain også spalter FAK og paxillin å modulere fokal adhesjon dynamikk [20], [21]. Vi har vist at Smurf1-mediert ubiquitinering av Talin hode domene, en av de to spaltningsproduktene, spiller en viktig rolle i fokal adhesjon demontering og cellevandring [22]. ACF7, en mikrotubuli og filamentøs actin-bindende protein, regulerer fokal adhesjon montering /demontering gjennom sin ATPase-aktivitet [23]. Imidlertid er de molekylære mekanismene som styrer fokal adhesjon montering /demontering ikke fullt ut forstått.
fosfatidylinositol fosfat kinase type I y (PIPKIγ) er et enzym som katalyserer ATP-avhengig fosforylering av fosfatidylinositol 4-fosfat (PI (4- ) P) for å generere PI (4,5) P
2, som regulerer en rekke biologiske prosesser, inkludert fokal adhesjonsdannelse [24]. PIPKIγ har en godt bevart kinase katalytiske domenet på den sentrale regionen [25]. Innenfor det katalytiske domene, er det en underdomene som kalles aktiverings løkke, som bestemmer stedet for fosforylering på inositol ring av substratet. PIPKIγ interagerer sterkt med talin og konkurrerer om binding med den Talin β integrin halen [26], [27]. Det er lokalisert på adherens veikryss i epitelceller [28], [29]. Det har blitt rapportert at PIPKIγ er nødvendig for fokal adhesjonsdannelse i migrerende celler [30]. Imidlertid er den nøyaktige roller for de lipid-kinase-aktiviteter PIPKIγ i kontaktklebe dynamikk ikke definert.
I den foreliggende studien undersøkte vi kravet til lipid-kinase-aktiviteten til PIPKIγ i fokale klebe dynamikk og tykktarmskreft invasjon . Våre resultater identifisere en viktig rolle PIPKIγ i fokus vedheft montering /demontering og kreft invasjon.
Resultater
PIPKIγ fremmer brennvidde heft formasjon
For å undersøke en mulig rolle for PIPKIγ i fokal adhesjonsdannelse, CHO-K1-celler ble transfektert med EGFP-PIPKIγ eller EGFP vektor, respektivt. Cellene ble på nytt utplatet på fibronektin, fiksert med paraformaldehyd, inkubert med et anti-paxillin monoklonalt antistoff, og deretter farget med Dylight 549-konjugert geit-anti-mus IgG. Fokal adhesjon ble stilt opp rundt kantene av vektor EGFP-transfekterte celler, med få fokal adhesjon i sentrene til cellene, mens PIPKIγ uttrykk dramatisk stimulert fokal adhesjonsdannelse i sentrene til cellene (Fig. 1A). Over-uttrykk for PIPKIγ stimulerer en økning i fokale heft tall (figur 1B.) Og økningen var i hovedsak bidratt med små fokale sammenvoksninger ( 3 mikrometer
2) (Fig. 1C). Stimulering av fokale vedheft formasjon ved PIPKIγ avhengig av sin interaksjon med Talin, fordi PIPKIγ
W647F, en mutant som er mangelfull i samspillet med Talin, var ikke i stand til å fremme fokal vedheft formasjon (fig 1A, B, C).
(A) TIRF bilder av CHO-K1 celler som uttrykker EGFP, EGFP-PIPKIγ WT eller EGFP-PIPKIγ
W647F. Cellene ble transient transfektert med pEGFP-vektor, -PIPKIγ WT eller -PIPKIγ
W647F, og deretter farget for paxillin. Scale bar, 20 mikrometer. (B) Uttrykk for PIPKIγ men ikke PIPKIγ
W647F medført en økning i brennvidde heft antall (n = 15, error bar = gjennomsnitt ± SEM, Vector
vs
WT, P 0,001; WT
vs
W647F, P 0,001; Vector
vs
W647F, P 0,05). (C) Areal fordeling av fokale sammenvoksninger i celler som uttrykker EGFP, EGFP-PIPKIγ WT eller EGFP-PIPKIγ
W647F.
PIPKIγ kinase aktivitet er nødvendig for stimulering av fokale vedheft formasjon
PI (4,5) P
2 binder Talin og styrker samspillet mellom Talin og β inte halen, stimulerende inte clustering [31]. PI (4,5) P
2 binder også vinculin og avslører de aktin og Talin bindingsseter på vinculin, fremme brennvidde heft formasjon [32]. Derfor PIPKIγ-stimulert PI (4,5) P
2 syntese kan være avgjørende for å fremme fokal adhesjonsdannelse. For å teste denne hypotesen, mutert vi to lysinresidier, K188 og K200, til arginin rester innenfor ATP-bindingssetet av PIPKIγ. Mutant PIPKIγ
K188,200R og WT ble renset fra CHO-K1 celler og kinase aktivitet ble undersøkt
in vitro
ved hjelp av massespektrometri til å kvantifisere produksjon av PI (4,5) P
2 fra PI (4) P. Som vist på fig. 2A, mutasjon i K188 og K200 redusert kinase-aktivitet med 95%. EGFP-merket mutant PIPKIγ
K188,200R og WT PIPKIγ ble stabilt uttrykt i CHO-K1 celler og deres virkninger på samlings heft formasjon ble undersøkt etter paxillin farging. Celler som stabilt uttrykker WT PIPKIγ dannet fokale sammenvoksninger rundt kantene og i sentrene av celler, mens celler som uttrykker PIPKIγ
K188,200R, lik foreldre celler, besatt små fokale sammenvoksninger, hvorav de fleste var rundt kantene av celler, og hadde en defekt i å spre (fig. 2B). Kvantitativ analyse indikerte at PIPKIγ økte focal sammenvoksninger av mer enn to ganger, mens PIPKIγ
K188,200R ikke i betydelig grad fremmer fokal adhesjonsdannelse (figur 2C . D). Disse resultatene indikerer at PIPKIγ aktivitet er viktig for midt vedheft formasjon i CHO-K1 celler.
(A) Analyse av virksomheten til PIPKIγ og PIPKIγ
K188,200R. (B) TIRF bilder av CHO-K1 celler som uttrykker PIPKIγ eller PIPKIγ
K188,200R og foreldre CHO-K1 celler. Foreldreceller og celler som uttrykker EGFP-PIPKIγ WT eller -PIPKIγ
K188, 200R ble farget for paxillin. Scale bar, 20 mikrometer. (C) Kvantitativ analyse av fokale vedheft tall (per celle) i foreldreceller og celler som uttrykker PIPKIγ eller PIPKIγ
K188,200R (n = 30, error bar = gjennomsnitt ± SEM, foreldre vs PIPKIγ, P 0,001; foreldre vs PIPKIγ
K188,200R, P 0,05). (D) Areal fordeling av fokale sammenvoksninger i foreldreceller og celler som uttrykker PIPKIγ og PIPKIγ
K188,200R.
For ytterligere å bekrefte kravet om PIPKIγ aktivitet for fokale vedheft formasjon, vi testet kapasitet av en annen kinase død mutant, for å PIPKIγ
D316K [33], fremme fokal adhesjonsdannelse som beskrevet ovenfor. Som vist på fig. S1, det gjennomsnittlige fokal adhesjon nummer (per celle) i celler som uttrykker PIPKIγ
D316K var tilnærmet 45, som er tilnærmet den samme som den i celler som uttrykker EGFP-vektor (Fig. 1). Den knutepunkter sammenvoksninger i celler som uttrykker PIPKIγ
D316K akkumulert på kantene av cellene, med svært få fokal adhesjon i sentrum av cellene. Dette resultatet bekrefter avgjørende rolle PIPKIγ aktivitet i fokus heft formasjon.
Aktiviteten av PIPKIγ er avgjørende for dens fremme fokale vedheft dynamikken
For å undersøke om PIPKIγ lipid kinase aktivitet er nødvendig for focal vedheft dynamikk, CHO-K1 celler som stabilt uttrykker EGFP-PIPKIγ eller -PIPKIγ
K188,200R ble transfektert med mDsRed-paxillin og deretter belagt på Mattek retter (med et glass dekk nederst) forhåndsbelagt med fibronektin (5 mikrogram /ml ) og dyrket i 3 timer. TIRF bilder av mDsRed-paxillin ble tatt ved bruk av et Nikon TIRF mikroskop, og temperaturen ble holdt ved 37 ° C under anvendelse av en INU-TIZ-F1 mikroskop inkubasjon system (Tokai Hit). Bilder ble tatt opp på en-minutters intervaller for en 120 minutters periode. Focal vedheft montering og demontering hastighetskonstanter ble beregnet som beskrevet tidligere [22]. FA montering og demontering hastighetskonstanter i celler som uttrykker PIPKIγ
K188,200R var 0,083 ± 0,014 og 0,072 ± 0,010 min
-1, respektivt, som er lik de hos normale CHO-K1 celler som vi tidligere har rapportert [ ,,,0],22], mens FA montering og demontering hastighetskonstanter var 0,190 ± 0,019 og 0,136 ± 0,014 min
1, henholdsvis i celler som uttrykker WT PIPKIγ (fig. 3). Dette resultatet indikerer at det inositol lipid-kinase-aktiviteten til PIPKIγ er nødvendig for dets stimulering av fokal adhesjon montering og demontering.
(A) CHO-K1-celler som stabilt uttrykker PIPKIγ eller PIPKIγ
K188,200R ble transient transfektert med mDsRed-paxillin. Cellene ble sådd ut på fibronectin og dynamikken i paxillin ble analysert ved anvendelse av time-lapse TIRF mikroskopi. Pilspisser peker til dynamisk (øverste panelene) og stabile (nedre paneler) fokale sammenvoksninger. (B) Den overlegg fra 0 og 24 min i «A». (C) Kvantifisering av de fokale vedheft montering og demontering hastighetskonstanter i celler som uttrykker PIPKIγ eller PIPKIγ
K188,200R. Kvantifiseringen er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. 50 fokale sammenvoksninger fra 10 celler. Montering, WT vs K188,200R, P 0,00005; demontering, p. 0,005
En viktig rolle for PIPKIγ i fokal vedheft formasjon i tykktarm kreft celler
Focal voksninger har vært innblandet i å regulere kreft invasjon, mens rollen som fokale sammenvoksninger i tykktarm kreft celler er ikke godt definert. For å avgjøre om aktiviteten til PIPKIγ påvirker brennvidde heft formasjon i tykktarm kreft celler, HCT116-celler som stabilt uttrykker EGFP-PIPKIγ eller -PIPKIγ
K188,200R ble belagt på fibronektin og farget for paxillin. Som vist på fig. 4A, de fleste av knutepunktene adhesjoner ble lokalisert til den perifere området, og HCT116-celler som uttrykker PIPKIγ
K188,200R hadde mye færre knutepunkter sammenvoksninger enn de som uttrykker WT enzymet. Den gjennomsnittlige fokal adhesjon nummer i celler som uttrykker WT PIPKIγ var 22,5 /celle, mens at i celler som uttrykker PIPKIγ
K188,200R var 11,5 /celle, som begge var mindre enn de som ble observert i CHO-K1-celler (Fig. 4B) . I tillegg PIPKIγ
K188,200R hadde mer effekt på de mindre brennvoksninger enn de større (fig. 4C).
(A) TIRF bilder av CHO-K1 celler som uttrykker PIPKIγ eller PIPKIγ
K188,200R. Celler som stabilt uttrykker EGFP-PIPKIγ WT eller -PIPKIγ
K188, 200R ble farget for paxillin. Scale bar, 20 mikrometer. (B) PIPKIγ
K188, 200R mislyktes i å stimulere til økt fokus vedheft antall (n = 10, error bar = bety verdier ± S.E.M., paret t-test, p 0,005). (C) Areal fordeling av fokale sammenvoksninger i celler som uttrykker PIPKIγ og PIPKIγ
K188,200R.
For å teste om PIPKIγ er avgjørende for fokus vedheft formasjon i HCT116 cellene, ble HCT116-celler infisert med rekombinant lentiviruses som uttrykker PIPKIγ shRNA eller shRNA kontroll og ble valgt med puromycin. Som vist på fig. 5A, ekspresjon av PIPKIγ shRNA resulterte i dramatisk reduksjon i den endogene PIPKIγ nivået av HCT116-celler. Cellene ble deretter sådd ut på fibronektin og farget for paxillin. Overraskende, PIPKIγ knockdown nesten opphevet fokal adhesjonsdannelse i HCT116-celler (Fig. 5B). PIPKIγ uttømming redusert brennvidde heft antall med ca 74% (Fig. 5C). Forskjellig fra PIPKIγ
K188,200R, PIPKIγ shRNA hadde mer effekt på de større knutepunktene voksninger enn de mindre (Fig. 5D). Disse resultatene indikerer en viktig rolle for PIPKIγ i fokal adhesjonsdannelse i HCT116 tykktarmskreftceller. Denne dramatiske effekten av PIPKIγ knockdown forekom ikke i MDA-MB-231 humane brystcancerceller, hvor PIPKIγ knockdown bare delvis inhiberte fokal adhesjonsdannelse (data ikke vist).
(A) Ekspresjon av PIPKIγ i celler som stabilt uttrykker shRNA kontroll og PIPKIγ shRNA. (B) TIRF bilder av HCT116-celler som stabilt uttrykker kontroll og PIPKIγ shRNA. Celler ble infisert med lentiviral partikler som bærer kontroll eller PIPKIγ shRNA, valgt med puromycin, og farget for paxillin. Scale bar, 20 mikrometer. (C) PIPKIγ uttømming inhiberte fokal adhesjonsdannelse i HCT116-celler. (N = 10, error bar = gjennomsnitt ± SEM, paret t-test, P 0,0001). (D) Areal fordeling av fokale sammenvoksninger i celler som uttrykker kontroll og PIPKIγ shRNA
PIPKIγ positivt modulerer vedheft styrken i tykktarm kreft celler til fibronektin
for å undersøke om aktiviteten til PIPKIγ regulerer celle adhesjon styrke på fibronectin, HCT116-celler som stabilt uttrykker EGFP-PIPKIγ eller -PIPKIγ
K188,200R ble farget med calcein-AM og utsådd på en 96-brønns plate som var forhåndsbelagt med forskjellige konsentrasjoner av fibronektin. Den calcein fluorescens ble avlest, og deretter ble platen ble invertert og sentrifugert ved 150 x g i 5 min. Den calcein fluorescens ble lest på nytt. Som vist på fig. 6A, den celleadhesjon styrkeforskjell mellom de celler som uttrykker PIPKIγ
K188,200R og WT var ikke signifikant ved høye konsentrasjoner av fibronection. Men ved lave konsentrasjoner av fibronektin, i celler som uttrykker PIPKIγ
K188,200R hadde signifikant lavere heftfasthet sammenlignet med dem som uttrykker WT. PIPKIγ knockdown også forårsaket en signifikant reduksjon i celleadhesjon styrke i HCT116-celler (fig. 6B). Disse resultatene indikerer at PIPKIγ aktivitet regulerer celle adhesjon styrke i tykktarm kreft celler.
(A) Uttrykk for PIPKIγ
K188,200R hemmet HCT116 cellene fester seg til lave konsentrasjoner av fibronektin. Cellene som stabilt uttrykker PIPKIγ eller PIPKIγ
K188,200R ble inkubert med Calcein-AM og sådd ut på en 96-brønners plate belagt med fibronektin for sentrifugeringsanalyser. (B) Nedbryting av PIPKIγ hemmet HCT116 cellene fester seg til fibronektin. De celler som stabilt uttrykker kontroll og PIPKIγ shRNA ble inkubert med Calcein-AM og sådd ut på en 96-brønners plate belagt med fibronektin for sentrifugeringsanalyser. F
a /F
0 = (fluorescens etter sentrifugering) ÷ (fluorescens før sentrifugering).
PIPKIγ er avgjørende for invasjonen, men ikke migrering av tykktarmskreftceller
Det har blitt rapportert at PIPKIγ spiller en rolle i celle migrasjon. For å teste hvorvidt PIPKIγ regulerer overføringen av HCT116 tykktarmskreftceller, benyttet vi tidsbortfalt sårhelende analyser for å undersøke overføringen av HCT116-celler som uttrykker EGFP-PIPKIγ og -PIPKIγ
K188,200R, henholdsvis, i nærvær av HGF . Som vist på fig. S2 A og B, kan celler som uttrykker PIPKIγ
K188,200R migrerte noe raskere enn de som uttrykker WT enzym som målt ved hjelp av time-lapse sårhelende analyser. Også uttømming av PIPKIγ hadde ingen signifikant virkning på migrering av HCT116-celler i Transwell-analyser (fig S2 C . D). Disse resultatene tyder på at PIPKIγ aktivitet er ikke avgjørende for migrering av HCT116 tykktarmskreftceller.
For å teste hvilken rolle PIPKIγ i kreft invasjon, invasjonen av HCT116-celler som stabilt uttrykker PIPKIγ shRNA eller en shRNA kontroll i fravær og nærvær av HGF ble undersøkt ved hjelp av Matrigel invasjons analyser. Som vist på fig. 7 (A og B), PIPKIγ knockdown resulterte i signifikant reduksjon i invasjonen av HCT116-celler, enten i fravær eller i nærvær av HGF. Basal og stimulert HGF-invasive kapasiteter på HCT116-celler som stabilt uttrykker PIPKIγ
K188,200R er også betydelig lavere enn for de celler som uttrykker WT enzym (figur 7C . D). Disse resultatene indikerer at PIPKIγ positivt regulerer invasjonen av HCT116 tykktarmskreftceller.
(A) Nedbrytning av PIPKIγ ved hjelp shRNA hemmet invasjonen av HCT116-celler. Invasiv kapasitet på celler som stabilt uttrykker shRNA kontroll eller PIPKIγ shRNA ble undersøkt i fravær og nærvær av HGF (50 ng /ml) av Matrigel-baserte invasjons analyser. (B) Kvantifisering av invasjonen av HCT116-celler som stabilt uttrykker shRNA kontroll eller PIPKIγ shRNA. n = 5, error bar = bety verdier ± S.E.M.; ctrl vs PIPKIγ, p 0,01; ctrl HGF vs PIPKIγ HGF, p 0,01. (C) Uttrykk for PIPKIγ
K188,200R hemmet invasjonen av HCT116-celler. Cellene som stabilt uttrykker EGFP-PIPKIγ eller -PIPKIγ
K188,200R ble testet for invasive kapasiteter i fravær og nærvær av HGF. (D) Kvantifisering av invasjonen av HCT116-celler som stabilt uttrykker EGFP-PIPKIγ eller -PIPKIγ
K188,200R. n = 3, error bar = bety verdier ± S.E.M.; WT vs K188,200R, P 0,01; WT HGF vs K188,200R HGF, P . 0.005
PIPKIγ regulerer brennvidde heft formasjon gjennom aktivering vinculin av PI (4,5) P
2
For å dissekere mekanismen som PIPKIγ regulerer brennvidde heft formasjon, vi dro ut for å analysere nivået av polyphosphoinositides i HCT116-celler som uttrykker PIPKIγ shRNA eller en shRNA kontroll ved hjelp av massespektrometri. Uttømming av PIPKIγ i HCT116-celler hadde ingen signifikant effekt på nivået av PIP, men forårsaket signifikant reduksjon i PIP
2 nivå (merk at disse metodene ikke kan skille posisjon enantiomerer av disse lipider, så det er mulig at PI (3,4) P
2 kan bidra vesentlig til restnivået av PIP
2 i disse cellene). Interessant, til støtte for denne ideen knockdown av PIPKIγ redusert PIP
3 nivåer under deteksjonsgrensen for analysen vår (Fig. 8). Disse resultatene indikerer at PIPKIγ er en nøkkelenzymet som er ansvarlig for produksjon av PI (4,5) P
2 og PI (3,4,5) p
3 i HCT116-celler.
Polyphosphoinositides fra celler som stabilt uttrykker shRNA kontroll eller PIPKIγ shRNA ble ekstrahert og derivatisert ved hjelp av trimetylsilyldiazometan, og deretter ble målt ved hjelp av massespektrometri. N = 4, error bar = bety verdier ± S.E.M.; PIP, P 0,05; PIP2, P = 0,0034; PIP3, P = 0,001.
For å se om PI (3,4,5) P
3 er viktig for fokale vedheft formasjon i tykktarm kreft celler, ble HCT116-celler behandlet med LY294002, en spesifikk hemmer av fosfatidylinositol 3-kinase, og fokal adhesjonsdannelse i disse celler ble undersøkt etter paxillin farging. LY294002 (20 uM) hadde ingen signifikant effekt på fokal adhesjonsdannelse (data ikke vist). Tatt sammen med de ovenfor angitte observasjoner, tyder dette funn at PI (4,5) P
2, men ikke PI (3,4,5) p
3, er nødvendig for fokal adhesjonsdannelse.
PI (4,5) P
2 binder og aktiverer vinculin og er innblandet i å regulere brennvidde heft formasjon [32]. Hvis PIPKIγ-mediert produksjon av PI (4,5) P
2 er viktig for midt vedheft formasjon i HCT116 cellene, ville uttømming av PIPKIγ redusere PI (4,5) P
2 nivåer og hindre vinculin fra lokalisere til fokale sammenvoksninger. For å teste denne hypotesen, ble endogene PIPKIγ fattige celler infisert med retrovirus uttrykker et kodon-modifisert PIPKIγ (redning) (Fig. 9A), og cellene ble farget for vinculin. Vinculin sjelden ble lokalisert til fokal adhesjon i PIPKIγ-utarmede HCT116-celler, mens det gjen ekspresjon av PIPKIγ i PIPKIγ-uttømte celler resulterte i en dramatisk økning i fokal adhesjon-lokaliserte vinculin (Fig. 9B). Kvantitativ analyse indikerte at PIPKIγ redningsgjen fokal adhesjonsdannelse i PIPKIγ-uttømte celler (figur 9C . D), sammenlignet med dataene i fig. 5. Disse data antyder at PIPKIγ kan regulere brennvidde heft formasjon gjennom PI (4,5) P
2-mediert vinculin aktivering.
(A) Re-uttrykk for redning ZZ-merket PIPKIγ i celler som PIPKIγ har blitt slått ned (KD) av stabilt uttrykker PIPKIγ shRNA. De PIPKIγ-KD celler ble infisert med retrovirale partikler som bærer rednings ZZ-merket PIPKIγ valgt med neomycin. ZZ-PIPKI ble påvist ved Western blotting med et anti-PIPKIγ polyklonalt antistoff. (B) TIRF bilder av PIPKIγ-KD KD celler og celler som uttrykker rednings PIPKIγ Cellene ble sådd ut på glassbunn retter forhåndsbelagt med fibronektin (5 ug /ml), fiksert og farget for vinculin. Scale bar, 20 mikrometer. (C) PIPKIγ redning restaurert brennvidde heft formasjon i PIPKIγ-KD celler. (N = 11, error bar = gjennomsnitt ± SEM, paret t-test, P 0,0001). (D) Areal fordeling av fokale sammenvoksninger i PIPKIγ-KD celler og KD celler som uttrykker redning PIPKIγ
diskusjon
i tillegg til å tjene som forløper for andre andre budbringere, PI (4,5) P
2 i seg selv binder mange cytoskeletal og fokal adhesjonsproteiner og antas å være en viktig regulator av fokal adhesjon dynamikk [ ,,,0],34]. PI (4,5) P
2 binder vinculin å avdekke Talin-bindingsseter på vinculin [32]; det binder også Talin dermed stabil Talin-inte interaksjoner [35]. PIPKIγ er antatt å være den enzym som genererer PI (4,5) P
to romlig og tidsmessig for fokal adhesjonsdannelse i løpet av cellevandring [27], [34]. På den annen side, PI (4,5) P
2 ikke har blitt detektert ved fokal adhesjon og rollen til PIPKIγ i regulering av kontaktheft dynamikk er kontroversiell [36]. PIPKIγ har vist seg å være nødvendig for fokal adhesjonsdannelse i løpet av EGF-stimulert cellemigrasjon [30], mens det har også blitt rapportert at ekspresjon av PIPKIγ forårsaket celleavrunding og fokal adhesjon demontering [26].
Vi viser her at ekspresjon av PIPKIγ i lave nivåer i CHO-K1-celler stimulert fokal adhesjonsdannelse (fig. 1), mens kinase-død mutanter, PIPKIγ
K188,200R og PIPKIγ
D316K mislyktes i å fremme fokal adhesjonsdannelse (fig . 2, fig. 4 og fig. S1). Videre PIPKIγ knockdown nesten fullstendig opphevet fokal adhesjonsdannelse i HCT116 tykktarmskreftceller (Fig. 5). I tillegg uttrykk for PIPKIγ fremmet brennvidde heft montering og også demontering priser, mens PIPKIγ
K188,200R var ute av stand til å gjøre det (Fig. 3). Disse resultatene identifisere en viktig rolle PIPKIγ i å regulere fokale vedheft dynamikken.
Selv om direkte bevis mangler, PI (4,5) P
2 har blitt godt innblandet i å regulere inte aktivering. PI (4,5) P
2 binder Talin og blokkerer sin selv hemming (interaksjon hode-hale) og dermed fremme sin interaksjon med β inte tail [35]. Det stimulerer også inte clustering [31]. Økningen i både Talin-inte samhandling og inte clustering skal stimulere inte aktivering. Vi har funnet at HCT116-celler som uttrykker PIPKIγ
K188,200R ha betydelig lavere klebestyrke sammenlignet med de som uttrykker WT, og uttømming av PIPKIγ ved shRNA også forårsaket en signifikant reduksjon i celleadhesjon styrke i HCT116-celler (fig. 6), som tyder på at PIPKIγ kan modulere integrin-aktivering i tykktarmskreftceller.
Det har blitt rapportert at PIPKIγ er nødvendig for EGF-stimulert migrering av MDA-MB-231 humane brystcancerceller og humane HeLa eggstokkreft celler [30] [37]. Men våre resultater her viser at verken uttrykke PIPKIγ
K188,200R, en kinase-døde mutant eller uttømming av PIPKIγ hemme migrering av HCT116-celler (fig. S2). MDA-MB-231 og Jakten celler migrere mye raskere enn HCT116-celler, noe som tyder på at PIPKIγ er avgjørende for rask bevegelse celler, men ikke for sakte migrerende celler som HCT116-celler. Dette støttes av vår upublisert resultat at PIPKIγ
K188,200R dramatisk hemmer migrasjon av Clone A-celler,.
På den annen side synes en rask bevegelse tykktarmskreft cellelinje PIPKIγ å være nødvendig for invasjonen av begge hurtig (for eksempel MDA-MB-231) og sakte-invasjon (for eksempel HCT116) kreftceller. Uttømming av PIPKIγ har vist seg å inhibere EGF-stimulert invasjon av MDA-MB-231-celler [37], og enten uttrykker PIPKIγ
K188,200R eller uttømming av PIPKIγ hemmer invasjon av HCT116-celler (fig. 7). Disse resultatene indikerer en viktig rolle i å kontrollere PIPKIγ kreft invasjon.
Tidligere studier har fokusert på rollen av fokal adhesjon demontering ved regulering av kreft invasjon. DRR fremmer glioma invasjon ved å fremme brennvidde heft demontering [6]. Filamin En undertrykker brystkreftcelle invasjon ved å hemme fokal adhesjon demontering [7]. FAK fremmer også brennvidde heft demontering og kreft invasjon [9]. Men resultatene viser at både ekspresjon av PIPKIγ
K188,200R, den kinase-død mutant, og uttømming av PIPKIγ svekke fokal adhesjonsdannelse, som følger med inhibering av invasjon av HCT116 (Fig. 4, 5 og 7). I tillegg stimulerer PIPKIγ både fokal adhesjon montering og demontering (fig. 3), noe som tyder på at fokal adhesjon omsetningen, noe som krever fokal adhesjon montering og demontering romlig og midlertidig, regulerer invasjon av kreftceller.
PIPKIγ er et viktigste enzymet som styrer polyphosphoinositide metabolisme i HCT116 cellene. PIPKIγ knockdown resulterer i betydelig reduksjon i nivået av PI (4,5) P
2 og avtar PI (3,4,5) p
3 nivåer enda mer i det vesentlige (fig. 8). PI (3,4,5) P
3 spiller en viktig rolle i tumordannelse og kreft metastasering. Imidlertid ikke PIPKIγ knockdown ikke påvirker aktiveringen av Akt, et viktig mål for PI (3,4,5) p
3, i HCT116-celler (data ikke vist), sannsynligvis fordi Akt kan aktiveres ved PI (3, 4) P
2, som ikke er direkte påvirket av PIPKIγ.
Inhibering av PI 3-kinase ved hjelp av LY294002 påvirker ikke fokal adhesjonsdannelse i HCT116-celler, noe som antyder at PI (4,5) P
2 i stedet for PI (3,4,5) p
3 er ansvarlig for PIPKIγ-mediert fokal adhesjonsdannelse. PI (4,5) P
2 fremmer vinculin binding til talin og aktin, og har vist seg å være avgjørende for fokal adhesjonsdannelse [32]. Vårt resultat viser at PIPKIγ regulerer vinculin lokalisering til fokale sammenvoksninger i HCT116-celler (Fig. 9). Til sammen er det mest sannsynlig at PIPKIγ regulerer brennvidde heft formasjon gjennom PI (4,5) P
2-mediert vinculin aktivering.
Kreft invasjonen er en komplisert prosess, som krever romlig og midlertidig regulering av celle -matrix voksninger, cellefremspring og matrise-degradering [38]. PI (4,5) P
2 genereres av PIPKIγ regulerer kreft invasjon gjennom moduler celleadhesjonsprosesser dynamikk. Selv om PI (3,4,5) P
3 er ikke avgjørende for fokale vedheft formasjon, kan det også spille en rolle i andre aspekter av kreft invasjon, sannsynligvis gjennom aktivering av Rac [39].
Materialer og metoder
Reagenser
Anti-paxillin antistoff (klone 5H11) var fra Millipore; Anti-PIPKIγ polyklonale antistoff var fra Cell Signaling Technology; Anti-tubulin antistoff og pLKO1 lentivirus PIPKIγ shRNA (sekvens: CCG GGC AGT CCT ACA GGT TCA TCA ACT CGA GTT GAT GAA CCT GTA GGA CTG CTT TTT G) var fra Sigma; DyLight 549 konjugert geit-anti-mus IgG (H + L) var fra Thermo Scientific; Fibronectin og rekombinant HGF var fra Akron Biotech; Vekstfaktor redusert Matrigel var fra BD Biovitenskap; Plasmidet pEGFP-PIPKIγ var en gave fra Dr. Mark Ginsberg (University of California, San Diego); PFU Ultra var fra Agilent Technologies; DNA-primere ble syntetisert ved Integrerte DNA Technologies.
Plasmid bygging
plasmid pEGFP-PIPKIγ
W647F ble generert av pfu Ultra-basert PCR ved hjelp pEGFP-PIPKIγ som mal og 5′ GAT GAG AGG AGC TTT GTG TAC TCC CCG CTC-3 «/5′-GAG CGG GGA GTA CAC AAA GCT CCT CTC ATC-3» som primere. pEGFP-PIPKIγ
K188,200R og Pzz-PIPKIγ
K188,200R ble opprettet av PCR hjelp pEGFP-PIPKIγ og Pzz-PIPKIγ [40] som maler, henholdsvis, og sekvensielt 5′-GAC GAG TTC ATC ATC AGG ACC GTC ATG CAC-3 «/5′-GTG CAT GAC GGT CCT GAT GAT GAA CTC GTC-3» og 5 «GTT CCT GCA GAG GCT GCT CCC TGG CTA C-3′ /5»-GTA GCC AGG GAG CAG CCT CTG CAG GAA C-3 «som primer.
