Abstract
For mer enn et tiår, cytokine interleukin-12 (IL-12) har blitt utnyttet, enten alene eller i kombinasjon med andre rusmidler, som en behandling for kreft. De mange anti-tumor egenskaper til IL-12 fremdeles generere interesse i den kliniske anvendelse av dette cytokinet, selv om det har vist toksisitet når det administreres systemisk. Som en tilnærming for å overvinne denne toksisitet, har mange laboratorier forsøkt å indusere IL-12-ekspresjon på stedet av tumoren. Men for tumorer som er vanskelige å fjerne kirurgisk eller for behandling av disseminert metastaser, fortsatt systemisk ekspresjon av dette cytokin som den mest effektive metoden for administrering. Ikke desto mindre, å finne alternative tilnærminger for bruk av IL-12 i behandlingen av kreft og rakne basis av IL-12-bivirkninger forblir en utfordring. I det foreliggende arbeid viser vi at systemisk ekspresjon av IL-12 gjennom hydrodynamisk injeksjon av IL-12-cDNA-er i stand til å fremkalle forskjellige typer av leverlesjoner forbundet med en toksisk patologi. Imidlertid rapporterer vi her at levertoksisitet er redusert og overlevelse av mus forbedret i fravær av tumornekrosefaktor alfa (TNF-alfa). Denne observasjonen er i motsetning til flere murine modeller og kliniske forsøk som postulat interferon gamma (IFNy) som hoved cytokinet er ansvarlig for IL-12 toksisitet. Videre vårt arbeid viser at når IL-12-cDNA er ko-injisert med IL-18-cDNA, eller når mus forbehandlet med en lav dose av IL-12-cDNA før behandling med en høy dose av IL-12-cDNA, systemiske nivåer av TNFa er nesten helt opphevet, noe som resulterer i forbedret overlevelse og mindre leverskader. Viktigere, betyr oppheving av TNFa-signalisering ikke påvirke den sterke anti-tumoraktivitet til IL-12. Således nøytralisere TNFa med antagonister som allerede er godkjent for bruk på mennesker har en lovende tilnærming til å oppheve IL-12 bivirkninger ved bruk av dette cytokinet til behandling av kreft
relasjon:. Barrios B, Baez NS, Reynolds D , Iribarren P, Cejas H, Young HA, et al. (2014) oppheving av TNFa Produksjonen i Cancer Immunterapi er avgjørende for å undertrykke bivirkninger På grunn av systemisk Uttrykk av IL-12. PLoS ONE 9 (2): e90116. doi: 10,1371 /journal.pone.0090116
Redaktør: Irving Coy Allen, Virginia Tech University, USA
mottatt: 11 september 2013; Godkjent: 27 januar 2014; Publisert: 28 februar 2014
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette prosjektet er finansiert delvis med føderale midler fra egenutført Research Program for Senter for Cancer Research, National Cancer Institute (NCI) , National Institutes of Health, og også ved Agencia Nacional de Promoción Científica y TECNOLOGICA (Argentina) og Secretaria de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional de Córdoba (SeCyT-UNC, Argentina). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
immunmodulerende og anti-angiogene funksjoner av IL-12 har gitt begrunnelsen for å utnytte dette cytokin som en kreft agent. Mer enn et tiår siden, kliniske studier administrering av IL-12 for behandling av tumorer, inkludert T-celle lymfom [1], non-Hodgkin lymfom [2], melanom [3], eggstokk-kreft [4], Kaposis sarkom [5] og nyrekreft [6] ble iverksatt. Systemisk IL-12 ble vist å være i stand til å undertrykke tumorvekst, metastase, og angiogenese
in vivo product: [7] – [11], men dens anvendelse har vært forbundet med betydelige dose- og tidsplan-avhengige toksisitet, som representerer en vesentlig hindring for klinisk anvendelse [1], [3], [4], [6], [7]. Grade 1-4 toksisitet, har hemmet anvendelsen av IL-12 som en kreftterapi. Imidlertid alternative fremgangsmåter for bruk av IL-12 er under intens undersøkelse i dyremodeller for kreft og i siste kliniske forsøk [12] – [16]
Flere kliniske studier som anvender IL-12 har vist at økt. nivåene av inflammatoriske cytokin IFNy ble forbundet med ulike grader av levertoksisitet og andre toksiske bivirkninger [2], [4], [6], [17]. Videre i flere murine modeller, IFNy uttrykk indusert etter IL-12 administrasjon ble funnet å være ansvarlig for de fleste av de observerte skadevirkninger [18] -. [21]
Utnytte ulike murine tumormodeller, har vi tidligere rapportert at systemiske nivåer av IL-12 alene eller sammen med IL-18, induserte hydrodynamiske etter injeksjon av de respektive cDNA, helt opphevet subkutan tumorvekst og lunge- og levermetastaser [10]. Videre ko-ekspresjon av IL-12 + IL-18 var i stand til å øke overlevelsen av minskende IL-12-bivirkninger [10]. Vår tidligere arbeid viste også at IFNy var delvis ansvarlig for IL-12-bivirkninger. Videre er våre data viste at økt overlevelse av IL-12 + IL-18-behandlede mus er assosiert med tidlig IL-10-produksjon og en reduksjon av IFNy og TNFa-serumnivåer [10]. I denne sammenheng foreliggende arbeid viser at ved hjelp av hydrodynamisk injeksjon for å indusere systemisk ko-ekspresjon av IL-12 + IL-18-cDNA-er eller ved pre-injeksjon av en lav dose av IL-12-cDNA før en stor dose av IL-12 cDNA, vi observerte signifikant økt overlevelse og redusert levertoksisitet. Interessant, begge metodene viser at denne effekten er sterkt assosiert med oppheving av TNFa uttrykk, en inflammatorisk cytokin som også spiller en patologisk rolle i sepsis sjokk og
in vivo
LPS behandling [22] – [25]. Sammen utgjør de data som presenteres i dette arbeidet bidrar til vår forståelse av grunnlaget for IL-12-systemiske bivirkninger. Videre foreslår at avhengig av hvilket system som benyttes for å indusere systemisk IL-12-ekspresjon; ulike giftige mediatorer kan være hovedpersonene i uønskede bivirkninger. Videre kan data som presenteres i dette manuskriptet tjene som grunnlag for utvikling av nye metoder for å redusere IL-12 toksisitet ved utforming fremtidige behandlinger for kreft behandling som involverer dette cytokin.
Materialer og metoder
mus og cellelinjer
C57BL /6 (B6) mus, 6-10 uker gamle, ble brukt og vedlikeholdt under patogenfrie forhold. Induserbar nitrogenoksid syntase (iNOS) knock out (KO), ble TNFa KO og TNFa reseptor en (TNFαR1) KO mus på en C57BL /6 genetisk bakgrunn kjøpt fra Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA. Animal omsorg ble gitt i samsvar med de prosedyrer som er skissert i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (NIH-publikasjon nr 86-23, 1985). De eksperimentelle protokollene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). Vår Dyreavdelingen har fått NIH dyrevelferd forsikring (forsikring no. A5802-01, Office of Laboratory Animal Welfare, NIH, Bethesda, MD, USA). For å unngå dyrs lidelser, ble mus hurtig avlivet ved cervikal dislokasjon. Under intrasplenic (i.s.) tumorcelleinjeksjon ble en kortere tid for kirurgi anvendt og snittene ble gjort så minimal som mulig under prosedyren. Under utvinning fra kirurgi, ble musene plassert i varme tepper og deres øyne ble hydrert med en saltoppløsning. Dyrene ble plassert i bur tilbake etter fullstendig gjenoppretting av operasjonen.
B16-F10 melanomceller ble erholdt fra American Type Culture Collection. Cellelinjen var fri for Mycoplasma infeksjon og testet med PCR hver 6. måned. B16-F10 melanomceller ble dyrket i DMEM inneholdende 10% FBS, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, og ikke-essensielle aminosyrer ved 37 ° C, 5% CO
2.
Hydrodynamisk cDNA injeksjoner
Den hydrodynamiske genoverføring prosedyren er beskrevet tidligere [10], [26]. I korthet, ble dyrene injisert i halevenen i løpet av mindre enn 8 sekunder med de respektive cDNA oppløst i 1,6 ml steril 0,9% natriumkloridoppløsning og delt inn i 3 grupper, kontroll: 5-15 ug av ORF tom vektorkontroll cDNA, IL- 12: 5 ug IL-12 cDNA (pscIL-12, p40-p35 fusjonsgenet) og IL-12 + IL-18: 5 ug IL-12 cDNA (pscIL-12, p40-p35 fusjonsgenet) pluss 10 ug av IL-18 cDNA (PDEF pro-IL-18). Alle ekspresjonsplasmider utnytte den menneskelige forlengelse 1-α promoter å drive transkripsjonen.
in vivo
effekter observert ved cytokininduksjon er rent på grunn av uttrykk for cytokin cDNA og ikke av LPS forurensning. WT og TLR4 KO-mus utvikler tilsvarende nivåer og kinetikk av TNFa ekspresjon etter IL-12-cDNA behandling således indikerer fravær av LPS i den cytokin-cDNA-preparat som brukes for injeksjon (data ikke vist).
Milt prøvene
for cytokiner analyse av
in vitro
stimulerte celler ble miltene knust, uttømt for røde blodlegemer ved inkubering i ACK lysebuffer (BioWhittaker, Walkersville, MD), vasket og resuspendert i supplementert medium (RPMI 1640, 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 5 x 10
-5 M 2-merkaptoetanol, 1 mM natriumpyruvat og ikke-essensielle aminosyrer). Cellesuspensjonene ble tellet og stimulert
in vitro
med supplert media, anti-CD3 belagte antistoff (Ab) (BD Pharmingen-, La Jolla, CA) ved 2 ug /ml eller LPS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ved 1 pg /ml i 72 timer i en inkubator innstilt på 37 ° C og 5% CO
2.
cytokine og ALT assays
Sera ble analysert for cytokin produksjon av ELISA i henhold til produsentens instruksjoner. Pakkene som ble brukt var: Mil-10, mIFNγ, mTNFα (BD-Pharmingen, La Jolla, CA). (ALAT) sera nivåer ble bestemt ved hjelp av en bestemt kolo kit (Wiener Laboratories) og ved å følge produsentens instruksjoner.
Hystopathological analyse av levervev
Livers hentet fra mus i annen behandling gruppene ble høstet på dag 15 etter cDNA behandling, fiksert i 4% formaldehyd og deretter innstøpt i parafin. 6 mikrometer seksjoner ble utarbeidet og hematoksylin /eosin (H /E) eller Periodisk syre-Schiff (PAS) flekker ble brukt til seksjonene. Seksjoner, uten identifikasjon, ble analysert for vev endringer under en optisk mikroskop av en patolog.
Flowcytometri analyse
For flerfarget farging, fluorocrome-konjugert Abs (BD-Pharmingen, La Jolla, CA ) mot avstamning markører ble anvendt i forskjellige kombinasjoner. Kort sagt ble Fc-reseptorer på celler blokkert med et anti-CD16 /32 Ab i 30 minutter ved 4 ° C og vasket. Cellene ble så farget for overflatemarkører i 30 minutter ved 4 ° C, vasket to ganger og analysert ved flowcytometri med en BD FACS Canto ™ II cytometer (BD Biosciences, San José, CA, USA). For flowcytometri celle sortering, splenocytter fra IL-12 + IL-18-cDNA behandlet mus ble farget med fluorocrome-merket CD4 (klone RM4-5), CD8 (klon 53 til 6,7), CD11b (klone M1 /70) og CD11c (klone HL3) antistoffer (BD-Pharmingen, La Jolla, CA) og sortert til en renhet på 97-99% ved hjelp av en MoFlo sorter (Dako Cytomation).
mRNA-ekstraksjon og analyse
totalt RNA ble isolert ved anvendelse av en enkelt-trinns fenol /kloroform-ekstraksjon prosedyre (Trizol; Invitrogen Life Technologies). RT-PCR ble utført med 100 ng total-RNA for hver prøve (Super Script III ett trinn RT-PCR med platina Taq, Invitrogen), som består av en 15 minutters revers transkripsjonsreaksjon ved 45 ° C, 40 sykluser med denaturering ved 94 ° C (15 s), annealing ved 55 ° C (30 sekunder) og ekstensjon ved 68 ° C (60 e), med en endelig forlengelse i 5 minutter ved 68 ° C. Primere brukt var:. INOS, sanse 5′-GCA TTT GGG AAT GGA GAC TG-3 «, anti 5′-GTT GCA TTG GAA GTG AAG CGT TTC-3»
Western immunoblotting
Splenocytter ble lysert med 150 ul iskald lysebuffer og sentrifugert ved 14000 rpm, 4 ° C i 5 minutter. Proteiner ekstrakter ble underkastet elektroforese på en 10% SDS-PAGE-gel og overført til en Immun-Blot PVDF-membran (Bio-Rad, Hercules, CA). Membranene ble blokkert med 5% melk, 0,1% Tween-20 i TBS over natten ved 4 ° C og deretter inkubert med primære antistoffer i 3 timer ved romtemperatur. Etter inkubasjon med pepperrot-peroksidase konjugert sekundært antistoff (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA), ble proteinbåndene detektert med en Super Signal Chemiluminescent Substrate (Pierce) og Biomaks-MR-film (Eastman Kodak, Rochester, NY).
Arginase Activity Assay
Triton X-100 (0,1%, 100 ul) ble tilsatt til de splenocytt pellets som deretter ble behandlet som angitt. Etter 30 min inkubering ble Tris-HCl og MnCl
2 blanding (100 pl) tilsatt til cellene i 10 minutter ved 56 ° C. Platene ble inkubert med L-arginin (100 ul) ved 37 ° C i 30 minutter, og deretter en H
2SO
4 /H
3PO
4 /H
2O-blanding ( 800 ul) ble tilsatt og oppvarmet med α-isopropyliden nitrobenzen aceton (50 ul) ved 95 ° C i 30 min. Komplekset i hver brønn ble fortynnet 20 ganger med PBS for å detektere optisk tetthet (OD) verdier ved 540 nm med en UV spektrofotometer.
Levermetastase analyse og subkutan tumorvekst
C57BL /6 og TNFαRI KO mus var det injisert med B16-F10 melanomceller (0,5 x 10
6 celler /0,5 ml 0,9% natriumklorid) for levermetastase analyse. Tre dager senere, cDNA ble levert av hydrodynamisk injeksjon. Elleve dager senere, lever ble samlet og antall metastaser ble bestemt under et dissekere mikroskop.
For å evaluere subkutan tumorvekst, C57BL /6 og TNFαRI KO mus ble barbert og injisert subkutant i venstre flanke med 1 x 10
6 B16-F10 melanomceller i 0,2 ml av en steril 0,9% natriumkloridoppløsning. Etter 10-14 dager, da solide tumorer var synlige (4-5 mm diameter), ble musene hydrodynamisk injisert med de utpekte cDNA. Tumorvekst ble overvåket med en caliper. Dag 0 tilsvarer den dagen da cDNA ble administrert.
Statistisk analyse
For statistisk signifikans, data ble analysert ved hjelp av en student uparet
t
test (sammenligning av to eksperimentelle grupper) eller ANOVA test (sammensetning av mer enn 2 eksperimentelle grupper) med p 0,05 anses som betydelig. Ikke-parametrisk test (Kruskal-Wallis test) ble benyttet da
n
ble mindre enn 10. Museoverlevelseskurver ble plottet som Kaplan – Meier plott ved hjelp GraphPad Prism versjon 4 (GraphPad Software, San Diego, California) og en p 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
endringer i leukocytter tall etter systemisk ekspresjon av IL-12 eller IL-12 + IL18
Vi har tidligere vist at. uttømming av T-celler og NK /NKT-cellene øker overlevelse av IL-12-behandlede mus [10]. Imidlertid vedvarer en gjenværende toksisitet etter T /NK /NKT-celleutarming, noe som tyder på at andre celletyper kan også være en del av IL-12-virkninger [10]. Som et første skritt for å undersøke dette problemet vi analyserte de relative endringene i antall leukocytter stede i milten (og lever, ikke vist) i forhold til å styre mus. Som det fremgår av figur 1, er det numrene til NK og NKT undergrupper sterkt redusert opp til 50 dager etter behandling etter administrering av enten IL-12 eller IL-12 + IL-18-cDNA. Disse data virket ganske overraskende, siden tømming av NK /NKT-celler korrelerer med forbedring i overlevelse av mus behandlet med IL-12-cDNA. Imidlertid, når vi evaluert fenotypen til NK-celler oppnådd fra IL-12-behandlede mus, observerte vi at de uttrykker høye nivåer av IFNy og tidlig aktivering markør CD69 (data ikke vist). Disse dataene tyder på at selv om de finnes i meget lave tall, NK /NKT-celler viser en aktivert fenotype og kan således være delvis ansvarlig for den toksisitet observert etter systemisk ekspresjon av IL-12.
C57BL /6 mus ble hydrodynamisk injisert med kontroll, IL-12 og /eller IL-18 cDNA. Opp til 50 dager etter injeksjon, ble dyrene avlivet, og enkeltcellesuspensjoner av miltceller ble erholdt. Prosentandelen av de forskjellige undergrupper ble oppnådd ved overflaten avstamning farging med kombinasjon av de følgende: Abs NK1.1, CD3, CD11b, CD19, CD4 og CD8 og analysert ved strømningscytometri. Relative celletall i de forskjellige cellepopulasjoner ble beregnet ved å dividere de absolutte celle tall oppnådd fra cytokin-behandlede mus ved de absolutte celle tall erholdt fra kontrollmus. Dataene er uttrykt som gjennomsnittet av et basseng av 4 forskjellige forsøk (totalt antall n = 12 mus per gruppe). * 12 + 18 og 12 vs kontroll p 0,05,
# 12 vs 12 + 18 p. 0,05
Vi har også observert en endring i antall T-lymfocytter etter cytokin cDNA administrasjon. Mens CD4
+ T celler viser en lavere cellularity under de fleste tidsperioder analysert, CD8
+ T-celler gjennomgå en utvidelse i antall i løpet av den første uken etter behandling, men deretter senere gå tilbake til normale nivåer (fig.1).
Neste vi evaluert makrofag (Mii) befolkningen i de behandlede mus. IL-12 alene induserer en tidlig økning i Mii tall, mens i motsetning til dette er det antall av disse cellene i IL-12 + IL-18-behandlede mus ikke ekspandert (dager 2 og 3 etter behandling). Dessuten, selv om Mii tall oppnå en høyere topp i IL-12 + IL-18-behandlede mus ved dag 10, de vender tilbake til normale nivåer ved dag 50 etter behandling mens antallet Mii i IL-12-behandlede gruppen er fremdeles forhøyet . Det faktum at en patogene rolle for disse cellene i en annen murin modell av IL-12 + IL-18 systemisk uttrykk er tidligere blitt rapportert [19], vi hypotese at mediatorer produsert av Mii kan være ansvarlig, i det minste delvis, for den giftige bivirkninger observert etter systemisk IL-12-behandling.
balansen mellom nitrogenoksid (NO) ekspresjon og arginase aktivitet antyder en mer inflammatorisk profil i makrofager fra IL-12-behandlede sammenlignet med IL-12 + IL-18 -behandlede mus
Deretter undersøkte vi rolle av NO som et grunnlag for IL-12-bivirkninger som NO er kjent for å bli indusert ved Mii i nærvær av IL-12 + IL-18 [27] . Generering av NO med nøytrofiler og monocytter øker i septiske pasienter og deres varighet er assosiert med en dårlig klinisk resultat [28]. Dessuten, spiller overdreven NO formasjon en viktig rolle i patogenesen av sjokk og multippel organsvikt i løpet av sepsis og akutt lungeskade [29]. I denne sammenheng har vi først analysert hvis NO /iNOS er uttrykt i våre eksperimentelle modellen. Som det kan ses i figur 2A, er iNOS RNA ekspresjon signifikant oppregulert i både IL-12 og IL-12 + 18-behandlede mus tidlig etter cDNA administrering og varer i minst 15 dager etter behandling (data ikke vist). Det er interessant protein analyse viste at etter 15 dager etter behandling, er iNOS uttrykk fremdeles oppregulert i IL-12-behandlede mus, men lavere eller ingen ekspresjon er observert i IL-12 + IL-18-behandlede mus (Fig. 2B) . Dessuten
in vitro
NO nivåer som er evaluert på dag 15 etter behandling fra splenocytter stimulert med LPS viste en lavere ekspresjon i celler oppnådd fra IL-12 + IL-18-behandlede mus (data ikke vist). Disse data førte oss til å finne ut om den nedre uttrykk for iNOS /NO i IL-12 + IL-18-behandlede mus kan forklare bedret overlevelse utfallet observert i denne gruppen, sammenlignet med IL-12-behandlede mus [10]. Overraskende, når vi overvåket overlevelse i WT og iNOS KO mus etter IL-12 eller IL-12 + IL-18-cDNA administrering, observerte vi at mangelen på iNOS uttrykk ikke blir bedre motstand mot behandlinger (Fig. 2C). Disse resultatene førte oss til hypotesen om at nei kanskje ikke direkte involvert som en giftig formidler av disse behandlingene, men forholdet mellom Mii NO /arginase uttrykk kan gi informasjon om den inflammatoriske miljøet som følge av de ulike behandlingene. Følgelig viser figur 2D at splenocytter fra IL-12-behandlede mus har betydelig lavere arginase aktivitet sammenlignet med splenocytter fra IL-12 + IL-18-behandlede mus. Sammen med iNOS-data, konkluderer vi med at det NO /arginase forholdet er høyere i mus behandlet med IL-12 alene enn i mus behandlet med IL-12 + IL-18. Dette resultatet tyder på at behandling med IL-12 + IL-18 induserte en makrofag fenotype mindre betennelsessammenlignet med IL-12-behandlede mus.
(A) RT-PCR-analyse av iNOS genekspresjon i splenocytter erholdt fra mus injisert med de utpekte cDNA, 12 + 18 og 12 vs kontroll p 0,05. (B) Western blot-analyse av splenocytt proteinekstrakter oppnådd fra mus injisert med de angitte cDNA, 12 vs 12 + 18, p 0,05. (C) Overlevelse overvåket i B6 (WT) eller iNOS KO mus på dager post-IL-12 eller IL-12 + IL-18-cDNA-injeksjon. (D) Arginase aktivitet målt bestemmelse av ureanivået i 1 × 10
6 splenocytes. Dataene i A, B og D er uttrykt som gjennomsnittet av 2 forskjellige eksperimenter med 4-5 mus pr gruppe. Survival kurve ble bygget som en pool av 2 forskjellige eksperimenter med 5 mus per gruppe. * 12 + 18 vs 12 p. 0,05
Uttrykk av IFNy, TNFa og IL-10 etter IL-12 + IL-18 behandling
Vi har rapportert at i IL- 12 + IL-18-behandlede mus, tidlig ekspresjon av IL-10 regulerer nivåene av inflammatoriske cytokiner IFNy og TNFa [10]. Men selv om vi utførte disse eksperimentene ved å tappe ulike leukocytter populasjoner og evaluere overlevelse i hvert enkelt tilfelle, kunne vi ikke identifisere kildene til cytokiner [10]. For å undersøke denne saken, vurderte vi produksjonen av IL-10, IFNy og TNFa fra sorterte splenocytes hentet fra IL-12 + IL-18-behandlede mus på dag 3 etter behandling, et endepunktet der vi tidligere hadde observert produksjonen av disse cytokinene (figur 3). Vi observerte at TNFa er sterkt produsert av CD8
+ T-celler og CD11b
+ pluss CD11c
+ celler (Mii, dendrittiske celler (DCS) og natural killer (NK) celler sortert sammen). Siden NK-celler og DCS representerer en meget liten populasjon av splenocytter i disse mus (fig. 1 og data ikke vist), vi sortert alle disse cellene sammen for å øke antall gjenvundne celler. For å bestemme bidraget fra Mii alene, evaluerte vi den cytokin ekspresjon i kulturer av anriket adherente splenocyttene (mer enn 85% Mii) og observert at disse cellene uttrykte høye nivåer av TNFa. Denne observasjonen foreslo at uttrykket av TNFa kan komme hovedsakelig fra Mii snarere enn de andre to celletyper som finnes i CD11b /c
+ sorterte gruppe (fig. 3A). I motsetning til dette, blir uttrykt av IFNy CD4
+ og CD8
+ T-celler, men ikke fra Mii, noe som viser at CD11b /c uttrykk er trolig på grunn av tilstedeværelsen av NK-celler i denne gruppe (fig. 3B). Interessant er IL-10 produsert av CD4
+ T-celler og også ved DC eller NK-celler, men ikke ved Mii (Fig. 3C). Disse dataene antyder at uttømming av T, NK og NKT-celler, kunne eliminere kildene til IFNy (som vi tidligere rapportert [10]), men Mii fortsatt som en svært viktig kilde til TNFa. Dette funnet er trolig grunnen til utarming av lymfocyttene bare delvis bedret overlevelse i IL-12-behandlede mus [10]. Videre er det faktum at den Mii profilen synes å være mer inflammatorisk basert på NO /arginase data, kan forklare hvorfor IL-12-behandlede mus utviser mye lavere overlevelse enn IL-12 + IL-18-behandlede mus.
Splenocytter fra IL-12 + IL-18-mus ble erholdt og farget med anti-CD4, anti-CD8 og anti-CD11b /c fluorocrome merket Abs og deretter sortert til en renhet på 97-99% ved anvendelse av en MoFlo sorterer (Dako Cytomation). Sorterte cellene ble deretter dyrket i nærvær av anti-CD3 Ab belagt (2 ug /ml) og LPS (1 pg /ml) i 72 timer. Supernatanter ble så høstet og (A) TNFa, (B) IFNy og (C) IL-10-ekspresjon ble evaluert ved hjelp av ELISA. Data er uttrykt som gjennomsnittet av 2 forskjellige eksperimenter med 4-5 mus pr gruppe. * Stimulert vs ikke-stimulert, p. 0,001
TNFa er en viktig cytokin som medierer IL-12 systemisk toksisitet
For å undersøke hvilken rolle TNFa som en giftig mekler etter IL -12 systemisk uttrykk, analyserte vi overlevelsen av TNFa KO eller TNFαR1 KO mus etter IL-12-behandling. Som vist i figur 4A, oppheving av TNFa eller dens type 1-reseptorgener betydelig økt overlevelse av IL-12-behandlede mus sammenlignet med WT mus. Interessant, da vi analyserte kinetikken av TNFa serumnivåer, observerte vi at protein expression toppene rundt dag 4 både i IL-12 + IL-18- og IL-12-behandlede mus; Nivåene er mye lavere i IL-12 + IL-18-behandlede mus (Fig. 6C). Videre, ved dag 8 og opp til dag 12 etter behandling, TNFa sera nivåer begynner å avta i begge grupper; Imidlertid er det fortsatt vedvarende og alltid høyere i IL-12 behandlingsgruppen (Fig. 4B).
(A) Overlevelse ble overvåket i WT, TNFa KO og TNFRI KO mus i dagene etter IL-12 cDNA behandling. * WT vs TNFa KO og TNFRI KO, p 0,01. (B) Mus fra kontroll, IL-12 eller IL-12 + IL-18-cDNA-behandlede grupper ble tappet for blod og TNFa sera nivåer ble bestemt i dagene etter behandling. (C) Splenocytter fra kontroll, IL-12 eller IL-12 + IL-18-cDNA-behandlede mus ble erholdt og dyrket i nærvær av media (NS), anti-CD3 Ab belagt eller LPS i 72 timer. Supernatanter ble så høstet og TNFa ekspresjon ble evaluert ved hjelp av ELISA. * IL-12 vs IL-12 + IL-18, p 0,05. (D) Sera fra B6-mus behandlet med kontroll eller IL-12 cDNA og fra TNFRI KO-mus behandlet med IL-12-cDNA ble oppnådd i de dager etter behandlingen. ALAT-nivåer ble bestemt ved hjelp av en bestemt kolo kit. Dataene i A, B og C er uttrykt som gjennomsnittet av 2 forskjellige eksperimenter med 4 mus per gruppe. Dataene i D er uttrykt som gjennomsnittet av bassenget av 3 forskjellige forsøk (WT n = 12, TNFR1 KO n = 9). * WT IL-12 cDNA vs TNFRI KO IL-12 cDNA, p. 0,05
Neste, vi sammenlignet TNFa
in vitro
uttrykk ved splenocytter innhentet fra mus behandlet
in vivo
med IL-12 alene eller sammen med IL-12 + IL-18. Selv om TNFa produsert etter
in vitro
stimulering med anti-CD3 Ab (stimulering av T-celler) er ganske lik mellom celler oppnådd fra begge grupper, er det betydelig lavere i IL-12 + IL-18-behandlede mus når stimulert
in vitro
med LPS (dvs. Mii og DC stimulering) (fig. 4C). Disse data antyder at lavere nivåer av TNFa systemisk observert i IL-12 + IL-18-behandlede mus er sannsynligvis på grunn av en redusert bidrag på Mii og DC i uttrykket av dette cytokin i denne behandlingsgruppen.
systemisk IL-12 eller IL-12 + IL-18-behandling provoserer patologiske effekter på immun vev og lever
systemisk ekspresjon av IL-12 er blitt rapportert å indusere flere typer av patologiske forandringer i musemodeller og i kreft pasienter [2], [4], [6], [17]. For å vurdere generell toksisitet av IL-12-behandling, ofret vi kontroll og syke IL-12 og IL-12 + IL-18 behandlede mus og utført en fullstendig analyse av orgel patologi. Som det kan sees i tabell S1, de store endringer som observeres er atrofi av thymus og lymfoiduttømming, og disse endringene først på lignende i IL-12 og IL-12 + IL-18-behandlede mus.
Imidlertid analysen viste også en mer intens histiocytose i lymfeknuter (LNS) oppnådd fra IL-12-behandlede mus sammenlignet med IL-12 + IL-18-behandlede mus. Histiocytose er forbundet med nærværet av makrofager i vevet, slik at forverret patologi i IL-12-behandlede mus er forbundet med en stor utvidelse /nærvær av makrofager i LNS.
Endringer i levervev etter systemisk ekspresjon av IL -12 eller IL-12 + IL-18
Selv om vi ikke observere forskjeller i histiocytose når man sammenligner de lever av IL-12 og IL-12 + IL-18 mus, tidligere resultater bekreftet at sera nivåer den leverenzymer ALT og aspartataminotransferase (AST) var signifikant høyere i IL-12-behandlede mus [10]. Neste bestemte vi oss for å evaluere patologien av dette organ i stedet for det funn at en av de mest uønskede virkninger av systemisk IL-12 terapi er hepatotoksisitet observeres etter administrasjon av dette cytokinet [2], [4], [6], [17]. Interessant, som vist i figur 4D, IL-12-behandling av TNFa-type 1-reseptoren KO-mus opphever den ALT topp observert ved dag 15 i WT mus.
histopatologiske trekk er tilstede i leveren hos mus behandlet med IL- 12 eller IL-12 + IL-18 cDNA avslørte store endringer i vev, blant annet utseende: celler med en rund form (celle utposning) (figur 5B.) sammenlignet med den klassiske heksagonal form av hepatocytter fra kontrollmusene (fig. 5A). Videre leveren fra behandlede mus viser tapet av de hepatiske sinuskurver som kan tydelig observeres i kontrollmusene (Fig. 5A vs 5B). I tillegg observerte vi foci av ektopisk hematopoiesen (fig. 5C) med tilstedeværelse av megakaryocytter (fig. 5D) i hele leveren i IL-12- eller IL-12 + IL-18-behandlede mus, men ikke i kontrollmusene. Både Mallory organer (Fig. 5E) og rådmann organer (Fig. 5F) og områder med nekrotisk vev (fig. 5G) kan kun sees hos mus behandlet med cytokin cDNA. Til slutt, observerte vi at glykogen innskudd er sterkt redusert hos mus behandlet med IL-12 eller IL-12 + IL-18 (Fig. 5I) sammenlignet med kontrollmus (fig. 5H). Selv om alle disse lesjoner er til stede gjennom hele leveren vev hos mus behandlet med enten IL-12-cDNA alene eller IL-12 + IL-18-cDNA (med en topp mellom dagene 14-16), co-administrering av IL-12 og IL-18 er i stand til å redusere forekomsten av disse IL-12-forbundet leverforstyrrelser (Tabell S2). Disse observasjonene korrelerer med vår tidligere data som viste lavere ALAT og ASAT sera nivåer i 12 + IL-18-behandlede mus [10]. Videre TNFαR1 KO-mus (fig. 5 K) oppviste en lavere forekomst av disse patologiske funksjoner etter IL-12-cDNA-behandling enn det som ble observert i behandlede WT mus (fig. 5J), spesielt i antall og størrelse av infiltrat foci (tabell S2 ).
Lever, erholdt fra mus i de ulike grupper ble erholdt på dag 14-16 etter cDNA-behandling. Deler av 6 um ble oppnådd, og (A-G) hematoksylin /eosin (H /E) eller (H-I) Periodisk syre-Schiff (PAS) flekker ble påført på seksjonene. (A) Hepatocytter og sinusformer fra en kontroll mus, 100 x. (B) ballong hepatocytter og fravær av leversinuskurver i en IL-12-cDNA behandlet mus, 100 ×. (C) Fokus for ektopisk hematopoiesis i en IL-12-cDNA behandlet mus, 100 ×. (D) megakaryocytt i et IL-12-cDNA-behandlede mus, 100 x. (E) Mallory og (F) Councilman legemer i en IL-12-cDNA-behandlede mus, 100 x. (G) Fokus av nekrose; 10 ×. Glykogen avsetninger erholdt i en mus fra (H) kontrollgruppen eller (I) IL-12-cDNA-gruppe, 20 x. Leversnitt fra (J) WT eller (K) TNFR1 KO-mus 15 dager etter å ha IL-12-cDNA behandling. Bilder er representative for 2 forskjellige eksperimenter med 4-5 mus per gruppe.
B6 mus ble behandlet med IL-12 cDNA alene (sort sirkel), IL-12 + IL-18 cDNA (åpen sirkel
