Abstract
Bakgrunn
Det har vært motstridende rapporter om funksjon av MIR-20a i en rekke krefttyper og vi tidligere har funnet det å være dysregulerte i sporadisk versus familiær papillær skjoldbruskkjertelkreft. I denne studien, studerte vi uttrykket av MIR-20a i normale, godartede og ondartede skjoldbrusk prøver, og dens effekt på skjoldbruskkjertelen kreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
.
metodikk /hovedfunnene
uttrykk for MIR-20a i normal, godartet og ondartet tyroideavev ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Tyroid kreft celler ble transfektert med MIR-20a, og effekten på cellulær proliferasjon, tumor sfæroide dannelse, og invasjon ble evaluert. Målgener av MIR-20 ble bestemt av genom-wide mRNA uttrykk analyse med MIR-20a overekspresjon i skjoldbruskkjertelen kreftceller og mål prediksjon database. Målgener ble validert av kvantitativ PCR og immunoblotting, og luciferase analyser. MiR-20a uttrykk var betydelig høyere i anaplastisk skjoldbruskkjertelkreft enn i differensiert skjoldbruskkjertelen, og godartede og normal skjoldbruskkjertelen vev. MiR-20a betydelig hemmet tyreoideakreft celleproliferasjon
in vitro product: (p 0,01) og
in vivo product: (p 0,01), tumor spheroid dannelse (p 0,05) og invasjon (p 0,05) i flere thyroid kreft-cellelinjer. Vi fant ut at
LIMK1
var et mål av MIR-20a i skjoldbruskkjertelen kreftcellelinjer og direkte knockdown av LIMK1 rekapitulert effekten av MIR-20a i skjoldbruskkjertelen kreftceller.
Konklusjon /Betydning
så vidt vi vet, er dette den første studien som viser at MIR-20a spiller en rolle som en tumor suppressor i skjoldbruskkjertelen kreftceller og mål
LIMK1
. Våre funn tyder på at oppregulert uttrykk for MIR-20a i anaplastisk skjoldbruskkjertelen motvirker skjoldbruskkjertelkreft progresjon og kan ha terapeutisk potensial
Citation. Xiong Y, Zhang L, Kebebew E (2014) MiR-20a oppreguleres i Anaplastisk Thyroid Kreft og Mål
LIMK1
. PLoS ONE 9 (5): e96103. doi: 10,1371 /journal.pone.0096103
Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina
mottatt: 31 januar 2014; Godkjent: 03.04.2014; Publisert: 23 mai 2014
Copyright: © 2014. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health, National Cancer Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Thyroid kreft er den vanligste endokrine kreft, og en av de raskest voksende kreftdiagnoser i USA [1], [2]. Skjoldkjertelkreft kommer fra follikulære celler og parafollicular celler [3], [4]. Thyroid kreft stammer fra follikulære celler står for over 95% av alle skjoldbrusk kreft tilfeller og er klassifisert i fire store histologiske grupper (papillær skjoldbruskkjertelkreft (PTC), follikulær skjoldbruskkjertelkreft (FTC), Hürthle cellekreft (HCC), og anaplastisk thyroideakarsinom (ATC)). MicroRNAs (mirnas) har vist seg å være dysregulerte i skjoldbruskkjertelkreft som stammer fra follikulære celler [5] – [7]. Mirnas er små, ikke-kodende RNA, som er omtrent 21 nukleotider lang og regulerer genekspresjon [8], [9]. Vanligvis mirnas binder seg til den 3′-ikke-translaterte området (3′-UTR) av mål-genet, som fører til fortrengte oversettelse eller degradering av mRNA [9], [10].
MiR-20a er et medlem av den MIR-17-92 klynge lokalisert på kromosom 13. Tidligere studier har vist at MIR-20 kan fungere for å fremme eller hemme kjennetegnene til malign cellefenotype i en celletype spesifikk måte [11] – [13]. For eksempel hemmer MIR-20a overekspresjon celleproliferasjon, invasjon, og tumormetastaser i brystkreftcellelinjer [11], [12]. På den annen side, MIR-20a undertrykker
E2F1
ekspresjon i humane B-cellelinje P-493-6, en transkripsjonsfaktor som fremmer G1-S-faseprogresjon i pattedyrceller [14]. Dette funnet tyder på at Mir-20a funksjon kan være forskjellig avhengig av celletype. Vi har tidligere funnet MIR-20a å bli oppregulert i familiær PTC sammenlignet med sporadiske tilfeller, som antas å være mer aggressive [3], [15]. Takakura et al. [16] fant også at mirnas av Mir-17-92 cluster (MIR-17-3p, -17-5p, -18a, -19a, ^ 20, -19b, og -92-1) ble overuttrykt i ATC celle linjer.
i denne studien, karakteriserer vi uttrykket av MIR-20a i normale, godartede og ondartede skjoldbrusk prøver, og studerte sin effekt på skjoldbruskkjertelkreft celler
in vitro Hotell og
i vivo
. Vi utførte også analyse av MIR-20a målgener benytter mål prediksjon database og genom-wide uttrykk med MIR-20a overekspresjon, og validert målet gener med luciferase assay. Til slutt viser vi at LIMK1 sammenfatter effekten av MIR-20a i skjoldbruskkjertelen kreftceller.
Materialer og metoder
Menneskelig thyroid vevsprøver og dyreforsøk
Thyroid vevsprøver var hurtigfrosset på tidspunktet for thyroidectomy under en protokoll godkjent av Office of human Subject Forskning ved National Institutes of Health Clinical Center, etter skriftlig informert samtykke. Alle vevsprøver gikk sekundær ekstra histologi gjennomgang av en endokrin patolog for å bekrefte diagnosen og identifisere prøver med mer enn 80% tumorceller. Vevsprøver ble klassifisert som normal, godartet (multinodulært struma, follikulær adenom, Hürthle celle adenom), differensiert skjoldbruskkjertelkreft [DTC] (klassisk PTC, follikulær variant av PTC, FTC), og ATC. Normal tyroideavev ble innhentet fra pasienter som gjennomgår thyroidectomy for godartet eller ondartet sykdom fra den kontralaterale thyroid lapp. I alt ble åtte ATC, 22 DTC, 24 godartet, og 11 prøver normale tyroideavev analysert.
The National Cancer Institute Animal Care og bruk komité godkjente protokoller for dyr omsorg og behandling i denne studien. Enhver mus opplever betydelig unormale nevrologiske utfall, blødning fra enhver åpning, nedsatt bevegelighet, hurtig vekttap, svekkende diaré, grov pels, krum holdning, tung pust, slapphet, persistent recumbence, gulsott, anemi, selvpåført traumer, blir døende eller ellers blir ute av stand til å skaffe mat eller vann, eller med en svulst 2 cm eller større i diameter har blitt umiddelbart avlivet av CO
2 kammer.
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og kulturforhold
Menneskelig skjoldbrusk kreft cellelinjer XTC-en (HCC) (vennlig levert av Dr. Orlo H. Clark (San Francisco, California)) [17], FTC-133 (FTC) (vennlig levert av Dr. Peter Goretzki (Tyskland)), og TPC-1 (PTC) (vennligst tilveiebrakt av dr Nabuo Satoh (Japan) [18]) ble opprettholdt i DMEM med 4500 mg /l D-glukose og L-glutamin, og 110 mg /l natrium-pyruvat, supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), thyroid-stimulerende hormon (TSH) (10 mU /ml), penicillin (10.000 U /ml), streptomycin (10 000 U /ml), Fungizone (250 mg /ml), og insulin ( 10 ug /ml) i en standard fuktet inkubator ved 37 ° C i en 5% CO
2 og 95% O
2 atmosfære. Serum-fritt medium (DMEM-F12-media), supplert med fire hormoner (insulin [10 pg /ml], somatostatin [10 ng /ml], transferrin [5 pg /ml], og hydrokortison [0,36 ng /ml]), ble anvendt for de funksjonelle genom studiene. Den menneskelige ATC cellelinje C643 ble vennlig levert av Dr. Rebecca Schweppe, med tillatelse fra Dr. N.-E. Heldin (Sverige) [18], og ble opprettholdt i RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA) inneholdende 10% FBS. Alle cellelinjer ble godkjent av kort tandem repeat den 9. oktober 2013 og den XTC-en cellelinje ble også bekreftet å uttrykke tyreoglobulin og natrium jod symporter som tidligere rapportert [17].
Mirna transfeksjon
Moden miRNA forløper (pre-MIR-20a, Applied Biosystems, Foster City, CA) ble transfektert inn i cellene i en konsentrasjon på 25 nM bruker Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, California), etter produsentens protokoll. En oligonukleotid ikke representerer noen kjente miRNA (Pre-MIR miRNA forløpermolekyler-Negative Control # 1; Applied Biosystems, Foster City, CA). Ble brukt som en negativ kontroll
siRNA transfeksjon
LIMK1 siRNA #A (ID s8188), siRNA #B (ID s8189) og siRNA #C (ID s 8190) (Applied Biosystems, Foster City, CA) ble transfektert inn i celler ved en konsentrasjon på 60 nM ved bruk av Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad , CA), etter produsentens protokoll. Lyddemper Velg negativ kontroll # 1 siRNA (Applied Biosystems) ble anvendt som en negativ kontroll.
RNA isolering og kvantitativ sanntids RT-PCR
Total-RNA ble isolert fra cellelinjer ved å bruke TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California). Den TaqMan mirna Assay (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ble anvendt for å måle miRNA ekspresjonsnivået. Totalt RNA ble reverstranskribert med et miRNA-spesifikk primer, etterfulgt av real-time PCR med TaqMan prober. U6 ble anvendt som en endogen kontroll. Den relative mengden av mRNA i
LIM kinase en product: (
LIMK1
) ble bestemt ved bruk av TaqMan analysen (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) på en ABI 7900 HT system, og menneskelig
GAPDH
ble anvendt som en endogen kontroll. Den ΔΔ Ct metoden ble brukt til å beregne uttrykket nivåer.
Western blot
Hel-cellelysat ble utarbeidet med RIPA buffer (Thermo Scientific, Rockford, IL). LIMK1 proteinnivået ble bestemt ved Western blot hjelp av en kanin polyklonale anti-LIMK1 antistoff (1:1500 fortynning, Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA). GAPDH protein ble påvist ved hjelp av en mus monoklonalt anti-GAPDH (# 0411) antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California).
spredningsanalyse
Celleproliferering ble bestemt ved bruk av CyQUANT Cell Proliferation Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge produsentens protokoll. Fluorescensintensiteten ble målt ved anvendelse av en fluorescens mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), med eksitasjon ved 485 nm deteksjon og emisjon ved 538 nm.
Invasion assay
Cellular invasjon ble målt under anvendelse av BD BioCoat Matrigel invasjonen Chamber (BD Biosciences, Bedford, MA), i henhold til produsentens instruksjoner. Cellekulturmedium med 10% FBS ble anvendt som en kjemoattraktant i det nedre brønn i Boyden kammer. Etter rehydratisering av basalmembran, ble thyroid kreft celler sådd ut i det øvre rom av kammeret i serumfritt medium (4 x 10
4 celler per brønn). Etter inkubering ved 37 ° C i 5% CO
2 i 22 timer, ble de ikke-invaderende celler fjernes fra den øvre overflaten, og cellene som hadde invadert membranen til den nedre overflate ble farget med Diff-Quik Stain sett (Siemens Healthcare Diagnostics, Inc., Newark, DE). Bilder ble tatt fra membranen av hver innsats under et mikroskop (50 × forstørrelse) ved hjelp av et digitalt kamera. Bildene ble vist på dataskjermen og cellene i enkelte felt i hver innsats ble talt manuelt. Den prosent av celler invaderende ble bestemt ved å telle antall celler invaderer gjennom Matrigel matriksen og membranen i forhold til det antall celler som migrerer gjennom membranen til kontroll innsatsene uten Matrigel matrisen. En invasjon indeks ble beregnet på grunnlag av forholdet mellom prosent av invaderende celler dividert med prosent av invaderende celler i kontrollceller.
sfæroide dyrknings
To dager etter transfeksjon miRNA, FTC-133 cellene ble trypsinert, tellet, resuspendert i kulturmedium og sådd ut i en Ultra Low klynge-plate (Costar, Corning, NY) på 3,5 x 10
4 per brønn. Platene ble dyrket ved 37 ° C i 5% CO
2, og mediet ble skiftet hver 2 til 3 dager. Etter 2 uker med kultur, ble cellene farget med krystallfiolett og fotografert under et mikroskop. Det totale areal som opptas av kulene i et bilde ble målt ved å omgi omkretsen av hver sfæroide, som markerer hele området, og å beregne piksel tall ved hjelp ImageJ programvare (Maryland, USA).
tumor xenograft studier
FTC-133 celler transfektert med MIR-20a eller MIR-NC ble inokulert subkutant (10
5 levedyktige celler) i venstre og høyre flankene av atymiske nakne mus. Svulster ble målt to ganger i uken med calipers, og volumene ble beregnet som lengde × bredde × høyde. Obduksjonstumorprøver ble fotografert å dokumentere grov morfologi, og deretter prøver ble veid.
Migrasjon analysen
Thyroid kreft celle migrasjon ble vurdert ved hjelp av en ripe sår analysen. 150.000 celler ble transfektert med mirnas (25 nM) eller sirnas (60 nM) og ble sådd ut i seks-brønners plater og tillatt å feste seg og vokse i 44 timer (mirnas) eller 72 timer (sirnas). Deretter ble tre vertikale sår laget med en steril 10-mL pipettespissen, og en horisontal linje ble laget på tvers av de tre linjene, slik at cellene kunne observeres på samme punkt. Cellene ble inspisert hver 12. time og målinger tatt opp til 24 timer.
Genome-wide mRNA uttrykk array-
FTC-133 celler ble transfektert med MIR-20a og MIR-NC. Tre dager etter transfeksjon ble cellene høstet. Total RNA ble ekstrahert fra cellene ved bruk av Trizol (Invitrogen, USA). RNA kvalitet ble sikret ved hjelp av Agilent RNA 6000 Nano kit og Bioanalyzer 2100. Ett hundre femti nanogram total RNA ble brukt til å utføre cDNA revers transkripsjon, syntese, forsterkning, fragmentering, og terminal merking med Genechip WT Sense Target Merking og kontroll reagenser (Affymetrix, Santa Clara, CA). Omtrent 25 ng /mL av cDNA ble hybridisert til Affymetrix menneskelige genet 1,0 ST Array Genechip. Arrays ble vasket og farget med lufthåndtering protokollen FS450_0007 prosedyre på Affymetrix lufthåndtering Station 450. Sonde intensiteter ble skannet med Genechip Scanner 3000. Rådata ble normalisert og analysert ved hjelp av Partek Genomisk Suite (Partek, Inc., St. Louis , MO). Variansanalyse ble benyttet for å bestemme sondesett som var signifikant forskjellig mellom de to gruppene. Genet Listen ble filtrert med en fold-endring cutoff på 1,5, noe som resulterer i en effekt av betydelig differensial uttrykk ved p≤0.05 og 1,5 ganger eller flere forskjeller.
Spådommer av mikro-RNA mål
TargetScan 5.1 (https://targetscan.org/) ble brukt for å identifisere potensielle mål for Mir-20a regulering i skjoldbruskkjertelen vev.
Luciferase reporter analysen
1223 basepar 3 « -UTR av menneskelig
LIMK1
ble klonet inn i en tom luciferase reporter vektor pEZX-MT01 (GeneCopoeia, Rockville, MD), genererer en villtype
LIMK1 UTR luciferase reporter konstruere plakater (pEZX-LIMK1 -UTR). For den doble luciferase assay ble FTC-133 celler sådd ut i tre eksemplarer i 12-brønners plater og co-transfektert med 0,25 mikrogram av reporter konstruere og 15 pmol av MIR-20a eller MIR-NC ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Etter 24 timer ble cellene lysert og analysert for både ildflue og Renilla luciferase med Luc-Pair MIR Luciferase Assay Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD) på en SpectraMax M5E mikroplateleser (Molecular Device, Sunnyvale, CA), ifølge produsentene «instruksjoner.
data~~POS=TRUNC analyse~~POS=HEADCOMP
data presentert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet. For å bestemme statistisk signifikans, ble avviksanalyse og t-test brukes etter behov. En p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
MiR-20a overexpressed i anaplastisk skjoldbruskkjertelkreft (ATC)
Vi har funnet uttrykket nivået av MIR ^ 20 var signifikant høyere i ATC enn i DTC, benigne og normale skjoldbruskkjertel vev (fig. 1). Det var ingen signifikant forskjell i MIR-20a ekspresjonsnivået av
BRAF
mutasjonstatus (p = 0,62) eller omfanget av sykdom (p = 0,70 for tumorstørrelse; p = 0,12 for lymfeknutemetastase) i DTC eller PTC .
Y aksen representerer relative MIR-20a uttrykk nivå normalisert til U6 (2
-ΔΔCt verdi). Kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp av total RNA fra 65 humane vev (8 ATCs, 22 DTC, 24 godartet og 11 normal). Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (* indikerer p 0,05).
MiR-20a regulerer skjoldbruskkjertelkreft celleproliferasjon, celleklump formasjon, og invasjon
Vi overexpressed MIR-20a i fire thyroid kreft-cellelinjer (TPC-1, XTC-1, FTC-133, og C643) under anvendelse av MIR-NC som en negativ kontroll for å bestemme dets virkning på celleformering. MiR-20a overekspresjon betydelig hemmet celleproliferasjon med 24% i TPC-1 celler på 144 timer (p 0,001), 34% i XTC-1 celler på 144 timer (p 0,001), 22% i FTC-133 celler i 144 timer (p 0,001), og 22% i C643 celler på 216 timer (figur 2A-D.). Vi evaluerte effekten av MIR-20a på tumorvekst
in vivo
. Vi fant at tumor-xenografter avledet fra FTC-133-celler transfektert med MIR-20a var betydelig mindre enn tumorxenografter fra MIR-NC (p 0,01) (Fig. 2e), og tumorvektene avledet fra FTC-133-celler transfektert med MIR-20a var også betydelig mindre enn tumorvektene i MIR-NC (p 0,05). (fig. 2F)
(A-D). Skjoldbruskkjertelkreft cellelinje spredning med MIR-20a overekspresjon. Y-aksen representerer celletallet. (E-F) Thyroid kreft
in vivo
vekst,
ex vivo
kreft avlinger og vekt. Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (* indikerer p 0,05; ** indikerer p 0,01)
Vi studerte også effekten av MIR-20a på skjoldbruskkjertelkreft celletumor spheroid formasjon.. FTC-133-cellelinjen danner kulene når de ble dyrket i ultra-low heftkulturflaske og med MIR-20a transfeksjon, antallet og størrelsen av sfæroider ble signifikant redusert (fig. 3).
(A) Representative bilde av kuler i kultur med MIR-20a overekspresjon. (B) Kvantifisering av celleklump forskjell MIR-20a overekspresjon. Det totale areal som opptas av sfæroidene i løpet av et bilde ble målt ved å omgi omkretsen av hver sfæroide, som markerer hele området, og å beregne piksel tall med ImageJ programvare (Maryland, USA). Y-aksen representerer størrelsen og antallet av sfæroidene. Feilfelt representerer SEM (* indikerer p 0,05)
MiR-20a overekspresjon betydelig hemmet celle invasjon med 85% i TPC-1 celler (p 0,01)., 67% i XTC-1 celler (p 0,001), 61% i FTC-133 celler (p 0,001), og 87% i C643 celler (p 0,01) (fig 4.). ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom celler transfektert med MIR-20a og MIR-NC i sårhelende analyse ved hjelp av TPC-1 celler og FTC-133 celler.
(A) TPC-en skjoldbruskkjertelkreft cellelinje, (B) XTC-1 skjoldbruskkjertelkreft cellelinje, (C) FTC-133 thyroid kreft cellelinje, og (D) C643 tyreoideacancer cellelinje. Y-aksen representerer invasjonen indeks over skjoldbruskkjertelen kreftceller. Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (* indikerer p 0,05; ** indikerer p 0,01; *** indikerer p 0,001)
MiR-20a regulerer LIMK1 uttrykk i skjoldbruskkjertelen kreftceller
Gitt at Mir-20a hatt en effekt på celleproliferasjon og invasjon
in vitro Hotell og
in vivo
, var vi interessert i å bestemme målet genet (r) av speil 20a. Vi brukte to tilnærminger til å bestemme MIR-20a mål: (1) et mål prediksjon database og (2) genom-wide uttrykk analyse med MIR-20a overekspresjon. Vi fant 3635 spådde målgener for Mir-20a bruker TargetScan 5.0-programvaren. Vi fant 58 gener med endret uttrykk på MIR-20a overekspresjon hjelp genom-wide uttrykk analyse. Blant de 45 gener hvis ekspresjon nivået ble nedregulert, ble 37 gener predikert målgener fra Mir-20a (tabell 1).
LIMK1
var den mest nedregulert gen fra denne analysen og har tidligere blitt rapportert å ha en rolle i tumorcelleinvasjon og metastase [19] – [22]. Dermed var vi interessert i å avgjøre om
LIMK1
var et direkte mål på MIR-20a. Vi fant ut at LIMK1 protein uttrykk i skjoldbrusk kreft cellelinjer (C643, XTC-en, FTC-133, og TPC-1) ble redusert med MIR-20a overekspresjon (Fig. 5A). Nedgangen i LIMK1 protein uttrykk ble observert i opptil 14 dager etter transfeksjon (Fig. 5B).
(A) immunoblotter for LIMK1 protein uttrykk i C643, XTC-en, FTC-133, og TPC-en cellelinjer, som ble transfektert med enten MIR-20a eller MIR-NC i 72 timer. (B) immunoblotter for endogen LIMK1 og GAPDH i FTC-133 celler transfektert med enten MIR-20a eller MIR-NC i 7 dager, 14 dager og 21days.
For å finne ut om hvorvidt
LIMK1
var et direkte mål på MIR-20a, vi brukte en luciferase reporter vektor pEZX-MT01 med 3′-UTR av menneskelig
LIMK1
klonet inn i det, genererer en
LIMK1
3′-UTR luciferase reporter konstruksjon (pEZX-LIMK1-UTR). Vi utførte luciferasepreparater analyser med pEZX-LIMK1-UTR (vektor med 3′-UTR av LIMK1) ko-transfektert inn i FTC-133 cellelinje med MIR-20a eller MIR-NC. Vi fant betydelig redusert luciferase aktivitet med MIR-20a overekspresjon sammenlignet med negativ kontroll (Fig. 6A), noe som tyder på at MIR-20a direkte nedregulerer
LIMK1
uttrykk. Gitt at MIR-20a overekspresjon downregulated
LIMK1
i skjoldbruskkjertelen kreftcellelinjer og de mest fremtredende effekten av MIR-20a på skjoldbrusk kreft celler var hemming av cellulær invasjon, vi undersøkt om
LIMK1
har en effekt på cellulær invasjon og migrasjon. Vi fant at knockdown av
LIMK1
førte til nedsatt cellulær invasjon, men ikke migrering (Fig. 6B og C).
(A) luciferaseaktivitet av pEZX-LIMK1-UTR i FTC-133 cellene når co-transfektert med MIR-20a eller MIR-NC. Alle luciferase-målinger ble foretatt i tre paralleller og avlesninger ble utført ved 24 timer etter transfeksjon. Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (* indikerer p 0,05). (B)
LIMK1
siRNA knockdown i FTC-133 skjoldbruskkjertelkreft cellelinje. LIMK1 mRNA uttrykk av kvantitativ RT-PCR (topplaten). LIMK1 protein uttrykk ved Western blot (nederst panel). Dataene som vises, er i 72 timer etter transfeksjon siRNA. (C) Cellular invasjon med LIMK1 knockdown. Transfeksjon av
LIMK1
sirnas hemmet FTC-133 tyreoideakreft celler invasjon. Y-aksen representerer invasjonen indeks over skjoldbruskkjertelen kreftceller. Dataene som vises, er i 72 timer etter transfeksjon siRNA. Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (* indikerer p 0,05; ** indikerer p 0,01). (D) Transfeksjon av
LIMK1
sirnas ikke har noen virkning på migrering av FTC-133 thyroid kreft celler. Y-aksen representerer såret avstand. Dataene som vises, er i 72 timer etter transfeksjon siRNA. Feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet.
Diskusjoner
I denne studien fant vi MIR-20a ble overexpressed i ATC i forhold til DTC, godartet og normal skjoldbruskkjertelen vev. Ektopisk overekspresjon av MIR-20a betydelig hemmet tyreoideakreft celleproliferasjon
in vitro Hotell og
in vivo
, og betydelig hemmet svulst spheroid dannelse og invasjon i flere skjoldbruskkreftcellelinjer. Dette tyder på at Mir-20a har en svulst undertrykkende funksjon når det er oppregulert i skjoldbruskkjertelen. Vi fant også at Mir-20a regulerer
LIMK1
uttrykk, noe som tyder på at
LIMK1
er et mål gen som kan formidle de undertrykkende effektene av MIR-20a på vekst og invasjon av skjoldbruskkjertelen kreftceller. Men en begrensning av vår studie er det lite antall ATC tumorprøver er analysert, men det er en sjelden kreft.
MiR-20a og MIR-17 (også kalt MIR-17-5p) er plassert sammen i MIR-17-92 klynge, og de har samme frø sekvens, AAAGUG. Dette frøet sekvens deles av tre andre modne menneskelige mirnas (MIR-106a, -106b, og -20b), som er plassert i kromosom 7 og kromosom X. MiR-20a mål mange gener, inkludert
VEGFA
,
TGFBR2
,
CCND1
,
IL-8
,
MAPK14
,
PCAF
,
RUNX1
,
STAT3
, og
E2F1 product: [11] – [14], [23] – [26]. Mange av disse genene spiller viktige roller i regulering av celleproliferasjon, cellesyklus, apoptose, og cellulær migrering og invasjon. MiR-20a kan fungere enten som en tumor suppressor eller et onco-Mir, avhengig av den spesifikke celletype og ekstracellulære faktorer [11] – [13]. Faktisk har MIR-20a overekspresjon blitt observert å inhibere cellulær proliferasjon, invasjon, og tumormetastaser i brystkreftcellelinjer [11], [12], som tyder på en tumor suppressor rolle for MIR-20a i samsvar med våre data i skjoldbruskcancercellelinjer og det å være oppregulert ved ATC (15, 16). Derimot har tidligere studier vist at Mir-20a kan fremme spredning i menneskelige eggstokkreft celler [27], og migrasjon og invasjon i menneskelige livmorhalskreftceller, eggstokkreft celler og osteosarkom celler [27] – [29], noe som tyder på at MIR-20a fungerer som en onko-Mir
Takakura og medarbeidere rapporterte at MIR-17-92 cluster (MIR-17-3p, -17-5p, -18a, -19a, ^ 20,. – 19b, og -92-1) ble overuttrykt i ATC cellelinjer [16]. Ved hjelp av kvantitativ RT-PCR, viste de at MIR-17-3p og MIR-17-5p ble overexpressed i tre av seks ATC vevsprøver i forhold til normale vevsprøver. De rapporterte at transfeksjon av hemmere av MIR-17-5p trykt uttrykket nivået av MIR-17 familien (MIR-17-5p, MIR-20a, og MIR-106a og b) i ARO celler, noe som resulterer i cellevekst reduksjon. Men vår studie av funksjon av MIR-20a i skjoldbruskkjertelen var annerledes enn studie utført av Takakura og kolleger. Først vi spesielt overexpressed MIR-20a å forstå dens effekt på tumorcellebiologi i både udifferensierte og differensierte skjoldbrusk kreft cellelinjer, og vi bruker ikke hemmere av flere medlemmer av MIR-17-92 klynge med mulige off target effekter, som kan ikke bare være selektiv i Mir-20a. For det andre, la vi merke til at Takakura et al. brukte celler behandlet med kun transfeksjon reagens som den negative kontroll stedet for å bruke egge oligonukleotider, og vi brukte egge oligonukleotider som den negative kontroll. I tillegg cellelinjene vi brukte (C643, TPC-en, FTC-133 og XTC-1) var annerledes enn de cellelinjer som benyttes (ARO og FRO) av Takakura og kolleger. Til slutt, ARO cellelinjer som brukes i studiet av Takakura og kollegaer kan ikke ha blitt autentisert skjoldbrusk kreft cellelinjer [18].
Vi fant at Mir-20a regulerer
LIMK1
uttrykk i skjoldbruskkjertelen cancercellelinjer.
LIMK1
er regulert av Rho signalveien, og det modulerer aktin dynamikk ved å regulere aktiviteten av cofilin familie proteiner [30], [31]. Tidligere studier har vist at
LIMK1
spiller en sentral og viktig rolle i tumorcelle invasjon og metastasering [19] – [22].
LIMK1
overekspresjon øker invasivitet av bryst og prostata kreft celler
in vitro Hotell og
in vivo
, og slå ned på
LIMK1
undertrykker bryst og prostata kreftcelle invasjon
in vitro Hotell og
in vivo product: [19] – [22], [32]. Basert på resultatene fra vår genome-wide genekspresjon og målet prediksjon analyser, spurte vi om MIR-20a overekspresjon påvirker
LIMK1
uttrykk i skjoldbrusk kreft cellelinjer. Faktisk fant vi at
LIMK1
i alle skjoldbruskkjertelkreft cellelinjer (C643, XTC-en, FTC-133, og TPC-1) ble hemmet med MIR-20a overekspresjon, noe som antyder at undertrykkende effekt av MIR ^ 20 på cellulær proliferasjon og invasjon kan være mediert av dens effekt på
LIMK1
. Faktisk direkte knockdown av
LIMK1
hadde samme effekt på cellulær invasjon og migrasjon som observert med overekspresjon av MIR-20a.
Gitt svulsten undertrykkende effekt av MIR-20a i skjoldbruskkjertelen kreftceller observerte vi
in vitro Hotell og
in vivo
, er det mulig at vellykket levering av MIR-20a kan føre til tumor undertrykkelse /regresjon uavhengig av celletype og eller basal MIR-20a nivåer [ ,,,0],33]. Tumor undertrykkende effektene av MIR-20a kan også være mediert av andre gener enn
LIMK1
. Vi validert
LIMK1
som et mål, fordi det hadde lavest uttrykk med MIR-20a overekspresjon men som er oppført i tabell 1 mange kandidat målgener ble endret med MIR-20a overekspresjon og dermed også kunne formidle sine kreft undertrykkende effekter.
Så vidt vi vet, er dette den første studien å karakterisere effekten av MIR-20a på skjoldbrusk kreft celle fenotyper og for å vise at MIR-20a regulerer
LIMK1
uttrykk. Våre funn tyder på at oppregulert uttrykk for MIR-20a i anaplastisk skjoldbruskkjertelen motvirker skjoldbruskkjertelkreft progresjon og kan ha terapeutisk potensial [34].
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Supplerende Tabell
doi:. 10,1371 /journal.pone.0096103.s001 plakater (DOC)
