Abstract
Forbedrede fremgangsmåter for nøyaktig identifikasjon av både tilstedeværelse og alvorlighetsgrad av cervikal intraepitelial neoplasi (CIN) og graden av spredning av invasive karsinomer i cervix (IC) er nødvendig. Differensiell scanning kalorimetri (DSC) er nylig blitt vist å påvise spesifikke forandringer i den termiske oppførselen av blodplasmaproteiner i flere sykdommer. Denne metodikken er blitt undersøkt for å tilveiebringe en komplementær metode for screening av livmorhalskreft sykdom. Denne studien evaluerte nytten av DSC i å skille mellom friske kontroller, øker alvorlighetsgraden av CIN og tidlig og avanserte IC. Betydelig diskriminering var tydelig i forhold til omfanget av sykdommen uten noen klar effekt av demografiske faktorer som alder, etnisitet, røykestatus og paritet. Av de fleste kliniske relevansen, var det sterk differensiering av CIN fra friske kontroller og IC, og blant pasienter med IC mellom FIGO stadium I og avansert kreft. De observerte sykdomsspesifikke endringer i DSC-profiler (termogrammer) ble antatt å reflektere differensial uttrykk for sykdom biomarkører som senere bundet til og rammet den termiske oppførselen til de mest tallrike plasmaproteiner. Effekten av samvirkende biomarkører kan utledes fra moduleringen av termogrammer, men kan ikke direkte identifiseres ved DSC. For å undersøke naturen av de foreslåtte interaksjoner, ble massespektrometri (MS) analyser anvendes. Kvantitativ vurdering av de lavmolekylære proteinfragmenter av plasma-og urinprøver viste en liten liste av peptider som har overflod var korrelert med graden av livmorhalskreft sykdom, med de mest slående plasma peptidome data støtter interactome teorien av peptid porsjonering av rikelige mengder plasmaproteiner. Den kombinerte DSC og MS tilnærming i denne studien var dyktige til å identifisere unike biomarkør underskrifter for livmorhalskreft og demonstrert nytten av DSC plasma profiler som en komplementær diagnostisk verktøy for å evaluere livmorhalskreft helse
Citation. Garbett NC, Merchant ML, Helm CW, Jenson AB, Klein JB, chaires JB (2014) Påvisning av livmorhalskreft biomarkør Oppskrifter i blodplasma og urin ved Differential Scanning Calorimetry og massespektrometri. PLoS ONE 9 (1): e84710. doi: 10,1371 /journal.pone.0084710
Redaktør: Jose M. Sanchez-Ruiz, Universidad de Granada, Spania
mottatt: 31 august 2013; Godkjent: 18 november 2013; Publisert: 08.01.2014
Copyright: © 2014 Garbett et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette materialet er basert på arbeid støttet av Office of Research and Development, Medical Research service, Department of Veterans Affairs, Department of Energy Office of Science Financial Assistance Program (dE-FG02-05ER6406 til MLM og JBK), og NIEHS tilskuddet P30ES014443 ( til MLM og JBK). Dette arbeidet ble også støttet av en underkontrakt tildelt JBC fra National Cancer Institute stipend R44 CA103437 og ved en bevilgning til JBC fra Elsa. U. Pardee Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. NCG, ABJ og JBC er co-oppfinnere om patentsøknader som beskriver DSC plasma termo teknologi som Louisville Bioscience, Inc. (LBI) har en eksklusiv lisens fra University of Louisville. JBC og ABJ er grunnleggerne og aksjonærene i LBI; NCG er en gründer, aksjonær og ansatt i LBI. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
invasivt karsinom i livmorhalsen (IC) er den tredje vanligste kreftformen rammer kvinner med anslagsvis 529000 tilfeller diagnostisert på verdensbasis i 2008 og 274000 dødsfall [1]. I de siste tiårene rutinemessig screening har bidratt til å redusere både forekomst og dødsfall fra IC i USA, men likevel vil anslagsvis 12.340 nye tilfeller diagnostisert med 4,030 dødsfall i 2013 [2]. Invasiv livmorhalskreft forutgås av en forstadier tilstand, cervikal intraepitelial neoplasi (CIN), der unormal cellevekst i epitel slimhinnen i livmorhalsen. CIN er delt inn i karakterer (1 = mild, 2 = moderat, 3 = alvorlig) basert på histologiske funksjoner, inkludert kjernefysiske endringer og omfanget av involvering av epitel. Risikoen for progresjon av CIN til IC over tid stiger etter klassetrinn, er størst for CIN 3 [3], [4]. CIN kan behandles for å sterkt redusere sjansen for IC utvikling. Delvis for å hjelpe til med behandling planlegging, er CIN 2 og CIN 3 ofte gruppert sammen som høyverdig plateepitel intraepitelial lesjon (HSIL) som ville bli behandlet og CIN 1 og HPV condyloma som lavgradig plateepitel intraepitelial lesjon (LSIL) som ville være ubehandlet . Når IC er oppdaget at hoved behovet er for å fastslå om det er tidlig fase sykdom (FIGO fase I) som er begrenset til livmorhalsen, eller hvis det er mer avansert metastatisk sykdom. Bare sykdom begrenset til livmorhalsen og av tilstrekkelig liten størrelse anses behandles med kirurgi.
pålitelige metoder for nøyaktig bestemmelse av CIN og IC er kritiske. Nåværende screening kan ikke skille lav grad fra høyere klasse CIN, CIN fra IC, tidlig fra mer avanserte stadier av IC, eller bestemme ytterligere sykdom statusindikatorer som tilstedeværelsen av lymfeknuteaffeksjon. For mange år den innledende screening metode for CIN har vært celleprøve test som gjør det mulig for cytologiske abnormiteter som skal oppdages på avskraping fra livmorhalsen. Kvinner med celleprøver tyder plateepitel intraepitelial lesjoner vil da bli vurdert, blant annet ved klinisk undersøkelse og kolposkopi og biopsi, for å fastslå graden og omfanget av eventuelle CIN stede og for å utelukke (eller diagnostisere) tilstedeværelse av IC. Celleprøve screening blir nå integrert med testing for høyrisiko genotyper av humant papilloma virus (HPV HR) som kan påvises i samme cytologic celleprøve prøve ved hjelp av flytende-basert hybrid Capture II-teknologi [5]. Alle kvaliteter av CIN er forbundet med en høy sannsynlighet for tilstedeværelse av HPV HR. Hos kvinner mellom 30 og 65 år forbedrer HPV HR testing deteksjonsraten av CIN 3 eller høyere ved 17-31% i den første runden av screening og reduserer forekomsten av IC i den andre runden av screening [6], [7], [8], [9]. HPV HR testing er nå også integrert i oppfølgingen av kvinner som tidligere har vist seg å ha HPV HR-infeksjon eller CIN, siden vedvarende HPV HR-infeksjon er forbundet med en økt risiko for utvikling av tilbakevendende CIN og IC [6] , [10]. Selv om testing for HPV HR kan forbedre deteksjonen av CIN det ikke kan skille mellom CIN lesjoner som har en høyere sannsynlighet for å komme videre fra de som ikke gjør det. Biomarkører er blitt undersøkt i denne forbindelse, men har ennå ikke vist seg nyttig [11], [12], [13], [14]. Opparbeidelse og behandling for kvinner med unormale celleprøver er traumatisk fysisk, følelsesmessig og økonomisk, og dessverre, på grunn av manglende evne til å skille CIN lesjoner som har en høyere sannsynlighet for progresjon til IC mange kvinner fortsatt komme over behandlet.
Her beskriver vi anvendelse av en kombinert tilnærming ved hjelp av differensiell scanning-kalorimetri (DSC) og massespektrometri (MS) for karakterisering av cervical sykdom. DSC er vanlig å måle denaturering profiler av biomolekyler, kjent som termogrammer, ved direkte å overvåke varme endringer forbundet med molekylære hendelser som funksjon av temperatur. Under gitte løsning forhold, gir en termo en unik signatur for et gitt protein reflekterer spesifikke strukturelle motiver og molekylære krefter. Det har nylig blitt vist at DSC kan anvendes til analyse av blodplasma for å gi en indikasjon på individets kliniske status [15], [16], [17], [18], [19], [20], [ ,,,0],21], [22], [23], [24]. Termogrammet av plasma fra friske individer som reflekteres den vektede summen av denaturering profiler av de mest tallrike plasmaproteiner; imidlertid, termogrammer fra personer med forskjellige tilstander eller sykdommer ble vesentlig endret [15], [16], [17], [18]. Termo endringer syntes å være følsomme for den spesielle sykdomstilstand og indikerte at plasma DSC kan ha nyttevirkning som et diagnostisk screening-metode. Mekanismer for sykdomsspesifikke endringer i termo er for tiden under etterforskning i vårt laboratorium, men vi hypotese at de gjenspeiler tilstedeværelse av sykdoms biomarkører som modifiserer eller samhandle med plasmaproteiner og dermed påvirke deres denaturering egenskaper. Slike biomarkør interaksjoner ville støtte «interactome» konsept som foreslår at lavmolekylære peptider som finnes i plasma proteomet er kompleks med mer rikelig plasmaproteiner skape et nettverk av protein-protein og peptid-protein interaksjoner [25]. Selv om tilstedeværelsen av mulige lavmolekylære biomarkører kan utledes gjennom endringer i termogrammet ikke direkte identifikasjon kan fremstilles ved denne metoden. Vi har brukt en MS peptidomic tilnærming for å undersøke naturen av plasma termo profiler assosiert med livmorhalskreft sykdom.
MS har vært brukt som et verktøy til hjelp i forståelsen av sykdom patogenesen og generering av kandidat biomarkører for sykdom [ ,,,0],26], [27], [28], [29], [30], [31], [32]. En anvendelse av MS har vært den kvantitative og kvalitative analyser av lavmolekylære proteinfragmenter som finnes i plasma og /eller urin, referert til som en peptidomic tilnærming [33], med det mål å korrelere overflod med deteksjon eller prognose av sykdom. Peptidene observert i disse studiene er reflekterende av metabolsk omsetning på mors proteiner med overflod endringer mellom sak (sykdom) og kontroll forhold knyttet til en endring (er) til proteinet normale katabolsk eller anabole metabolsk halveringstid. Disse peptidomic studiene har i noen tilfeller med hell demonstrert korrelasjoner mellom mengder eller mønstre av flere peptider med den sykdom eller sykdomsprogresjon. Med hensyn til cervical sykdom, metastatisk potensial av CIN blitt korrelert med ekspresjonen av proteiner, inkludert tre matriksmetalloproteinase-2 (MMP-2), MMP-9, og urokinase-type plasminogenaktivator [14]. På grunn av den primære involvering av peptidet generer metalloproteinaser i sykdomsutviklingen, kan denne korrelasjon av CIN bli utvidet til peptidomic fenotype. Som sådan, kan tilstedeværelsen av unike plasma og /eller urin peptid profil (e) etableres ved MS metoder og korreleres med termo profiler som gjenspeiler tilstedeværelsen og omfanget av livmorhalskreft sykdom. Vi beskriver resultater som viser følsomheten DSC termogrammer til klinisk status og bevis for foreningen av termo profiler med samspill peptid biomarkører identifisert ved MS.
Materialer og Metoder
Prøvetaking
studieprotokollen og pasientsamtykkeprosedyrer ble godkjent av University of Louisville Institutional Review Board (IRB # 08,0108, 608,03). Kvinner deltar klinikkene av Seksjon for gynekologisk onkologi med biopsi-påvist livmorhals intra-epitel neoplasi og invasiv livmorhalskreft var kvalifisert og ga skriftlig informert samtykke for deres blod og vev til å bli inngått en vev depot (IRB # 608,03) og utnyttes for forskningsformål. IRB spesielt godkjent bruk av vev fra vev settes opp for bruk i denne studien uten behov for ytterligere samtykke (IRB # 08,0108). Kvinner er kjent for å være HIV-positiv var ikke kvalifisert. Blod og sted urinprøver ble samlet inn fra rekruttert pasienter i løpet av sine første klinikk besøk på tidspunktet for evaluering og før de fikk behandling. Urinprøver ble alikvotert og umiddelbart lagret ved -80 ° C inntil analyse. Blod ble trukket inn i 5 ml lilla topp (plasma, K
2-EDTA antikoagulant) vacutainers. Rør ble forsiktig blandet ved inversjon 8-10 ganger umiddelbart etter blodprøvetaking for å jevnt fordele den antikoagulerende additiv, etterfulgt av sentrifugering ved 3200 opm i 10 minutter (BD-Clay Adams Compact II sentrifuge). Separert plasma ble forsiktig suget av for å unngå hemolyse eller forurensning av de separerte blod fasene, alikvotert og umiddelbart lagret ved -80 ° C inntil analyse. Kontroll blod- og urinprøver ble samlet inn under de samme studie prosedyrer fra friske frivillige med ingen historie med unormale celleprøver eller kreft. Som ovenfor, ble studieprotokollen og samtykkeprosedyrer godkjent av University of Louisville Institutional Review Board (IRB # 08,0108, 608,03). Alle frivillige ga skriftlig informert samtykke for deres blod og vev til å bli inngått en vev depot (IRB # 608,03) og benyttes til forskningsformål. IRB spesielt godkjent bruk av vev fra vev repository (IRB # 608,03) for bruk i denne studien uten behov for ytterligere samtykke (IRB # 08,0108). Prøve aliquoter ble tint for analyse og resten kastes. All håndtering av prøver og prøve avfall var i samsvar med OSHA bloodborne patogen prosedyrer. Alle prøver samlet for studien ble deidentified og lagret i gynekologisk onkologi Tissue Bank på James Graham Brown Cancer Center. Assosiert demografiske og kliniske opplysninger ble samlet ved kliniske studier personell og sikkert lagret på studiet datamaskinen. Vevet banken ble godkjent av University of Louisville Institutional Review Board (IRB # 608,03) og var fullt HIPAA kompatibel. Prøvene har oppgitt til grunnleggende vitenskap studie personell (NCG, MLM, ABJ, JBK, JBC) for DSC og MS studier ble kodet av vev bank samling nummer. I denne formen prøvene ble deidentified og blindet for både demografisk og patologisk sykdomsstatus for objektiv datainnsamling. Demografiske og sykdomsstatus ble senere gitt for data sortering og tolkning.
DSC Studier
Prøvepreparering for DSC-studier.
Plasmaprøver (100 mL) ble dialysert mot en standard fosfatbuffer (1,7 mM KH
2PO
4, 8,3 mM K
2HPO
4, 150 mM NaCl, 15 mM natriumcitrat, pH 7,5) i 24 timer ved 4 ° C for å oppnå normalisering av buffer forhold for alle prøvene. Frosne plasmaprøver ble tint over natten ved 4 ° C dagen før dialyse. På morgenen dialyse, ble prøver lastet inn Slide-A-Lyzer mini dialyse enheter (MWCO 3500, Pierce, Rockford, IL) som hadde blitt likevekt mot dialysebuffer over natten. Basert på kostnad og pålitelighet vi rutinemessig re-montert vasket dialyse enheter erstatte den opprinnelige dialysemembran med cut-to-size Snake Plissert Dialyse Tubing (Pierce, Rockford, IL). Prøvene ble dialysert mot 1 liter fosfatbuffer med bufferendringer etter tre timer med dialyse, og deretter etter to perioder av fire timer med en endelig natten over dialyseperiode. Prøver ble gjenvunnet fra dialyse og filtrert for å fjerne partikler ved hjelp av en Spin-X-sentrifugerør filter (0,45 um celluloseacetat, Corning Incorporated, Corning, NY). Den endelige dialyse buffer ble også filtrert (0,2 mikrometer polyetersulfon; Pall Corporation, Ann Arbor, MI).. Og brukes for alle prøvefortynningene og som en referanse løsning for DSC studier
DSC-analyse
DSC data ble samlet inn med en Microcal VP-Capillary DSC instrument med integrert automatisk prøvetaker (Microcal, LLC, Northampton, MA, nå en del av GE Healthcare). Elektrisk kalibrering av differensialstrømsignal og temperaturkalibrering ved hjelp av hydrocarbontemperaturstandarder ble utført som en del av produsenten årlig vedlikehold instrument. Produsent ytelsesspesifikasjoner for temperatur standardene er ± 0,2 ° C. Interim instrumentytelse ble vurdert ved hjelp av biologiske standarder lysozym og RNaseA. Produsent ytelsesspesifikasjoner for biologiske standarder er ± 0,5 ° C. Dialysert plasmaprøvene ble fortynnet 25 ganger for å oppnå en passende proteinkonsentrasjon for DSC-analyse. Prøver og Dialysatet ble overført til 96-brønners plater og deretter lastet inn i instrumentet autosampler termostatreguleres ved 5 ° C inntil analyse. Prøvevolumer på 400 pl var nødvendig for å gi tilstrekkelig volum for lasting av instrumentet kapillær og sikre riktig fylling av 135 pl varmesensorområdet. DSC-sveipinger ble registrert fra 20 ° C til 110 ° C ved en scanninghastighet på 1 ° C /min med en pre-scan termostat på 15 minutter, mellom feedback-modus og en filtreringsperiode på 2 sekunder. Duplikate DSC-sveipinger oppnådd for hver plasmaprøve. For hvert forsøk sett, dosert vi prøver å sikre analysen ble gjennomført i løpet av en syv dagers vindu etter første tining av prøvene. I utviklingen av vår eksperimentelle prosedyren har vi nøye vurdert prøve- og buffer skanner som en funksjon av kjøre sekvens, instrument kammer skylling og rengjøring protokollen, og tid siden forberedelse. Vi har undersøkt buffer skanninger samlet på begynnelsen og slutten av et prøvesett og etter enkle eller påfølgende prøve skanner og bestemt akseptabelt reproduserbarhet og effektiv rengjøring av instrument kamre. Vi har sammenliknet duplikat prøve skanninger ble samlet inn etter en skanning buffer eller prøven og funnet det er mulig å samle etterfølgende eksempel skanninger etter omfattende rensing av instrument kamre med ingen virkning på termogram-profil. Vi rutinemessig sammenlignet dupliserte prøveskanning samlet inn under forskjellige kjøre sekvenser og ved ulike tidspunkt for å sikre den termo profilen var reproduserbar.
DSC data ble analysert ved hjelp av Origin 7 (OriginLab Corporation, Northampton, MA). Rå DSC data ble korrigert for instrumental baseline ved subtraksjon av en egnet buffer referanse scan. Korrigerte skanninger ble normalisert til total proteinkonsentrasjon som ble bestemt kolorimetrisk ved hjelp av bicinchoninic syre proteinanalysesett og mikro prosedyre fra Pierce (Pierce, Rockford, IL), med mindre modifikasjoner til produsentens protokoll. Avlesninger ble tatt ved hjelp av en Tecan Sunrise mikro absorbans leser (Tecan USA, Research Triangle Park, NC). Etter normalisering ble plasma DSC skanner korrigert for ikke-null grunnlinjene ved bruk av en lineær baseline passform. Valg av en passende prøve baseline korreksjon er komplisert av tilstedeværelsen av et begrenset område av post-overgang baseline fulgt av aggregering og nedbørs hendelser etter termisk denaturering konvolutten. Vi har vurdert alle tilgjengelige baseline korrigering innenfor analyse programvare og fant den lineære baseline mulighet til å gi de mest konsistente resultater når testet på gjentatte målinger, forskjellige prøver og av uavhengige bruker bestemmelser. Vi aksepterer at vår tilnærming kan ha begrensninger, men har valgt den mest konsekvente baseline korreksjon metode som kan brukes på tvers av alle våre studier. Endelige termogrammer ble plottet som overflødig spesifikk varmekapasitet (cal /° Cg) mot temperatur (° C).
Statistisk analyse av DSC-data.
Undersøkelse av alle termo data viste at temperaturområde 45-90 ° C spredte fullstendig denaturering profil for alle prøvene og skanner ble avkortet til dette området for alle påfølgende analyser. Kvantitativ sammenligning av termogrammene ble oppnådd ved beregning av et antall av form og har beregninger. Parametere mente var totalt toppareal; topphøyde; toppens bredde ved halv høyde; Temperaturen i toppmaksimum (T
max); varmekapasiteten av den primære overgangs i området 60-65 ° C [C
p
ex (topp 1)]; varmekapasiteten av den sekundære overgang ved 68-72 ° C [C
p
ex (Topp 2)]; forholdet mellom de første og andre overgangs amplituder [C
p
ex (topp 1)] /[C
p
ex (Topp 2)]. På grunn av kompleksiteten i termogrammet former, ble en tilleggsparameter beregnet for å tilveiebringe et mål for fordelingen av arealet av denaturering profilen i forhold til temperaturen akse. Den første øyeblikk temperatur (T
FM) ble bestemt i henhold til ligning 1: (1)
termogrammer ble gruppert etter patologisk sykdomsstatus i fem grupper: friske kontroller, LSIL (CIN 1), HSIL (CIN 2, CIN 3), tidlig stadium IC (fase I) og avanserte IC (Stage II-IV). Mean termogrammer med standardavvik ble bestemt for hver studiegruppe.
Forskjeller i termo form og har beregninger ble vurdert av ikke-parametriske metoder. Først ble boks diagrammer brukes til å sammenligne forskjeller i fordelingene mellom hver studiegruppen. Box diagrammer ble konstruert med følgende form: bunnen og toppen av boksen representerte 25
th og 75
th persentil, henholdsvis, og den 50. persentil ble representert av bandet i midten av boksen. Den nederste og øverste endene av værhår betegnet 5
th og 95
th persentiler, henholdsvis. Horisontale linjer angitt minimum og maksimum av alle data og korsene representerte en
m og 99
th persentiler. Gjennomsnittlig ble angitt av en åpen plass. Forskjeller i termo beregninger for hver klinisk gruppe ble testet for signifikans ved hjelp av ikke-parametrisk Mann-Whitney U test for ulike medianer [34].
MS studier
eksperimentell design av MS-studier.
rekkefølgen av prøvehåndtering og analyse (prøvenummer, bestilling av prøveopparbeidelse, frysetørking, MALDI-TOF plate spotting, og TOF datainnsamling) ble randomisert til minimal systematisk variasjon når datainnsamling. Prøvene ble behandlet for å isolere gratis peptider (fraksjon 1 eller FX1), isolere peptider som var bundet til total plasmaproteiner (fraksjon 2 eller FX2), isolere peptider utgitt under immunodepletion av albumin og IgG fra plasma (fraksjon 3 eller FX3), og isolere peptider selektivt bundet til den svært rike proteiner, albumin og IgG (fraksjon 4 eller FX4). Prøvene ble oppdaget i tre eksemplarer, MALDI-TOF MS data innhentet og signal gjennomsnitt over de tre stedene. Analyse av gjennomsnittsdata for differensielt tallrike peptider ble utført ved anvendelse av hovedkomponentanalyse (PCA) og t-test, etterfulgt av manuell vurdering av ioneintensitetene for utvalgte peptider. Manuell anmeldelsen ble utført for å sikre at peptider ikke ble ekskludert som følge av feil baseline normalisering eller baseline subtraksjon.
Prøvetaking.
Prøvene ble tint en gang til delmengde inn i 100 mL volumer for lagring ved -80 ° C og en gang for prøvepreparering for peptid kvantifisering. Prøvene ble analysert ved hjelp av to separate alikvoter og individuelle prøver ble analysert i triplikat. Plasmaprøver ble tømt av albumin og IgG ved hjelp av kommersielt tilgjengelige affinitet spin kolonner (Sartorius N.A. Inc, Edgewood, NY) i henhold til produsentens retningslinjer. Peptider som ikke er bundet til plasmaproteiner ble isolert ved anvendelse av en modifikasjon av fremgangsmåten for utfelling Chertov et al [35]. Peptider bundet til albumin og IgG ble gjenvunnet fra albumin /IgG affinitet harpiks ved syre stripping med 10% eddiksyre. Peptider bundet til plasmaproteiner ble gjenvunnet fra det organiske løsningsmiddel-koagulerte proteiner ved salt eller syre ionisering. Gjenvunne peptid løsninger ble lyofilisert og resuspendert i 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) før MALDI-TOF-MS-analyse. Spot urinprøver ble tint fra -80 ° C på is. Urinprøver ble sentrifugert ved 1500 x g i 15 minutter ved 4 ° C for å pelletere celleavfallet og partikler. Urin peptider ble isolert ved hjelp Amicon Ultra-4 (10000 NMWCO) (Millipore, Billerica, MA) som tidligere beskrevet [26].
MS-analyse av isolerte plasma og urin peptider.
Alle prøvene ble avsaltet og konsentrert for MALDI-TOF MS analyse ved hjelp av C18 ZipTips (Millipore, Billerica, MA). Peptidene ble eluert fra C18-resin med prøvemassen, 5 mg /ml 4-hydroksy-α-cyanocinnamic syre (α-CN), og direkte flekket i tre eksemplarer på MALDI plate. Positiv ion MALDI-TOF massespektra ble ervervet som beskrevet [36]. Peptider selektert for videre studier ble analysert ved hjelp av AB4700 i TOF /TOF-modus og tolkning av data ved hjelp av fragmentering Mascot (Matrix Science, Boston, MA) ver1.9 som tidligere beskrevet [26].
Statistisk analyse av MS data.
data~~POS=TRUNC filer~~POS=HEADCOMP (.t2d) ble eksportert fra AB4700 Proteomics Analyzer og importert til MarkerView programvare. Denne programvaren kan finne spektraltoppene av brukerdefinerte masse tålegrenser eller bin spektra via brukerdefinerte bin størrelser. I tillegg kan brukeren definere minimum og maksimum signalreaksjonene, som hjelper til med håndteringen av høy-dimensjonale massespektrale datasett. Data ble analysert ved hjelp av data binning, som er tillatt for baseline subtraksjon. Peptide uttrykk data ble først undersøkt ved hjelp av PCA. Følgende data import, ble dataene preprocessed bruker no-vekting og enten bety-sentrert eller Pareto data skalere før PCA. PCA er en fremgangsmåte for å undersdataanalyse som reduserer kompleksiteten av data, og samtidig beholde deres variabilitet, ved å transformere data til en ny gruppe av variabler, referert til som hovedkomponenter. PCA ble anvendt for å oppnå en objektiv vurdering av hvorvidt eller ikke den MALDI-TOF MS peptid uttrykk data selv sorteres i grupper som svarer til pasienter med CIN, livmorhalskreft og friske kontroller uten CIN /livmorhalskreft. Differensial peptid og protein-ekspresjon ble sammenlignet ved uparet, to-halet t-test ved hjelp av MALDI justert spektra og den gjennomsnittlige topp klyngen område for de enkelte peptider. En p-verdi på 0,05 ble betraktet som signifikant. Forskjellig uttrykt peptider ble valgt for tandem MS analyse bruker AB4700 Proteomics Analyzer.
Resultater
plasmaprøver fra 67 kvinner deltar Divisjon for gynekologisk onkologi klinikk og 4 friske frivillige var samlet for DSC-analyse. Fordelingen av prøvetall var som følger: kontroll = 4, CIN 1 = 3, CIN 2 = 4, CIN 2-3 = 3; CIN 3 = 22, IC = 35 (FIGO stadium I = 14, II = 10, IIIb = 7, IV = 4); aldersgruppe = 18-69 år (gjennomsnitt 38,7 år) (Tabell S1). Komplett demografisk og klinisk informasjon, inkludert biopsi-påvist CIN og IC status, ble sammenstilt for alle eksemplarer av medlemmer av den kliniske studien team. Prøver som er levert til den grunnleggende vitenskapen studie laget deidentified og blottet for all demografisk og klinisk informasjon. DSC-analyse av plasmaprøvene ga normalisert basislinjekorrigerte dupliserte termogrammer for hver prøve. På dette stadiet, ble klinisk og demografisk informasjon gitt til den grunnleggende vitenskapen team for senere analyser.
Vi har tidligere vist at termo av plasma hentet fra friske individer er representativ for den termiske denaturering av de mest tallrike plasmaproteiner vektet i henhold til deres gjennomsnittlige normale plasmakonsentrasjon [18]. For denne studien ble termogrammer av plasma fås fra friske frivillige i gjennomsnitt en studie spesifikke «sunn control «profil som står for de spesifikke innsamling og håndtering av protokoller som benyttes i denne studien å skaffe. Til sammenligning ble tidligere utgitt gjennomsnittstermo innhentet fra 15 friske individer: 9 gutter og 6 jenter (11 afrikanske amerikanske og fire kaukasiske) i alderen 22 til 50 år (gjennomsnitt 37,0 år). Den midlere termogrammet har et areal på 5,02 ± 0,23 cal /g og et første øyeblikk temperatur (T
FM) på 67,4 ± 0,8 ° C. Studien spesifikke «sunn control «profil hentet fra 4 kaukasiske kvinner med en tilsvarende aldersgruppe i forrige undersøkelse (25-50 år, mener 39,3 år) sammenligner godt med tilsvarende område (4,94 ± 0,19 cal /g) og T
FM (66,3 ± 0,3 ° C) verdier
termogrammer ble i gjennomsnitt i løpet av fem kliniske grupper:. kontroll, LSIL, HSIL, trinn i og trinn II-IV. De midlere termogrammene er adskilt fra hverandre og viser en progressiv endring i profilform (figur 1A). Den viktigste overgang i området 60-65 ° C blir gradvis lavere med en økning i amplituden av den andre overgang rundt 70 ° C. Hver klinisk gruppe ble undersøkt for effekten av pasient demografiske faktorer, spesielt alder, etnisitet, røykestatus og paritet med ingen signifikant effekt funnet på gjennomsnittstermogrammer. Variansen knyttet til hver gruppe profil ble undersøkt ved beregning av standardavvik ved hver temperatur, og konstruksjon av et plott av standardavvik på varmekapasitet som en funksjon av temperatur (figur 1B). Den friske kontrollgruppen viser den minste variansen over hele temperaturområdet. De andre kliniske grupper viser høyere strid forbundet primært med stor overgang ~65 ° C, så vel som andre overgangs ~70 ° C og dens høyere temperatur skuldre. Den observerte termo variansen er lik våre tidligere observasjoner [18], og gjenspeiler både forventet klinisk variasjon i plasmaproteinnivåer samt sykdoms assosiert protein modifikasjoner.
Mean termo profiler av overskudds spesifikk varmekapasitet (C
p
ex) versus temperatur (panel A) og standardavvik (panel B) for hver klinisk gruppe: kontroller (svart); LSIL (rød); HSIL (grønn); tidlig stadium IC [FIGO Stadium I] (blå); og avanserte IC [FIGO stadium II-IV] (cyan). Termo viser en progressiv dreining mot høyere denaturering temperaturer med økende sykdomsbyrde. Forskjellen plott av klinisk gruppe termosammenlignet med kontrollgruppen (panel C) viser negativ differanse topper ~62 ° C og økende skift og omfanget av høyere temperatur positiv forskjell topper. Disse er antatt å reflektere samspillet av sykdomsspesifikke komponenter med rikelig plasmaproteiner, hovedsakelig albumin, med resulterende termisk stabilisering og endring av plasmatermo profiler.
Endringer i termo profiler assosiert med sykdomsbyrden ble undersøkt gjennom DSC forskjell tomter som gjenspeiler endringer i konserntermogrammer i forhold til den friske kontrollgruppen (figur 1C). For hver CIN grad eller IC scenen, var det en negativ forskjell topp sentrert ~62 ° C med høyere temperatur positiv forskjell topper. De positive forskjellen toppene flyttet til høyere temperatur og økt i omfang med økt sykdomsbyrde. Den LSIL gruppen følger ikke denne trenden i positiv forskjell topper; dette kan skyldes dårlig definisjon av denne kliniske gruppen gitt de lave prøvenumrene (n = 3) som er tilgjengelig for evaluering. Selv om disse forandringene i termogrammet profil forbli under undersøkelse i vårt laboratorium de viser til den termiske stabilisering av plasma protein (er) med en denaturering profil som vises ~62 ° C.
