Abstract
DNA mismatch repair system (MMR) opprettholder genom stabilitet gjennom anerkjennelse og reparasjon av enkelt-base uoverensstemmelser og små innsetting-sletting sløyfer. Inaktivering av MMR sti fører mikro ustabilitet og akkumulering av genomisk mutasjoner som kan forårsake eller bidra til kreft. Faktisk, 10-20% av visse faste og hematologiske kreftformer er MMR-mangelfull. MMR-mangelfull kreft ikke svare på noen standard av omsorgs kjemoterapeutika grunn av antatt økt toleranse av DNA-skader, fremhever behovet for nye terapeutiske legemidler. Mot dette målet, genererte vi isogene kreftcellelinjer for direkte sammenligning av MMR-dyktige og MMR-manglende celler. Vi konstruerte NCI-H23 lunge adenokarsinomceller for å inneholde en doksycyklin-induserbar shRNA utformet for å undertrykke ekspresjonen av misparringssystemet MLH1, og sammenlignet encellete subkloner som var ikke-induserte (MLH1-dyktig) versus indusert for MLH1 shRNA (MLH1-mangel ). Her presenterer vi karakterisering av disse MMR-induserbare cellelinjer og validere en ny klasse rhodium metalloinsertor forbindelser som differensielt hemmer spredning av MMR-mangelkreftceller
Citation. Bailis JM, Gordon ML, Gurgel JL, Komor AC, Barton JK, Kirsch IR (2013) en induserbar, isogene Cancer Cell linje System for målretting staten Mismatch Repair mangel. PLoS ONE 8 (10): e78726. doi: 10,1371 /journal.pone.0078726
Redaktør: Klaus Roemer, Universitetet i Saarland Medical School, Tyskland
mottatt: 24 juni 2013; Godkjent: 17 september 2013; Publisert: 29 oktober 2013
Copyright: © 2013 Bailis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne takke NIH (GM33309 til JKB) og NSF (fellesskap til ACK) for økonomisk støtte. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Julie Bailis, Marcia Gordon, Jesse Gurgel, og Ilan Kirsch er eller var ansatt i Amgen, Inc. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Genome ustabilitet er et kjennetegn på kreftceller og kan føre til numerisk eller strukturelle endringer i kromosomene (kromosom ustabilitet, eller CIN), eller nukleotid mismatch reparasjon (MMR) mangel (MIN) [1]. Mens CIN kan skyldes tap av funksjon av en rekke cellulære veier, MIN resulterer spesielt defekter i MMR-systemet og er gjenkjennelige med gevinst eller tap av mono-, di- eller tri-nucleotide gjentatte sekvenser, referert til som mikro ustabilitet (MSI) (anmeldt i to). Replication feil som polymerase glidning generere små innsetting-sletting sløyfer (IDLs) eller enkle basis uoverensstemmelser i DNA. DNA-skade kan også endre baser for å forårsake uoverensstemmelser. I menneskelige celler som er MMR-dyktig, heterodimerer som inneholder bakterie muts homolog MSH2 binder en mismatch, og deretter heterodimerer som inneholder bakterie MutL homolog MLH1 forbinder med protein: DNA komplisert å megle rekruttering av reparasjons faktorer som avgiftsdirektoratet misforholdet og gjenoppretter den korrekte DNA-sekvens. MMR-manglende celler er ikke i stand til å korrigere uoverensstemmelser, noe som resulterer i inkorporering av feil i DNA mal og en mutator fenotype.
MMR-mangel er sterkt knyttet til kreft. Germ linje mutasjon av MMR gener, spesielt MLH1 eller MSH2, er grunnlaget for arvelig non-polypose tykktarmskreft (HNPCC), eller Lynch syndrom, som gir mottakelighet for tykktarmskreft, men også til andre spesifikke krefttyper, inkludert livmor og eggstokkreft (anmeldt i 3,4). Mutasjon eller hypermethylation av MMR-gener i somatiske celler er assosiert med omtrent 15% av sporadiske kolorektal kreft, så vel som 10-15% av eggstokkreft, endometrie og mage kreft (gjennomgått i 5). MMR-mangel og MSI har også blitt identifisert i opp til 20% av leukemi hos pasienter som opplever tilbakefall, eller som utvikler sykdommen som en følge av tidligere kjemoterapi [6].
MMR-mangel og MSI forekommer også i primær lungekreft forbundet med røyking eller eksponering for krom [7-9]. Kreftformer med MSI har blitt rapportert å være resistent mot en rekke standard-of-care kjemoterapeutiske midler, slik som den antimetabolitt 5-fluorouracil (5-FU), forbindelser av platina cisplatin og karboplatin, det alkylerende stoff temozolomid, og topoisomeraseinhibitoren etoposid [ ,,,0],10]. Inaktivering av MMR-reaksjonsveien kan tillate cellene å tolerere visse typer DNA-skade uten å utløse en vei av programmert celledød [11].
En utfordring for å identifisere terapier for MMR-manglende kreftformer, er at den molekylære mål og klinisk fenotyper følge av inaktivering av MMR gener er variabel. MMR mangel kan føre til at rammeskiftmutasjoner i gener som inneholder gjentatte sekvenser i DNA, og minst 30 gener har blitt identifisert som mulige mål for MSI, herunder onkogener BRAF og KRAS, og den DNA-skade responsgener MRE11, BRCA1 og ATR [ ,,,0],12,13]. Arbeidet med å identifisere nye terapeutiske mål som viser syntetisk dødelighet med MMR-mangelkreftceller har avdekket variasjon i genetiske mål med tap av funksjon av MLH1 eller MSH2 [14]. Sammen utgjør disse observasjonene støtter ideen om at kreft med MSI representerer en mangefasettert, heterogen sett av sykdommer. I betraktning av kompleksiteten av MSI svulster, vi har tidligere foreslått rettet mot slutten fenotype eller «stat» av mismatch reparasjon mangel seg [15,16].
I dagens innsats er beskrevet her, vårt mål var å utvikle verktøy for å gjøre studier av indusert mismatch reparasjon mangel. Vi beskriver en helt isogen cellelinje system der uttrykk for MMR-genet MLH1 kan slås på eller av med shRNA. Som vår modellsystem vi brukte lunge adenokarsinom NCI-H23, en cellelinje valgt på grunnlag av relativt høye nivåer av MLH1 som kan bli reversibelt inaktivert ved shRNA. I denne studien indusere vi MMR mangel i NCI-H23 cellelinje system og viser at dette resulterer i MSI og øket motstand mot DNA-ødeleggende midler. Som potensiell skritt mot å utvikle en terapeutisk som er rettet mot slutten «stat» av MMR-mangel, vi bruker også denne cellelinjen system for ytterligere validere en ny klasse av metallkomplekser som er rettet mot DNA uoverensstemmelser.
Materialer og metoder
Kort hårnål RNA (shRNA)
Sekvenser spådd å slå ned uttrykk for MLH1 eller MSH2 gener ble utformet ved hjelp BLOCK-IT RNAi Designer (Life Technologies). Fire uavhengige sekvenser for hvert gen ble valgt som kandidat shRNA utløser som vist nedenfor (nummerering angir posisjon på cDNA).
MLH1.
362 GCCTGAAGTTGATTCAGATCC
740 GCAGGTATTCAGTACACAATG
928 GGTTACATATCCAATGCAAAC
2237 GCGCTATGTTCTATTCCATCC
MSH2.
399 GCATCCAAGGAGAATGATTGG
1102 GGATTAAGCAGCCTCTCATGG
1260 GCAGCAAACTTACAAGATTGT
2359 GGGCTATATCAGAATACATTG
metoden som brukes for bygging av shRNA kassetter har blitt beskrevet i detalj andre steder [17]. Kort sagt ble shRNA følelse-sløyfe-antisens-konstruksjoner av disse sekvenser generert ved hjelp av PCR, ved bruk TTCATGAGA som sløyfen sekvens. Det endelige PCR produkt, som inneholdt sans-loop-antisense shRNA sekvenser flankert av
attB1
nettstedet og Th1 promoter på 5 «enden, og en oppsigelse signal og
attB2
nettsted på 3′-enden, ble så klonet inn i vektoren Gateway pDONR (Life Technologies). Gateway rekombinasjonsteknikker ble deretter brukt til å overføre shRNA kassetter til Gateway-kompatible lentiviral destinasjon vektorer pLV736G eller pLV739G.
Lentiviral aksjer ble fremstilt som beskrevet [17]. 293-Metr celler [18] ble transfektert med en pLV736G eller pLV739G vektor som inneholdt et individ shRNA kassett, sammen med plasmider som inneholder Gag /Pol, Rev, og konv gener. Etter inkubering over natten, ble supernatanten oppsamlet, filtrert, konsentrert ved ultrasentrifugering og lagret ved -80 ° C.
Cellelinje generasjon
NCI-H23-celler erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC ) ble dyrket i RPMI-media med 10% føtalt bovint serum. For lentiviral transduksjon, ble NCI-H23-celler sådd ut ved 2 x 10
4 celler pr ml i 12-brønns plater og inkubert over natten. Media ble sugd fra cellene og erstattet med Opti-MEM media (Life Technologies) som inneholdt 10 mikrogram /ml Diethylaminoethyl-Dextran (GE Healthcare og biovitenskap) og 1-5 x 10
6 transduksjon enheter per milliliter (TU /ml ) av lentivirus. Celler ble transduced med lentivirus inneholder MLH1 shRNA eller MSH2 shRNA. Platene ble inkubert over natten, og deretter medier som inneholder lentivirus ble sugd av og erstattet med friskt RPMI-medium. Etter 1-3 dager (d), ble cellene ekspandert til 6-brønns plater og dyrket i nærvær av seleksjonsmiddel (250 ug /ml G418 for MLH1 og 2,5 ug /ml puromycin for MSH2). 500 ng /ml doksycyklin (Sigma-Aldrich) ble tilsatt til cellene for å indusere ekspresjon av shRNA.
Celler dyrket under seleksjon og med shRNA indusert i minst 2 måneder ble platet til 96-brønners plater i en tetthet på 0,3 celler pr brønn for å velge ut for enkelt celle subkloner. Encellete subkloner ble ekspandert og holdt under seleksjonsbetingelser. Ikke-induserte celler som anvendes for sammenligning med de induserte subkloner ble oppnådd ved å dyrke subklonene i fravær av doksycyklin i minst en uke.
Antistoffer og Western blot
Protein lysater ble fremstilt i lyseringsbuffer ( 50 mM HEPES, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10% glyserol, 1 mM ditiotreitol) til hvilken fosfatase og proteaseinhibitorer (20 mM -glycerophosphate, 100 mM natriumfluorid, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 0,1 mM natriumortovanadat, 10 ug /ml leupeptin) ble tilsatt. Lysates ble klarert av sentrifugering og deretter analysert ved SDS-PAGE på 4-12% Bis-Tris geler (Life Technologies) etterfulgt av immunoblotting. Primære antistoffer som ble brukt var mot MLH1 (Becton Dickinson # 551091), MSH2 (Becton Dickinson # 556349), GAPDH (Abcam # ab9484), fosforylert histon H2AX (Millipore # 05-636) eller tubulin (Cell Signaling # 2148). Primære antistoffer ble detektert med sekundære antistoffer konjugert til IRDye700 eller IRDye800 (licor) og visualisert med licor Odyssey. Hver western blot eksperiment ble utført minst to ganger, på uavhengige dager. Representative data fra et enkelt eksperiment vises.
DNA fragment analyse
Genomisk DNA fra NCI-H23 subkloner ble utarbeidet med en DNeasy kit (Qiagen). Multiplex PCR-reaksjoner ble utført i henhold til MSI Analysis System, versjon 2.1 (Promega). PCR produktene ble analysert på en ABI 3130 sequencer, og deretter dataene ble analysert ved hjelp GeneMapper programvare (Life Technologies). Subkloner som viste MSI i minst ett merke i det første eksperimentet ble testet på nytt i en uavhengig eksperiment for å bekrefte resultatene.
Celleviabilitet analyser
Celler dyrket i fravær eller nærvær av doksycyklin ble belagt ved 2000-5000 celler per brønn i 96-brønners plater og inkubert over natten. Cellene ble deretter behandlet med forbindelser i et doserespons for 4d. Celleviabilitet ble vurdert ved hjelp av en celle Titer-Glo analyse (Promega) for ATP stoffskifte. Cellenes levedyktighet ble utført i duplikat i minst 3 uavhengige eksperimenter. Representative data fra et slikt eksperiment er vist.
Fase kontrast avbildning av celler i løpet av spredningsforsøk ble utført ved hjelp av en IncuCyte med en 20X objektiv (Essen BioScience).
kolonidannende analyser ble også brukt for å teste cellenes levedyktighet etter behandling med forbindelsen. Celler dyrket i fravær eller nærvær av doksycyklin ble platet ut ved 500-2000 celler per brønn i en 6-brønns plate og inkubert over natten. Celler ble behandlet med forbindelser i et doserespons i 24 timer (h), og deretter ble mediet aspirert og erstattet med friskt medium som ikke inneholdt forbindelsen. Kolonier ble visualisert med krystallfiolett flekk 10-12d
Senescence forbundet beta-galaktosidase (SA – gal). Produksjonen ble vurdert ved hjelp av en histokjemisk flekk for beta-galaktosidase aktivitet ved pH 6,0 (Sigma-Aldrich) . Cellene var ubehandlet eller behandlet med forbindelser som angitt for 3d, og deretter ble cellene fast, farget for SA -. Gal og avbildes med en Zeiss Axio invertert mikroskop utstyrt med et fargekamera
Statistisk analyse
for celleviabilitet analysene, ble paret t tester brukes til å sammenligne halv maksimal hemmende (IC
50) eller median dødelig dose (LD
50) verdier fra flere eksperimenter og bestemme p-verdier. P-verdier lik eller mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Statistisk analyse ble gjort med Graph Pad Prism programvare.
Microarray analyse
Total RNA ble fremstilt fra duplikate prøver av celler i log vekstfase, ved hjelp av en RNeasy mini kit (Qiagen). Prøve integritet ble vurdert på en BioAnalyzer. Cy3- og Cy5-merket RNA ble fremstilt fra 200 ng total RNA per prøve, og deretter hybridisert til menneske hele genomet Arrays (Agilent Technologies) i henhold til Agilent Two-Color Mikromatrise-basert Gene Expression Analysis Protocol. Data ble analysert i Rosetta Resolver.
Kjemiske forbindelser
Syntese av [Rh (HDPA)
2chrysi]
3+ og [Rh (DIP)
2chrysi]
3+ har blitt beskrevet [19,20]. Syntesen av [Rh (DPE) (phen) (Chrysi)]
3+ ble nylig rapportert [21]. Cisplatin, doksorubicin, etoposid, 6-tioguanin og temozolomid ble oppnådd fra Sigma-Aldrich og oppløst i DMSO eller vann. Den CDK4 /6 hemmer PD-0332991 [22], som brukes som en positiv kontroll for senescence analyser, ble syntetisert ifølge publiserte metoder.
Resultater
Hemming av MLH1 av shRNA reduserer MLH1 protein nivåer
NCI-H23 lunge adenokarsinom cellelinje er dyktig for mismatch reparasjon og inneholder relativt høye nivåer av MMR proteiner MLH1 og MSH2 [23]. Med mål om å generere et tilpasset system som induserer MMR-mangel og tillater direkte sammenligning til MMR-dyktig celler, testet vi om uttrykket av disse MMR proteiner kan bli nedregulert av shRNA. NCI-H23-celler ble transdusert med lentivirus inneholdende induserbar shRNA til MLH1 eller MSH2, og celler som stabilt integrert konstruksjonen i genomet ble valgt ut og ekspandert. Under normale vekstbetingelser, er det integrerte shRNA var ikke aktiv og MMR proteinene fortsatte å bli uttrykt. Ekspresjon av shRNA ble regulert ved å behandle cellene med doksycyklin. Når shRNA ble indusert, protein lysater fra celler som inneholdt en hvilken som helst av de fire shRNA-konstruksjonene mot MLH1 viste nesten fullstendig (mer enn 90%) hemming av MLH1 protein (figur S1). I motsetning til dette ble det MSH2 proteinet bare delvis redusert etter induksjon av en hvilken som helst av de fire MSH2 shRNA-konstruksjonene i NCI-H23-celler (figur S1), og disse celler ble ikke ytterligere karakterisert.
På grunn av muligheten for variasjon av shRNA ekspresjon i en cellepopulasjon, vi isolert og karakterisert encellete subkloner fra NCI-H23-celler transdusert med en av de shRNA konstruerer, MLH1 928. Celler ble dyrket i nærvær av doxycycline å indusere MLH1 shRNA i minst én måned, og deretter belagt for enkeltceller som ble utvidet til kolonier som ble opprettholdt i induserende betingelser. MMR protein nivåer ble deretter revurderes ved immunoblotting. De NCI-H23 subkloner som uttrykte MLH1 shRNA konsekvent redusert nivåene av MLH1 protein 90%, uten at det påvirker nivåene av MSH2 protein (figur 1).
MLH1 protein nivåer i NCI-H23 subkloner indusert for MLH1 928 shRNA ble sammenlignet med MLH1 protein nivåer i NCI-H23 foreldre celler (H23). Protein lysates ble analysert ved SDS-PAGE og immunoblotting for MLH1 og MSH2 proteinnivåer. GAPDH ble brukt som en kontroll for protein lasting.
nedregulering av MLH1 induserer mikro ustabilitet
Vi har valgt minst 20 subkloner fra NCI-H23 celler som uttrykte MLH1 shRNA å teste for MSI. Genomisk DNA ble fremstilt fra paren NCI-H23-celler og fra hver subklon, og deretter multipleks PCR ble utført for å amplifisere et standard panel av mikrosatellittmarkører (BAT-26, BAT-25, MONO-27, NR-21 og NR-24 ). Fragmentstørrelser på PCR-produktene ble deretter analysert på en DNA-sequencer. Alle de NCI-H23 subklonene viste MSI på mononukleotid gjenta BAT-26 [24], angitt med en forskyvning av 1-3 nukleotider ved locus (fig S2). MLH1 mangel er derfor tilstrekkelig å indusere MSI. En rekke av subklonene som vises også mulig MSI på en annen markør, med uavhengige subkloner som viser endring av forskjellige markører (fig S2). Subkloner 4-10 og 4-13, som ble oppnådd ved transduksjon av NCI-H23 celler med MLH1 928 shRNA konstruere, ble valgt for ytterligere fenotypeanalyser.
nedregulering av MMR gener ved shRNA er reversibel
De NCI-H23 encellede subkloner ble opprettholdt under vekstvilkår som kontinuerlig indusert shRNA uttrykk. For å teste hvorvidt den shRNA-mediert nedregulering av MLH1 var reversibel, ble celler fra hver subklon delt i to separate kulturer, med en kultur opprettholdt i nærvær av doksycyklin for å opprettholde MLH1 mangel, og den andre kulturen dyrket i fravær av doksycyklin å tillate MLH1 uttrykk. Etter en uke ble det proteinlysatene fremstilt fra cellene, og den MLH1 proteinnivå ble undersøkt ved immunblotting. I fravær av doksycyklin, celler fra 4-10 og 4-13 subkloner var i stand til å re-uttrykker villtype-nivåer av MLH1 protein (figur 2). Ikke alle av subklonene ble testet, var i stand til å re-express MLH1 protein etter vekst i fravær av doksycyklin (data ikke vist), noe som tyder på at shRNA i disse subkloner kan bli konstitutivt uttrykt.
NCI-H23 subklonene 4 -10 og 4-13 som ble indusert for MLH1 shRNA ble delt inn i to kulturer, en opprettholdt i induserende betingelser (+ doxycycline) og den andre dyrket i fravær av doksycyklin (-) for å tillate gjen ekspresjon av MLH1. Protein lysater ble fremstilt og analysert ved hjelp av SDS-PAGE etterfulgt av immunoblotting for ekspresjon av MLH1 proteinet. Tubulin ble brukt som en kontroll for lik protein lasting på tvers av prøver.
MLH1-mangel NCI-H23 subkloner ikke vise globale endringer i genuttrykk
Microarray analyse ble utført på NCI-H23 encellete subkloner for å teste om nedregulering av MLH1 av shRNA påvirker ekspresjon av andre gener. Celler fra subklonene 4-10 og 4-13 ble enten holdt i nærvær av doksycyklin å indusere MLH1 shRNA, eller dyrkes i fravær av doksycyklin i minst en uke for å tillate gjen ekspresjon av MLH1. Den parentale cellelinje NCI-H23, enten ubehandlet eller behandlet med doksycyklin, ble inkludert som en kontroll. Total RNA ble isolert fra duplikate prøver av celler fluorescensmerket, og hybridisert til Agilent hele genom matriser. Genuttrykksmønster i ikke-induserte subklonene var lik dem av foreldre NCI-H23-celler, enten ubehandlet eller behandlet med doksycyklin (data ikke vist). Nivåer av MLH1 genet transkripsjon ble redusert omtrent tre ganger i 4-10 og 4-13 subkloner hvor MLH1 shRNA hadde blitt indusert (Figur S3). En mer utbredt genekspresjon signatur forbundet med MLH1 shRNA induksjon ikke komme ut dataene (Figur S3).
MLH1-mangel NCI-H23 subkloner utstillings økt motstand mot cellegifter
Vi neste testet om indusert MMR-mangel kan føre til resistens mot DNA-skadelige stoffer. Vi direkte sammenlignet MMR-mangel NCI-H23 subkloner til MMR-dyktig celler fra samme kloning som ble innhentet ved at cellene til å re-express MLH1. MMR-manglende og MMR-dyktige subkloner ble behandlet med topoisomeraseinhibitoren etoposid eller alkyleringsmidlet temozolomid og cellelevedyktigheten ble bedømt etter 4d (figur 3A, D). MMR-dyktige subklonene, hvori shRNA var ikke-induserte, ikke viste en signifikant forskjell i følsomheten for forbindelsene i forhold til foreldre NCI-H23-celler som enten var ubehandlet eller behandlet med doksycyklin (p = 0,34) (fig S4). For hvert matchende par av celler (for eksempel 4-10 kloning av ikke-induserte sammenlignet med 4-10 indusert), den MLH1-manglende celler var konsekvent minst to ganger mer resistent mot disse forbindelser enn de isogene MLH1-dyktige celler, et funn som er statistisk signifikant (p = 0,04 for celler behandlet med etoposid, og p = 0,01 for celler behandlet med temozolomid) (figur 3A, D). De MLH1-manglende subklonene var også mer resistente overfor tverrbindingsmidlet cisplatin (p = 0,02), den analoge purin 6-tioguanin (p = 0,05), og en annen topoisomerase inhibitor, doksorubicin (p = 0,04) (fig S5). De ca to ganger forskjell i levedyktigheten til MMR-manglende celler versus MMR-dyktige celler in vitro i respons til kjemoterapeutika har blitt rapportert tidligere og vist å oversette til resistens in vivo (anmeldt i 4,10). For å bekrefte at differensial effekt på levedyktigheten er på grunn av tilstedeværelsen eller fraværet av MLH1, brukte vi forskjellige shRNA sekvenser, 362 og 2239, for å hemme MLH1 ekspresjon, og deretter karakterisert celle sensitivitet overfor kjemoterapeutiske medikamenter. Det ble observert at den MLH1-mangel som skyldes induksjon fra disse uavhengig shRNA utløser ført til en tilsvarende økning i motstanden overfor kjemoterapeutiske legemidler sammenlignet med de NCI-H23-celler som uttrykte MLH1 (p = 0,01) (fig S6).
NCI-H23 subkloner som var ikke-induserte eller indusert for MLH1 shRNA ble behandlet med etoposid (A-C) eller temozolomid (D-F). (A, D) celler ble behandlet med forbindelse ved de konsentrasjoner som er angitt, og cellelevedyktigheten ble bedømt ved 4d ved hjelp av en Cell Titer Glo-assay. Grafene viser relativ overlevelse for duplikate prøver fra et enkelt eksperiment. T-tester for å sammenligne IC
50-verdier over flere forsøk bestemmes p-verdiene for p = 0,04 for celler behandlet med etoposid, og p = 0,01 for celler behandlet med temozolomid. (B, E) fasekontrastbilder av celler ved 0t og 96h tidspunkter i løpet av cellenes levedyktighet eksperimentet er vist. Celler ble behandlet med 390 uM etoposid (B), eller 500 pM temozolomid (E). (C, F) Celler ble behandlet med forbindelse i 24 timer ved konsentrasjonene som er angitt, og kolonidannende evne etter utvasking forbindelsen ble vurdert. Grafene viser prosent overlevelse ved 10d for duplikate prøver av celler behandlet med etoposid (C) eller temozolomid (F). Sammenligning av LD
50-verdier på tvers av flere eksperimenter ved t-test bestemt p-verdiene av p = 0,03 for celler behandlet med etoposid, og p = 0,04 for celler behandlet med temozolomid.
For å utforske differensial følsomhet for forbindelsene i mer detalj, avbildes vi cellene over 4d behandlingsperiode av cellenes levedyktighet og analysen undersøkes celletall og morfologi. På det tidspunkt 0h, er cellene i vekstfasen og vises sunn ved fasekontrastavbildning. Men ved 96h, forskjellene mellom de ikke-induserte og induserte subkloner var tydelige: de fleste av de MLH1-dyktige celler som hadde gjennomgått celledød etter behandling med DNA-ødeleggende midler, mens MLH1-manglende celler som fortsatte å proliferere (figur 3B, E). Behandling med DNA-ødeleggende midler ikke påvirke MLH1 ekspresjon i ikke-induserte subklonene, men resulterte i økt ekspresjon av fosforylert histon H2AX, en markør for DNA-fragmentering [25], som tyder på at MLH1-uttrykkende celler som hadde gjennomgått apoptose (figur S7).
Vi undersøkt videre celle overlevelse etter behandling med forbindelsen ved hjelp klonogene analyser. Celler ble behandlet med etoposid eller temozolomid i 24 timer, og utvinning fra forbindelsen behandling ble bedømt ved kolonidannelse etter 10d. De MLH1-manglende NCI-H23 subklonene var mer resistente mot behandling med forbindelsen enn de isogene cellene dyktige for MLH1 (figur 3C, F), som viser en signifikant forskjell i LD
50-verdier (p = 0,03 for etoposid, og p = 0,04 for temozolomid). Sammen utgjør disse resultatene viser en differensial respons til DNA-skader som er basert utelukkende på tilstedeværelse eller fravær av MLH1.
MLH1-mangel NCI-H23 subkloner skjerm økt følsomhet for rhodium metalloinsertor forbindelser
tidligere beskrevet metall-komplekser som ikke-kovalent binder DNA-mistilpasninger med moderat affinitet og høy spesifisitet, på grunn av termodynamiske destabilisering av umake basepar (oversikt i 26). Vi først demonstrerte at denne klassen av forbindelser som fortrinnsvis hemmer proliferasjonen av MMR-manglende celler, ved hjelp av et tilpasset HCT-116 kolorektal kreft cellelinje system og et genetisk system knockout [16,19,21]. Denne tidligere arbeid var grunnlaget og motivasjonen for etableringen av isogene cellelinjer som er beskrevet i denne studien, og førte oss for å teste om rhodium metalloinsertor forbindelser vil også fortrinnsvis hemme levedyktigheten til disse cellene når MMR-mangel ble indusert.
i vår induserbar cellelinje system, rhodium metalloinsertor forbindelsen [Rh (Chrysi) (phen) (DPE)]
3+ preferensielt inhiberes levedyktigheten av induserte MLH1-manglende NCI-H23 subklonene, med minst en tre-fold endring i den cellulære IC
50 i en 4d Cell Titer Glo-analyse i forhold til MLH1-dyktige subkloner (p = 0,01) (figur 4A, B). En annen rhodium metalloinsertor forbindelsen, [Rh (HDPA)
2chrysi]
3+ også fortrinnsvis inhibert proliferasjon av MLH1-manglende celler (figur S8), med en to- til tre-gangers forandring i cellulær IC
50 -verdier (p = 0,02). For å bekrefte at forskjellen skyldes MLH1 mangel snarere enn en off-target effekten av shRNA, vi brukte ekstra, konstruerer uavhengig MLH1 shRNA å nedregulere MLH1 i NCI-H23 celler og bekreftet at de MLH1-manglende celler var fortrinnsvis følsomme for rhodium metalloinsertor forbindelsene (p = 0,01) (fig S9). I motsetning til et beslektet stoff som viser svak binding til feilaktige DNA [Rh (DIP)
2chrysi]
3+ [21] ikke vise en differensial effekt på cellelevedyktigheten til ikke-indusert og indusert NCI-H23 kloner (p = 0,90) (fig S9). Sammen våre data støtter hypotesen om at nedregulering av MLH1 øker celle følsomhet for rhodium metalloinsertor forbindelser.
NCI-H23 subkloner som ble ikke-indusert eller indusert for MLH1 shRNA ble behandlet med rhodium metalloinsertor forbindelsen [Rh (Chrysi) (phen) (DPE)]
3+. (A) Celler ble behandlet ved konsentrasjoner som er angitt, og cellelevedyktigheten ble bedømt etter 4d ved bruk av en Cell Titer Glo-assay. Prosent levedyktighet av duplikate prøver fra et enkelt eksperiment er vist. Den p-verdi ble bestemt som p = 0,01 av en t-test. (B) Fase kontrast bilder av celler behandlet med 5 mikrometer [Rh (Chrysi) (Phen) (DPE)]
3+ på 0h og 96h under celleviabilitet analysen er vist. (C) Cellene ble behandlet med [Rh (Chrysi) (phen) (DPE)]
3+ i 24 timer, og deretter analysert for kolonidannelse etter 10d. Grafene viser prosent overlevelse av duplikate prøver av sammensatte behandlede celler. Den p-verdi ble bestemt som p = 0,01 av en t-test.
Vi har undersøkt mobilnettet morfologi av NCI-H23 subkloner behandlet med [Rh (Chrysi) (Phen) (DPE)]
3+ i den tiden løpet av spredningsanalyser, ved hjelp av fase kontrast bildebehandling. Celler fra MLH1-dyktige og MLH1-mangel subkloner dukket opp frisk og i vekstfasen ved 0h tidspunkt. Ved 96h, hadde de induserte MLH1-dyktige celler fortsatte å spre seg, men færre celler syntes å være under mitose, noe som tyder på en celle syklus forsinkelse eller arrest (Figur 4C). Cellene synes ikke å være senescent, noe som gjenspeiles av mangel på produksjon av SA – gal [26] (data ikke vist). I motsetning til de fleste av de MLH1-manglende celler enten unnlatt å spre seg, eller hadde gjennomgått celledød ved 96h (Figur 4C). Vi har bekreftet at denne differensialeffekt var på grunn av fravær eller tilstedeværelse av MMR i cellene ved å bestemme MLH1 proteinnivåene i celler behandlet med rhodium metalloinsertor forbindelser (figur S10). Den tidligere vist effekt av shRNA induksjon på MLH1 protein uttrykk ble ikke endret ved behandling med rhodium forbindelser (figur S10).
Vi har også bekreftet den økte følsomheten av MLH1-mangel NCI-H23 subkloner til rhodium metalloinsertor forbindelser ved hjelp klonogene analyser. Etter 24 timer behandling med [Rh (Chrysi) (Phen) (DPE)]
3+, de MLH1-mangel NCI-H23 subkloner dannet færre kolonier enn isogene MLH1-dyktige subkloner, viser en signifikant forskjell i LD
50-verdier (p = 0,01) (Figur 4D). Differensial følsomheten i MLH1-manglende subklonene til rhodium metalloinsertor forbindelsene er i overensstemmelse med hypotesen om at disse forbindelser utøver sine effekter ved binding til DNA-mistilpasninger som er til stede i MMR-manglende celler.
diskusjon
MMR veien opprettholder genom stabilitet ved å fremme anerkjennelse og reparasjon av enkle basis uoverensstemmelser og små innsetting-sletting løkker i DNA som stammer fra replikering feil eller DNA-skader. Tap av funksjon av MMR-reaksjonsveien øker forekomsten av cellulære mutasjoner og kan forårsake eller bidra til kreft. Mekanismen for kreftutvikling som følge av arvelig MMR mangel har vært godt studert, særlig i tykktarmskreft [4,27], og har blitt modellert i cellelinje systemer som HCT-116 O celler, som er MLH1 fattig, men inneholder en ekstra kopi av kromosom 2, og HCT-116 N celler, der MLH1 mangel er supplert med en ekstra kopi av kromosom 3 som inneholder villtype MLH1 [28]. I andre krefttyper, for eksempel i lungekreft, kan MMR mangel fremmes av kreftfremkallende eksponering [7-9]. Cellegiftbehandling kan også fremme MMR-mangel fører til sekundær leukemi [6]. Cellelinjen systemet vi beskrive gir det første eksempelet på en isogen modell for indusert MMR-mangel som kan være reversibelt slås på eller av på nivå med kontroll av protein uttrykk. Det gir en modell for å studere spørsmål om indusert MMR-mangel og for å tillate identifikasjon av molekyler som kan tilby terapeutisk fordel i MMR-mangelfull kreft.
NCI-H23 matchet cellelinje systemet beskrevet her tillater detaljert karakterisering av timing og sekvens av hendelser som oppstår når MMR-mangel er indusert. Vi har observert tilsvarende effekter med tre forskjellige shRNA sekvenser målrettet mot MLH1, og i to forskjellige encellete subkloner isolert fra celler transdusert med en av de MLH1 shRNA konstruksjoner.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
