Abstract
Prognosen for tykktarmskreft (CRC) stadium II og III pasienter fortsatt en utfordring på grunn av vanskelighetene med å finne robuste biomarkører som er egnet for testing av kliniske prøver. Flertallet av publiserte gen signaturer av CRC er blitt generert på Dypfryst kolorektal vev. Fordi samling av frossent vev er ikke praktisk for rutinemessig kirurgisk patologi praksis vil en klinisk test som forbedrer prognostiske evner utover standard patologisk iscenesettelse av tykktarmskreft må være utformet for formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev. Den NanoString NCounter
® plattformen er en genuttrykk analyseverktøy utviklet for bruk med FFPE-avledet prøver. Vi har utformet en tilpasset NCounter
® codeset basert på elementer fra flere publiserte ferske frosne vevet microarray-baserte prognostiske gen signaturer for tykktarmskreft, og vi brukte denne plattformen til å systematisk sammenligne genuttrykk data fra FFPE med matchet microarray tabelldata fra frosne vev . Våre resultater viser moderat korrelasjon av genekspresjon mellom to plattformer og oppdagelsen av en liten undergruppe av gener som kandidat biomarkører for tykktarmskreft prognose som kan påvises og kvantifiserbare i FFPE- vevssnitt
Citation. Chen X, Deane NG, Lewis KB, Li J, Zhu J, Washington MK, et al. (2016) Sammenligning av Nanostring NCounter
® data på FFPE tykktarmskreft Prøver og Affymetrix microarray data på matchede Frosne vev. PLoS ONE 11 (5): e0153784. doi: 10,1371 /journal.pone.0153784
Redaktør: Xiaofeng Wang, Cleveland Clinic Lerner Research Institute, UNITED STATES
mottatt: 12 februar 2016; Godkjent: 04.04.2016; Publisert: 13. mai 2016
Copyright: © 2016 Chen et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Dataene er tilgjengelig i Gene database (GSE62932) Expression studenter (GEO)
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av National Institutes of Health stipend CA158472 og CA095103 til XC, NGD, KBL, JZ, MKW, og RDB. JL fikk støtte i form av lønn fra Affymetrix. Den spesifikke rolle denne forfatteren er uttrykt i Kunstner Bidrag delen. Disse organer spilte ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
identifisering av tykktarmskreft (CRC) pasienter som enten mer eller mindre sannsynlighet for å ha nytte av adjuvant systemisk kjemoterapi etter kirurgisk reseksjon utgjør en stor udekket behov i å gi trygg og effektiv behandling. Dagens praksis kan føre til underbehandling av enkelte høyrisiko stadium II pasienter, og potensialet over-behandling av lav-risiko stadium II og stadium III pasienter [1]. Kjernen hindringen er mangel på definitive diagnostiske biomarkører for å identifisere kreft med en høy sannsynlighet for metastasering og tilsvarende dårlig klinisk utfall som er mer sannsynlig å dra nytte av systemisk kjemoterapi; og omvendt, for å identifisere de pasientene på svært lav risiko ( 10%) som er usannsynlig å utlede betydelig nytte av kjemoterapi [2-6]. Oversettelse av microarray-baserte profiler i klinisk diagnostikk som biomarkører er komplisert av det faktum at den teknologien som kreves for å gjengi dem har tidligere pålagt ferske reparerte vevsprøver, og det er et gap mellom en voksende kropp av genomisk informasjon og diagnostiske programmet. Evnen til genekspresjonssignaturer å forutsi tilbakefall og klinisk utfall sterkt hevder at høy og lav risiko fenotyper er molekylært kodet i primærsvulster [7-9]. Likevel, en robust prognostisk signatur aktuelt i klinisk setting har ennå ikke utviklet for kolorektal kreft på grunn av variasjon i metoder og prosedyrer for bevaring av kirurgiske prøver, variasjon i mengde og kvalitet av renset RNA tilgjengelig for analyse, tumor heterogenitet spørsmål og reproduserbarhet og robusthet av analysen plattformen. Fordi samling av ferske frosne vev er ikke rutine, vil en klinisk test for å bedre iscenesettelse av tykktarmskreft må være utformet for formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev for å være allment gjeldende.
NanoString NCounter
® systemet har blitt brukt til å kvantifisere genuttrykket av ulike gen signaturer for flere vevstyper inkludert FFPE-prøver [10-13]. Vi har utviklet en tilpasset NCounter kodesett for kvantitativ vurdering av uttrykk av 414 genet elementer. Denne analysen består av flere publiserte gen signaturer for tykktarmskreft prognose pluss flere kandidat genet elementer hentet fra pågående studier i intestinal stamcellebiologi og epitelial til mesenchymale overgang (EMT). For å finne ut hvilke elementer av prognostiske signaturer kan oversettes fra Dypfryst vev til arkiv FFPE avledet pasient RNA prøver, vi systematisk sammenlignet uttrykket resultatene for de 414 genene fra NCounter plattformen ved hjelp FFPE-avledet vev og fra en microarray array plattform ved hjelp matchet frosset vev.
Materialer og metoder
Experiment design og prøve beskrivelse
det menneskelig vev som brukes for microarray analyse ble samlet og kommentert i henhold til etablerte protokoller og godkjent av de aktuelle Institutional Review Boards (IRB) ved Vanderbilt University (VUMC). Alle vev ble samlet inn over tidsperioden 1999-2011. Tumorstadium ble vurdert av amerikanske Joint Commission on Cancer retningslinjer. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter før inklusjon i studiene. Kvalitetsvurdering objektglass ble oppnådd for å bekrefte diagnose og mengden av cellemateriale for hver prøve. De identifiserte humane tumor vev for immunhistokjemi ble oppnådd med VUMC IRB godkjennelse. For microarray studier representative deler av friske vevsprøver ble flash-frosset i flytende nitrogen i løpet av 20 minutter etter reseksjon og lagret ved -80 ° C inntil RNA isolasjonstrinnet. Median (minimum-maksimum) frosset vev lagringstid fra dato for reseksjon til RNA ekstraksjon er 455 (35-2858) dager. RNA ble renset fra vevssnitt som inneholder 80% epitelial tumor vev ved hjelp RNeasy (QIAGEN, Valencia, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Prøvene ble hybridisert til Affymetrix arrays Human Genome U133 Plus 2.0 Genechip Expression Arrays, Santa Clara, CA), som omfattet ca 39 000 menneskelige gener. Prøvene inkluderte fire friske kontrollpasient vev, 12 trinn I, 17 trinn II, 20 scene III og 15 scene IV CRC pasient vev. Den detaljerte prøven informasjon, inkludert suvival data finnes i S1 tabell.
For NCounter studier, arkivert kreft FFPE- prøver tilpasset frosne vev beskrevet ovenfor ble identifisert og behandlet av Vanderbilt translasjonell patologi og Imaging Core anlegget. Vevene ble fiksert i 4% paraformaldehyd, innstøpt i parafin og lagret ved romtemperatur inntil RNA-ekstraksjon. Median (minimum-maksimum) FFPE vev lagringstid fra dato for reseksjon til RNA ekstraksjon er 1021 (364-3483) dager. Den første 20 pm av vevet ble forkastet før skjæring seksjoner for RNA-ekstraksjon. Vevssnitt ble montert på uladede glass og en av de vev delen glir ble farget med H E for kvalitetskontroll fra hvert vev blokk. RNA ble renset fra 5 um tykke vevssnitt som inneholder mer enn 80% tumor ved hjelp av høy Pure FFPE RNA Micro Kit (Roche) i henhold til produsentens instruksjoner. Et minimum på 4 deler pr prøven var nødvendig. MRNA hybridisering, deteksjon og skanning ble fulgt protokollen og fremført av NanoString Technologies.
NCounter codeset utvikling
Vi har utformet en tilpasset NCounter
® analysen (NanoString Technologies, Seattle, Washington) for kvantitativ vurdering av ekspresjon av genet 414 elementer. Det multipleksede analysen kan påvise ekspresjon av opptil 800 transkripter i meget lave konsentrasjoner (mRNA 0.1fM /en kopi pr celle) [14] til og med i RNA-prøver som gir betydelig redusert, så lenge som mer enn 20% av prøven er RNA-fragmenter på mer enn 300 basepar [13]. Tabell 1 viser alle gen signaturer som er involvert i NCounter codeset. Vi inkluderte genet elementer fra vår 34-genet signatur [9], samt elementer fra publiserte signaturer [7, 8, 15-24] i NCounter analysen, velge de som var representert i ≥2 signaturer. Femti flere kandidat gener av interesse knyttet til EMT og studiet av metastatisk atferd i kreftceller (f.eks E-cadherin, Smad4, Zeb1, sneglen, Slug, Twist, beta-catenin, etc.) ble også lagt til analysen. Den komplette listen med genet symboler og kildene til 414-genene kan bli funnet i S2 og S3 bord.
Bioinformatikk og statistiske dataanalyse
Affymetrix microarray data ble normalisert ved hjelp av robust multichip gjennomsnitt (RMA) algoritme som implementert i Bioconductor pakken
Affy product: [25]. De batch effekter ble justert ved Combat tilnærming tilgjengelig i Bioconductor pakken
SVA product: [26]. NanoString NCounter data kvalitetskontroll og normalisering ble utført ved hjelp av R-pakke
NanoStringNorm product: [27]. For gruppesammenligninger, t-test i
Limma
pakke i Bioconductor ble brukt til å identifisere forskjellig uttrykt probe sett mellom svulsten og normalt vev i begge Affymetrix og NCounter plattformer [28]. For å overleve analyse ble Cox proporsjonal hazard brukt til å teste sammen med total overlevelse utfall for hver kandidat gen ved hjelp av R-pakke
overlevelse
.
I denne studien, for å gjøre direkte sammenligning mellom Affymetrix HGU133plus 2 og NCounter genuttrykk data, må vi først fant de best matchet Affymetrix microarray prober til NanoString NCounter sonder. Mot dette formål, brukte vi genet symbol eller karakter ID for å koble NanoString NCounter IDer og Affymetrix Probe IDer. Dersom genet hadde bare en unik sonde, så vi brukte det Probe ID som kampen for NanoString. Ellers, hvis genet hadde flere sonder, så vi plukket den med den største Smith-Waterman justering poengsum, som ble beregnet ved Smith-Waterman algoritmen for å identifisere homologe regioner mellom sekvenser ved å søke etter optimale lokale justeringer, mellom NanoString NCounter og Affymetrix Probe sekvenser som kampen for NCounter [29]. Begge microarray og NCounter data er tilgjengelige i Gene Expression studenter (GEO) database (GSE62932).
Resultater
Kvalitet utklippede RNA
RNA Integrity Numbers (RIN) verdier var oppnås ved hjelp av en Agilent Bioanalyzer instrument for både frossen og FFPE avledet RNA prøver. Instrumentet programvare genererer en RIN poengsum basert på hele sin elektroferogrammet. RIN verdier spenner 1-10, der 1 er helt degradert RNA og 10 er høy kvalitet (intakt) RNA. For microarray studier, en cut-off av RIN = 7,0 ble brukt. RIN verdiene varierte fra 7-10, med en median på 8,5 og mener på 8,4. For NCounter studier, RIN verdier varierte fra 0-8, med en median på 2,4 og mener på 2,5. I tillegg, for å være akseptable for analyse for NCounter, ≥20% av RNA-prøven måtte inneholde fragmenter av minst 300 basepar i lengde. Detaljene resultatene ble inkludert i S4 tabell.
Data kvaliteten NCounter og microarray
Etter pre-prosessering og normalisering, log2 transformerte data fra 414 gener av både microarray og NCounter ble sammenlignet. Fordelinger av signalintensitet for alle prøvene er vist med boksplott i S1 fig. Å trekke genekspresjon fordeling, ble hver av de 414 gener som er representert ved den midlere verdi for 68 prøver. Fig 1 sammen genekspresjon distribusjoner basert på NCounter og mikromatriser. NCounter data viste en bimodal fordeling som er sannsynlig på grunn av RNA degradering i FFPE-prøver. I mer detalj, har vi funnet at ~ 70% av genene hadde median normalisert ekspresjons verdier i 5-10 vilkårlig enhet området på begge plattformer. I motsetning til omtrent 15% av genene viste meget lave normaliserte uttrykk verdier (≤ 5 vilkårlige enheter) på NCounter plattformen mens bare 8% av genene utført som dårlig på microarray plattformen. Omvendt, bare 14% av genene viste uttrykk robuste median uttrykk verdier ( 10 vilkårlige enheter) på NCounter plattformen, mens nærmere 23% av genene ga robuste signaler på microarray plattform. I sammendraget, mengden av brukbare data oppnådd ved hjelp av NCounter plattformen var lav i forhold til det som oppnås på microarray plattform.
Hyppigheten av gener (414 elementer totalt) tegnes mot mediannormaliserte uttrykk verdier over x -aksen.
for å undersøke reproduserbarheten av NCounter plattformen ble seks FFPE-prøver valgt å generere to tekniske replikater for hver prøve. S2 Fig viser scatterplots av log2-transformert teller mellom alle par av replikater. Den gjennomsnittlige korrelasjonskoeffisient er 0,983, noe som indikerer at NCounter plattformen er reproduserbar.
Utvalg og genet sammenhenger mellom NCounter og microarray
For hvert par av FFPE prøve kvantifisert ved NCounter og frisk frossen prøve kvantifisert av microarray ble Pearson korrelasjon beregnet basert på normalisert, log2 forvandlet genuttrykk verdiene av de 414 genene. Gjennomsnittlig korrelasjon var 0,501 med 95% bootstrap konfidensintervall (0,412, 0,589), og minimum og maksimum korrelasjon var henholdsvis 0,337 og 0,591. Heatmap i figur 2 viser alle parvise korrelasjoner mellom FFPE og friske frosne prøver. Analysen basert på Spearman korrelasjon viste lignende resultater, som foreslo sammenhengen mønster mellom prøvene ble ikke påvirket av ulike normaliser siden normaliserings metodene ikke endre genet rangeringen innenfor hver prøve.
X-aksen representerer Dypfryst prøver og y-aksen representerer matchet FFPE-prøver.
for hver av 414 gener ble Pearson korrelasjon også beregnet mellom to vevstyper. Vi plottet histogrammet av gene-messig korrelasjonskoeffisienter i figur 3. bety korrelasjon av de 414 genene var 0.315 med 95% bootstrap konfidensintervall (0,248, 0,385), og minimum og maksimum korrelasjon var henholdsvis -0,250 og 0,784. Gene-messig sammenheng representerer samstemmighet av genekspresjon verdier fra to uttrykk plattformer mellom to matchet vevstype. Grunnet NCounter er enkelt sonde design, gjorde noen gener ikke passer godt mellom to plattformer, som kan ha bidratt til den svake eller negative korrelasjoner. Det er rimelig å observere denne moderat samsvar fordi variasjoner i genekspresjon var fra to forskjellige plattformer og vevstyper. Den middels nivå av samsvar mellom gener også ført til tvetydige mønsteret mellom Dypfryst og FFPE-prøver som vises i figur 2.
X-aksen representerer Pearson korrelasjon på hver av 414 gener mellom Dypfryst prøver og FFPE-prøver og y -aksen representerer frekvensen.
Sammenligning av genuttrykk mellom NCounter og microarray
Etter preprosessering og normalisering, for å oppdage differensielt uttrykte gener mellom 64 svulsten og 4 normale prøver i NCounter eller microarray plattformer separat, brukte vi ordnet t-test som gjennomføres i
Bioconductor
pakke
LIMMA
. Ved hjelp av nominell p-verdi 0,05 som cutoff, ble 76 gener identifisert som signifikant forskjellig uttrykt gener i begge plattformene. Blant de 76 genene, ble 40 og 26 gener overexpressed og nedregulert i kreftprøver. Det var 30 og 60 viktige gener oppdaget i bare én plattform med NCounter og microarray henholdsvis, og 248 gener var ikke signifikant ved begge plattformene. Den komplette gen testing listene, inkludert koeffisient, nominell p-verdi og falske funnraten kan bli funnet i S5 og S6 Bord for henholdsvis NCounter og microarray,. Figur 4 viser sammenligningen av log2 ganger endring i svulsten til normal signalintensitet mellom NCounter og microarray for hver av 414 gener som ble valgt for NCounter codeset. De røde, grønne og blå prikker representerer 76, 90 og 248 gener signifikant forskjellig uttrykt i begge, enten, og verken plattformer hhv. Hvis vi bruker FDR 0,1 som cutoff, var det 48, 72 og 294 gener signifikant forskjellig uttrykt i begge, enten, og verken plattformer hhv.
log2 ganger endring i svulsten til normal signalintensitet for 414 gener sammenligne resultater fra NCounter (x-aksen) og microarray (y-aksen). De røde, grønne og blå prikker representerer 76, 90 og 248 gener signifikant forskjellig uttrykt i begge, enten, og verken plattformer hhv.
Association of NCounter og microarray genuttrykk med overlevelse utfallet
Vi har også undersøkt sammenhengen av genuttrykk med total overlevelse utfall av 64 pasienter ved hjelp av en Cox proporsjonal risikomodell. Ved hjelp av en nominell p-verdi 0,05 som terskelen, var det 6 signifikant assosiert gener inkludert PPL, CCND1, EXT2, S100A11, USP9X, og PHLDA1 av begge plattformene, 25 viktige gener ved NCounter og 24 viktige gener ved mikromatriser. PPL, CCND1, S100A11, og PHLDA1 var assosiert med høyere fare, og EXT2 og USP9X var assosiert med bedre prognose. Flertallet av genene (359 gener) ble ikke signifikant assosiert med total overlevelse utfall av begge plattformene på grunn av forholdsvis liten prøvestørrelse. Den komplette gen testing listene, inkludert koeffisient, nominell p-verdi og falske funnrate eller denne overlevelsesdataanalyse er i S7 og S8 Bord for henholdsvis NCounter og microarray,. Figur 5 viser loggen hazard ratio for total overlevelse utfall av de 414 genene forhold mellom NCounter og microarray data, med de røde, grønne og blå prikker som angir 6, 49 og 359 gener som har betydning overlevelse foreningen i to, en og verken plattformer . For de seks genene som er identifisert av begge plattformene, tidligere studier viste at CCND1 og S100A1can brukes som biomarkører for tykktarmskreft prognose [30, 31], og inhibering av USP9X kan øke tumorcelle følsomhet for noen kjemoterapeutiske midler [32, 33] .
Logg hasardratio for svulst i normal signalintensitet for 414 gener vs total overlevelse utfall sammenligner resultater fra NCounter (x-aksen) og microarray (y-aksen). De røde, grønne og blå prikker representerer 6, 49 og 359 gener signifikant assosiert med overlevelse utfall i begge, heller, og verken plattformer hhv.
Diskusjoner
Kvaliteten på mRNA-transkript kvantifisering i FFPE-prøver er avgjørende for translasjonell kreftforskning. I denne studien ble våre sammenligninger basert på målinger av NanoString sin NCounter plattform ved hjelp FFPE-avledet prøver og Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Genechip Expression Arrays på pasienten matchet Dypfryst vev. Ideelt sett ville mRNA kvantifisering bruker samme plattform på matchet FFPE og frosne vev lage en mer direkte sammenligning. Men, for å avgjøre om gen signaturer utviklet ved hjelp av ferske frosne vev er aktuelt for kliniske prøver, sammenligninger mellom de to plattformene ved hjelp matchet, men forskjellig arkiv vev, er nødvendig.
NCounter baserte mRNA profilering ved hjelp FFPE tekniske replikater viste høy reproduserbarhet av plattformen lik den tidligere studie [10]. Men den gjennomsnittlige korrelasjonskoeffisienter var 0,501 og 0,315 for parede FFPE- /fersk frosne prøven korrelasjoner og matchet gen sammenhenger hhv. Disse resultatene indikerer moderate korrelasjoner mellom NCounter (FFPE) og microarray (fersk frosset) data.
For tumor og normal gruppesammenligninger, 166 av de 414 gener ble identifisert som signifikant forskjellig uttrykt gener ved begge plattformene og at disse 166 gener, 76 gener (46%) ble uttrykt concordantly mellom de to plattformene. Demonstrere en sammenheng med overlevelse utfall er mer utfordrende, bare 11% gener (6 gener) blant signifikant assosiert gener (55 gener) ved begge plattformene var konkordant.
Flere faktorer kan påvirke disse eksperimentelle resultatene. Den NCounter plattform, i sin natur, representerer en tilpasset bygge av kandidat genet elementer som en biomarkør, og dermed valg av gener i en NCounter codeset iboende begrensninger
i silico
sammenligninger med andre publiserte studier. Graden av RNA degradering er et utfordrende utfordringen transkriptom profilering strategier bruker FFPE-avledet prøver. For eksempel, en fersk studie på leverkreft vist at mRNA-transkript målinger oppnås ved hjelp av NCounter system for arkiverte seksjonert FFPE-prøver sammenlignet dårlig med nyklipt FFPE- vev [11]. Dette problemet er relatert både til problemet med variasjon i prøvepreparering og til utstedelse av iboende heterogenitet tumor reflektert i målbare molekyl forskjeller mellom tilstøtende vevssnitt. I denne studien NanoString Technologies gitt enkelt sonde design basert på karakterutskriften frekvens for vår gen panel, men ved hjelp av multiple probe utforming kan være en strategi for å forbedre NCounter datakvalitet.
Archived FFPE bevarte svulstvev forblir mest tilgjengelige vev prøven kilde for storstilt utbygging og validering av prognostiske og prediktive genetiske signaturer for tykktarmskreft. Identifikasjon av undergrupper av arkiv tumorvev produserer høyere kvalitet RNA prøver for uttrykk profilering er en tilnærming for å forbedre biomarkør utviklingen fra disse prøvene. Forbedringer i teknologi som nye FFPE RNA ekstraksjon protokoller, nye FFPE RNA forsterkning og merkemetoder, og modifiserte databehandling arbeidsflyt kan også bidra til side-trinns saker av RNA degradering og forbedre transkriptom datakvalitet fra RNA-Seq eller microarray [34- 36]. I denne studien, viste vi at genet signatur utviklet på microarray genuttrykk data ved hjelp av ferske frosne prøvene ikke kan være direkte relevant for NCounter data basert på FFPE-prøver. Men vi demonstrert at en liten del av genene hadde stabil ekspresjon mønstre i både NCounter og microarray plattformer, og uavhengig av hvorvidt lysatene var avledet fra ferskt frosset eller FFPE-avledet prøver. Oppfølgingsstudier på disse genene kan bidra føre til mer klinisk nyttig biomarkører for tykktarmskreft.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Fordelinger av signalintensitet av 68 prøver (individuelle boksplott) ved NCounter og microarray
doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s001 product: (PDF)
S2 Fig. Scatterplot av de normaliserte tellinger fra 414 individuelle genetiske elementer ved hjelp av en splittet prøve fra seks FFPE bevart kreft utdrag (blindet tekniske replikater) på NCounter plattformen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s002 plakater (PDF)
S1 Table. Den kliniske opplysninger av 68 prøver
doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s003 plakater (CSV)
S2 Table. Den komplette listen med genet symboler og kildene til 414-gener for NCounter codeset
doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s004 plakater (CSV)
S3 Table. Listen over matchet Affymetrix probe IDene til 414-gener for NCounter codeset
doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s005 plakater (CSV)
S4 Table. RNA ekstraksjon RIN verdier
doi: 10,1371 /journal.pone.0153784.s006 plakater (CSV)
S5 Table. De forskjellig uttrykt gen testresultater for NCounter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s007 plakater (CSV)
S6 Table. De forskjellig uttrykt gen testresultater for microarray
doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s008 plakater (CSV)
S7 Table. Testresultater tilknytningsoverlevelses utfall for NCounter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s009 plakater (CSV)
S8 Table. Testresultater av tilknytning til overlevelse utfall for microarray
doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s010 plakater (CSV)
