Abstract
Protein kinase CK2 er ofte oppregulert i humane kreftformer, selv om virkningsmekanismen CK2 aktivering i kreft fortsatt ukjent. I denne studien undersøkte vi rollen som CK2α intronless genet (
CSNK2A1P
, en antatt CK2α pseudogen) i patogenesen av kreft hos mennesker. Vi fant bevis for forsterkning og over-uttrykk for
CSNK2A1P
genet i ikke-småcellet lungekreft og leukemi cellelinjer og 25% av lungekreft vev studert. De mRNA uttrykk nivåer korrelert med kopi tallene i
CSNK2A1P
genet. Vi identifiserte også en roman polymorfe variant (398T /C, I133T) av
CSNK2A1P
genet og viste at 398T allelet er selektivt forsterket over 398C allel i 101 ikke-småcellet lungekreft vevsprøver sammenlignet med de i 48 normale kontroller (
p
= 0,013 0,05). Vi viser for første gang CSNK2A1P protein ekspresjon i transfekterte humane embryonale nyre 293T og mus embryo fibroblast NIH-3T3-cellelinjer. Begge alleler er transformerer i disse cellelinjene, og 398T allelet synes å være mer transforme enn 398C allelet. Videre 398T allelet forringer PML tumor suppressor protein mer effektivt enn 398C allel og viser en relativt sterkere binding til PML. Knockdown av
CSNK2A1P
genuttrykk med spesifikke siRNA økte PML proteinnivået i lunge kreftceller. Vi rapporterer, for første gang, at
CSNK2A1P
genet er en funksjonell proto-onkogen i humane kreftformer og funksjonell polymorfisme ser ut til å degradere PML differensielt i kreftceller. Disse resultatene er i samsvar med en viktig rolle for 398T allel av
CSNK2A1P
i menneskelig lungekreft mottakelighet
Citation. Hung MS, Lin YC, Mao JH, Kim IJ, Xu Z, Yang CT, et al. (2010) Funksjonell Polymorphism av CK2α Intronless Gene Spiller Oncogene Roller i lungekreft. PLoS ONE 5 (7): e11418. doi: 10,1371 /journal.pone.0011418
Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 17 desember 2009; Godkjent: 05.06.2010; Publisert: 02.07.2010
Copyright: © 2010 Hung et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health (093708-01A3) og Larry Hall og Zygielbaum Memorial Trust, og Kazan, McClain, Edises, Abrams, Fernandez, Lyon og Farrise Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til død av kreft i USA [1]. Noen av de somatiske hendelser som er involvert i lungekreft har blitt godt preget, men noen av dem er fortsatt ukjent [2], [3]. Protein kinase CK2 (tidligere kjent som kasein kinase II) er en serin /treonin protein kinase som fosforylerer mer enn 300 proteiner [4]. Det forringer tumor-suppressor-proteiner, slik som PML [5] og fremmer aktiviteten og stabiliteten av onkogene proteiner som AKT [6]. For eksempel fremmer CK2 PML degradering og CK2 kinase aktivitet er inverst korrelert med PML proteinnivåer i human lungekreft [5]. Nylig ble multippelt myelom celleoverlevelse er vist å stole på den høye aktivitet av protein kinase CK2 [7]. CK2 påvirker også flere cellesignalveier, inkludert PI3K, NFkB, og Wnt trasé [8].
Nivået CK2α uttrykk er strengt regulert i normale celler [9], og økt CK2α nivået og aktiviteten har gjennomgående vært observert i en rekke humane cancere [10]. For eksempel, på høyt nivå og /eller nukleær lokalisering av CK2α er en markør for dårlig prognose for pasienter med akutt myelogen leukemi, prostatakreft og skvamøs celle lungekreft [10]. CK2α er den katalytiske subenheten til proteinkinase CK2 og CK2α har blitt rapportert å være kodet av
CSNK2A1
genet på kromosom 20p13 [11].
CSNK2A1
genet kan tjene som et onkogen og dens feilregulert uttrykk kan indusere brystsvulster og lymfomer i transgene mus [12], [13]. Selv om aktiviteten av
CSNK2A1
-genet er blitt vist å være forhøyet i humane kreftformer, er ikke fast genetisk eller epigenetisk bevis vedrørende årsaken til den høye aktivitet av CK2α i kreftceller [10]. Den CK2α intronless genet (også kjent som CK2α «pseudogen»),
CSNK2A1P
, ligger på kromosom 11p15.3 og sekvensen er svært homolog (99% identitet) til
CSNK2A1
cDNA sekvens [14]. Selv om
CSNK2A1P
genet velig uttrykt i en megakaryocytic cellelinje [15], dens rolle i kreftcellenes utvikling er fortsatt ukjent. Vi undersøkte derfor forsterkning og uttrykk for
CSNK2A1P
genet i lungekreft og leukemi cellelinjer og lungekreft vev.
Resultater
Over utfoldelse og forsterkning av
CSNK2A1P
gen i kreftceller og lungekreft vev
Vi har fokusert på
CSNK2A1P
genet fordi vi først fant det var minimal uttrykt i normale celler, men ble hovedsakelig uttrykt i flere typer av humane kreftcellelinjer og tumorcellene, inkludert den humane T-celle leukemicellelinje Jurkat, som er kjent for sin høye CK2 aktivitet. Ved semi-kvantitativ RT-PCR, viste vi at
CSNK2A1P
genet er også over-uttrykt i tre NSCLC linjer: H1299, H322, og A549, men minimalt uttrykt i normale celler og to lunge kreft cellelinjer H1650 og H460 (fig. 1A). Videre
CSNK2A1P
mRNA ble overuttrykt i lunge svulstvev fra sju av 29 (-25%) tumorprøver sammenlignet med (Fig. 1B) matchet kontrollgruppe vev. Videre FISH analyse på de samme menneskelige kreftcellelinjer gitt solid bevis på forsterkning av
CSNK2A1P
genet ligger på kromosom 11p15.3 (Fig. 1 D). For eksempel fire eksemplarer av
CSNK2A1P
genet ble funnet i human T-celle leukemi cellelinje Jurkat, og tre kopier i lungekreftcellelinjer H1299, A549, og H322. I motsetning til normale lymfocytter og H460 cellelinjen hadde diploide kopier av
CSNK2A1P
genet (Fig. 1C og D). Viktigere, mRNA uttrykk nivåer korrelert med kopiantall av
CSNK2A1P
genet i disse menneskelige kreftcellelinjer (n = 8; Pearsons γ = 0,9346;
p
= 0,0007). (Fig 1 E ). Vi videre utført semi-kvantitativ RT-PCR for å evaluere mRNA uttrykk for
CSNK2A1
gen med spesifikke primere. Overekspresjon av
CSNK2A1
genet ble også bemerket i ovennevnte kreftcellelinjer (Fig. 1F), noe som tyder på at i tillegg til
CSNK2A1
genet,
CSNK2A1P
genet også spiller viktige roller i patogenesen av lungekreft. Justering av primere som brukes for semi-kvantitativ RT-PCR av
CSNK2A1 Hotell og
CSNK2A1P gener
ble vist i utfyllende data (Fig. S1).
(A) semi-kvantitativ RT-PCR ved anvendelse av CSNK2A1P-spesifikke primere viser CSNK2A1P mRNA-ekspresjonsnivået er konsistente med kopiantall som detekteres av fisk (3 for H1299, 4 for Jurkat, 3 for H322 og A549, 2 til WI-38 og CCL-211 ). (B) Semi-kvantitativ RT-PCR bruker CSNK2A1P spesifikke primere viser CSNK2A1P mRNA er overuttrykt i syv (pasient 1 til 7) ut av 29 (-25%) lungesvulster i forhold til tilpasset normal tilstøtende vev. Pasient 8 til 14 representerer prøver uten overuttrykt CSNK2A1P mRNA. Andre 14 prøver med lignende resultater er ikke vist. (C)
CSNK2A1P
genet blir amplifisert i den humane T-celle leukemicellelinje Jurkat, og i lungecancercellelinjer H1299, A549, og H322. (D) Representative bilder av fisk studere resultatene i meta av normal lymfocytter, Jurkat, H322 og A549 cellelinjer.
CSNK2A1P
genet ble merket med Cy3 (i rødt). Kromosom 11 centimeter probe ble merket med FITC (i grønt). (E) Korrelasjon av kopiantallet og mRNA uttrykk
CSNK2A1P
genet ble beregnet ved bruk av Pearson korrelasjon. (F) Semi-kvantitativ RT-PCR ved anvendelse av CSNK2A1-spesifikke primere viser CSNK2A1 mRNA-ekspresjon nivå i normale og kreftcellelinjer som er nevnt ovenfor. Alle semi-kvantitative RT-PCR eksperimenter ble gjentatt tre ganger med samme resultat.
Allele spesifikke forsterkning av
CSNK2A1P
genet i lungekreft
For å finne ut om det er noen mutasjoner av
CSNK2A1P
i humane lungekrefttilfellene, sekvensert vi den åpne leserammen til
CSNK2A1P
genet. Selv om vi ikke finne noen mutasjoner, oppdaget vi en ny polymorfisme i kinase domene (398T /C, noe som fører til aminosyre forandring I133T, Fig. 2A) i 18 kreftcellelinjer (tabell 1) og 101 prøver primære lunge kreft vev (Tabell 2). Den spesifikke aminosyre forandring er spådd å påvirke proteinfunksjonen når sortering intolerante fra tolerant (SIFT) metoden er brukt [16]. Interessant, dette polymorfisme syntes å være jevnt fordelt i normalt vev, men i svulster, var signifikant hyppigere ved 398T allelet (Fig 2C.) (Chi-Square test, p 0,05). Videre, av de 56 heterozygote lungekreft vev undersøkt med hensyn til denne polymorfisme (fig. 2D), 20 (35,7%) prøvene viste forsterkning i dette område, og i 18 (90%) av de 20 prøver, den 398T allelet ble selektivt forsterket (fig. 2E). Dette selektiv amplifikasjon antyder at 398T allelet kan gi en vekstfordel over 398C allelet. For ytterligere å bekrefte resultatene fra DNA-sekvensering, undersøkte vi allel-spesifikk amplifikasjon av 398T allel av
CSNK2A1P plakater (som koder for Ile133-varianten) i humane tumorer ved å bruke en kvantitativ enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) analyse, dvs. TaqMan-baserte allel diskriminering analysen. Den allelisk diskriminering data er i overensstemmelse med sekvenseringsdata (fig. 2B). Av de 101 lungetumorprøver maskinskrevne, 56 var heterozygote med hensyn til 398C → T polymorfisme, og vi analyserte disse 56 prøver for allel-spesifikk amplifikasjon av 398C → T polymorfisme av
CSNK2A1P
av TaqMan®-analyse (Fig . 2B). Tjue prøvene viste allel ubalanse mellom de to alleler, 2 prøvene viste gevinst på 398C allel (koding Thr133) og 18 prøver viste gevinst på 398T allelet (koding Ile133). Disse resultatene viser statistisk signifikant allel-spesifikk forsterkning av 398T allelet (
P
0,05, Chi-Square test), som gir ytterligere bevis for rollen som dette allelet i menneskelig lungekreft. Resultatene bedt oss om å undersøke dypere inn i rollen som den varianten
CSNK2A1P
former i kreftutvikling.
(A) Allele spesifikke forsterkning av 398T allelet (TTT /C eller TT /C) er funnet i noen ikke-småcellet lungekreft vevsprøver. T ovenfor pilspissen (nucleotide 398T, I133,) på høyre er indikasjon på villtype-genet. (B) Forsterkning av
CSNK2A1P
alleler i lungesvulster ble validert av kvantitativ allel bestemt enkelt polymorfisme (SNP) analyse. Forholdet mellom 398T og 398C alleler i heterozygot lungetumorer ble bestemt ved TaqMan analyse ved anvendelse av allel-spesifikke prober, og er uttrykt som forskjeller i CT-nivåer (sykluser) med positive eller negative ΔCT verdier som indikerer forsterkning av 398T eller 398C allel, respektivt. Av 56 prøver skrevet, 2 viste forsterkning av 398C allelet større enn 0,6 CTS (prøver T3-4) og 18 viste forsterkning av 398T allelet (prøver T5-23). Trettiseks prøvene viste ingen amplifikasjon (representert ved T1-2). Normale kontroller prøvene viste ingen forsterkning (N1-3). De normaliserte middelverdier og standardavvik for tre uavhengige eksperimenter er vist. (C, D og E) Allele spesifikke forsterkning av 398T allelet øker betydelig i ikke-småcellet lungekreft vevsprøver. Normal: voksent menneske normal genomisk DNA. Tumor: no-småcellet lungekreft vev. * Angir p. 0,05 (Chi-kvadrat test)
Differensialtrans aktivitet av to
CSNK2A1P
alleler
For å teste funksjonell betydning 398T → C polymorfisme i
CSNK2A1P
genet, klonet vi
CSNK2A1 Hotell og
CSNK2A1P
gener i pcDNA 3.1 /myc-His vektor og gjennomført en serie av cellevekstmålinger ved hjelp av NIH3T3-celler. I denne undersøkelsen ble disse vektorene transient transfektert inn i 293T og NIH3T3-celler og western-analyse ble benyttet for å bekrefte ekspresjon av proteinet begge alleler av
CSNK2A1P
-genet (Fig. 3A). Resultatene viser, for første gang, at uttrykket av
CSNK2A1P
kan produsere sine proteiner.
(A)
CSNK2A1 Hotell og
CSNK2A1P
gener ble transient transfektert inn 293T og NIH3T3 celler ved hjelp Lipofectamine 2000 Reagens ifølge produksjon protokoll. 72 timer etter transfeksjon, ble cellene avling og de totale cellulære proteiner ble ekstrahert. Western blot-analyse ble benyttet for å bekrefte at proteinet uttrykket i begge alleler av
CSNK2A1P
genet. Anti-Myc tag antistoff ble brukt til å oppdage CSNK2A1P-myc tag fusjonsproteiner. (B) kolonidannelse assay. Transfeksjon av
CSNK2A1P
genet i NIH3T3-celler resulterer i forbedret forankringsavhengig vekst, sammenlignet med tom vektorkontroll. Kolonien antall NIH3T3-CSNK2A1 og NIH3T3-CSNK2A1P celler er dramatisk høyere enn for de NIH3T3-EV celler. (C) Myk agar assay. Stabil transfeksjon av
CSNK2A1P
gener i NIH3T3 celler resulterer i forbedret forankringsuavhengig vekst. Både NIH3T3-CSNK2A1 og NIH3T3-CSNK2A1P celler produseres betydelig mer kolonier enn NIH3T3-EV celler gjorde (* p 0,05, t-test). Av de to alleler av
CSNK2A1P
genet, 398T allelet dannet flere kolonier enn 398C allelet gjorde (** p 0,05, t-test). Relativ kolonidannelse i begge cellelinjer er uttrykt som prosent normalisert til tom vektor-transfektert kontrollgruppe og vist som bar ± standardavvik i tre uavhengige forsøk. (D) Kinase analyse av det uttrykte CSNK2A1 og CSNK2A1P proteiner i NIH3T3-celler. De uttrykte proteiner ble immun-utfelt med anti-myc-tag antistoff og kinase-analyse ble utført. Både NIH3T3-CSNK2A1 og NIH3T3-CSNK2A1P celler hadde betydelig høyere kinase aktiviteter enn de NIH3T3-EV celler gjorde (* p 0,05, t-test). Av de to alleler av
CSNK2A1P
genet, de 398T allel cellene hadde signifikant høyere kinase aktivitet enn 398C allelet gjorde (** p 0,05, t-test). Relativ kinase-aktivitet er uttrykt som prosentvis normalisert til tom vektor-transfektert kontrollgruppe og vist som bar ± standardavvik i tre uavhengige forsøk. EV: tom vektor. Vekt: CSNK2A1. 398C: CSNK2A1P (I133) 398T: CSNK2A1P (I133T)
I kolonidannelse analysen, transfeksjon av
CSNK2A1P
gener i NIH3T3 (NIH3T3-CSNK2A1P) celler resulterer i forbedret forankring. -avhengig vekst, sammenlignet med tom vektorkontroll (NIH3T3-EV). I tillegg genereres vi NIH3T3-celler med CSNK2A1 (NIH3T3-CSNK2A1) som en positiv kontroll. The Colony antall av NIH3T3-CSNK2A1 og NIH3T3-celler CSNK2A1P var dramatisk høyere enn for de NIH3T3-EV-celler (fig. 3B). Transfeksjon av
CSNK2A1P
genet i NIH3T3 celler også resultert i forbedret forankringsuavhengig vekst. Når myk-agar-kolonidannelse analyseresultatene ble sammenlignet, har vi funnet at stabil transfeksjon av
CSNK2A1P
gener i NIH3T3-celler resulterte i forbedret forankrings-uavhengig vekst (figur 3C). Både NIH3T3-CSNK2A1 og NIH3T3-CSNK2A1P celler produsert flere kolonier enn NIH3T3-EV celler gjorde. Sammenlignet med de NIH3T3-EV celler NIH3T3-CSNK2A1 og NIH3T3-CSNK2A1P celler produsert kolonier som var stort sett større og hadde spredt ut figurer. Når de to alleler av
CSNK2A1P
gener ble sammenlignet, fant vi at 398T allelet dannet flere kolonier enn 398C allelet gjorde. En kinase assay av de uttrykte proteiner ble også utført (figur 3D). Den 398T-genproduktet har en høyere kinase aktivitet enn 398C genproduktet gjør. Resultatene fra kinase analysen er konsistent med kolonidannelse og myk agar data.
Funksjonell polymorfisme av
CSNK2A1P
gener på nedbrytning av PML tumor suppressor protein
Å bestemme potensiell mekanisme ved hjelp av hvilken 398T allelet er fortrinnsvis forsterket i lungekreft prøver, studerte vi effektene av de to alleler av
CSNK2A1P
genet for tumor suppressor PML protein.
CSNK2A1P
gener ble stabilt transfektert inn NIH3T3 og NSCLC H1650 cellelinjer. Western blot analyse viste en redusert PML proteinnivå i cellene transfektert med
CSNK2A1P
gener. Den CSNK2A1P 398T allelet, i likhet med vill-type CSNK2A1, redusert PML proteinnivåene mer enn 398C allelet gjorde (fig. 4A). For det andre, har vi fastslått hvorvidt den halveringstiden for PML differensielt regulert av de to allelene. Disse to cellelinjer transfektert med
CSNK2A1P
genet ble behandlet med cycloheximide for 0, 2 og 6 timer, og de endogene PML protein nivåer ble undersøkt. Den 398T allelet redusert halveringstid av PML mer effektivt enn 398C allelet gjorde det (Fig. 4B). For det tredje, anvendte vi co-immunutfelling for å vise den direkte og fortrinnsvis binding mellom 398T protein og PML-proteinet (fig. 4C).
(A) PML protein avtar i NIH3T3 og H1650 stabile cellelinjer som ble transfektert av
CSNK2A1 Hotell og
CSNK2A1P
gener. Den endogene CSNK2A1 protein og overuttrykte CSNK2A1 og CSNK2A1P proteiner ble også vist. (B) Nedbrytning av PML protein er mer fremtredende i NIH3T3 stabile cellelinjer transfektert med CSNK2A1 og CSNK2A1P (I133). Hr: timer etter cycloheximide behandling. (C) 293T celler ble ko-transfektert med PML-V5 og Myc-merkede CSNK2A1 eller CSNK2A1P konstruksjoner. CSNK2A1 og CSNK2A1P (I133) viser sterkere binding til PML protein i gjensidige immunoutfellingsstudier analyser. EV: tom vektor. Vekt: CSNK2A1. 398T: CSNK2A1P (I133) 398C: CSNK2A1P (I133T). (D) uttrykk for
CSNK2A1P
genet avtar i H1299 lungekreft cellelinje etter transfeksjon med
CSNK2A1P
genet bestemt siRNA. Ingen reduksjon i uttrykket av
CSNK2A1 Hotell og
CSNK2B
gener ble notert. (E) De CK2α protein nivået synker og PML protein nivå øker i H1299 lungekreft cellelinje etter transfeksjon med
CSNK2A1P
genet bestemt siRNA. N: negativ kontroll siRNA. CSNK2A1P:
CSNK2A1P
siRNA. Bånd tettheter er normalisert til den negative siRNA transfektert gruppe ved hjelp av aktin som en intern kontroll. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger med samme resultat.
For ytterligere å ta opp spørsmålet om CSNK2A1P mRNA er fullt oversatt og forringer PML i kreftceller, vi slått ned
CSNK2A1P
genet i H1299 lunge kreft cellelinjer med siRNA spesifikke til
CSNK2A1P
genet. Vi valgte kreftcellelinje H1299 lunge fordi vår studie (figur 1A og C) viste at
CSNK2A1P
genet er forsterket og overuttrykt i denne cellelinjen.
CSNK2A1P
genet spesifikke siRNA førte til en større enn 70% reduksjon i uttrykket av
CSNK2A1P
genet og ingen reduksjon i uttrykket av
CSNK2A1 Hotell og
CSNK2B
gener (fig. 4D). I samsvar med redusert uttrykk for
CSNK2A1P
genet, redusert det totale CK2α protein og PML protein økte i cellene behandlet med
CSNK2A1P
sirnas forhold til negative siRNA transfekterte kontroller (fig. 4E) .
Diskusjoner
i denne studien har vi gitt til vår kunnskap, den første bevis for å vise at
CSNK2A1P
genet er en funksjonell proto-onkogen i humane kreftformer . For å støtte vår hypotese at
CSNK2A1P
genet er en funksjonell proto-onkogen, snarere enn en «pseudogen», vi har gjort omfattende DNA, mRNA, protein og siRNA analyse. Resultatene av denne analyse gir det første bevis for at mRNA-ekspresjon nivået korrelerer med kopiantallet av den
CSNK2A1P
-genet i flere humane kreftcellelinjer. Videre siRNA slå ned på
CSNK2A1P
gen redusert total CK2α protein nivå i kreftceller, noe som indikerer at
CSNK2A1P
genet er fullstendig oversatt i kreftceller. Dermed kan forsterkning av
CSNK2A1P
genet spiller en onkogen rolle i disse menneskelige kreftcellelinjer. På grunnlag av våre resultater foreslår at to funksjonelle gener kan eksistere i den menneskelige CK2α familien,
CSNK2A1
, som finner på kromosomet 20p13, og
CSNK2A1P
, som finner på kromosomet 11p15.3.
Vi har også funnet en ny polymorfisme i kinasedomenet (398T /C, noe som fører til aminosyre forandring I133T, figur 2a) i 101 primære svulster. Denne polymorfisme ser ut til å være jevnt fordelt i normalt vev, men i tumorer, er betydelig mer hyppig i 398T-allelet (tabell 2, figur 2). Den 398T allelet ble selektivt forsterket i atten av de 101 lungekreft vev, noe som tyder på det kan gi en vekstfordel over 398C allelet. Den 398C allelet forsterkning ble bare funnet i to av de 101 lungekreft vev, noe som tyder på at det kan være en tilfeldig hendelse. Disse spennende genetiske resultatene bedt oss om å undersøke dypere inn i rollen som den varianten
CSNK2A1P
former i tumorutvikling. Gjør du det gitt to viktige funn, først, at 398T allelet er mer transformerende enn 398C allelet, og andre, at 398T allelet forringer tumor suppressor PML protein mer effektivt enn 398C allelet. For eksempel, 398T allel viste signifikant høyere transformerende aktivitet i både kolonidannelse og myk-agar-assays enn 398C allelet (fig. 3B og C). Dataene i kinase-analyse viste at 398T genproduktet har høyere kinase aktivitet enn 398C genproduktet (fig. 3D), noe som tyder på at den 398T allelet er en mer trans allel enn 398C allelet. I tillegg er disse data tyder også på at den transformerende evne til 398T allel av
CSNK2A1P
pseudogen er lik som den normale
CSNK2A1
genprodukt, slik at de mer aktive allel av pseudogen ser ut til å ha aktivitet sammenlignes med den vanlige
CSNK2A1
genet. Til dags dato er det ingen genetisk eller epigenetisk bevis på aktivering av CSNK2A1 genet i menneskelig kreft. Dermed vår studie gir det første bevis på at
CSNK2A1P
398T allelet, som er lik den
CSNK2A1
genet, forsterkes i humane lungekreft vev.
PML-genet ble opprinnelig identifisert ved stoppunkt av t (15; 17) translokasjon i akutt promyelocytisk leukemi [17], og ble vist seg å være et tumorsuppressorgen [18]. Tap av PML er korrelert med dårlig klinisk resultat i en rekke humane kreftformer, inkludert lungekreft, som støtter dens tumor suppressor funksjon [5], [19]. PML fremmer defosforylering av pRb og regulerer celle skjebne i utviklings neocortex [20]. CK2 regulerer ubiquitin-formidlet nedbrytning av PML i humane lungekreft-cellelinjer [5], [21]. Dette kan være en av de mulige mekanismer som 398T allelet er fortrinnsvis forsterket i lungekreft prøver. Dette genetisk polymorfisme er sannsynligvis en nyttig markør for å påvise amplifisering av CK2 intronless genet, fordi monoallelic forsterkning er antatt å være ansvarlig for genamplifisering ved kreft [22]. Dette allel-spesifikk forsterkning innebærer også at kreftceller kan bli avhengige av onkogene CK2α [23]. Kort sagt, den forsterkning av 398T allel av
CSNK2A1P
genet kan bidra, i hvert fall delvis, til patogenesen av lungekreft.
CSNK2A1P
genet er en bearbeidet pseudogen som ligger på kromosomet 11p15.3 og er ment å bli dannet ved retrotransposition, og kjennetegnet ved fravær av introner, tilstedeværelsen av flankerende retning og gjentar seg, og den 3 «polyadenylerings-halen [15]. Imidlertid har det en sterk promoter oppstrøms fra initierings- kodonet (14, 15). Uttrykk for
CSNK2A1P
genet er potensielt mer tett regulert enn
CSNK2A1
er. For eksempel, promoterregionen av
CSNK2A1P
genet inneholder to TATA bokser og en CAAT-boksen, mens den oppstrøms sekvens av
CSNK2A1
viser husholdningsgenet egenskaper, f.eks høyt GC-innhold, nærvær av flere GC bokser og mangel TATA-boksen (14, 15). Dessuten flere viktige transkripsjonsfaktorbindingsseter (f.eks CEBP-, GATA-, og Smad-bindingsseter) ble spådd i 5 «regionen (1 Kb) fra
CSNK2A1P
starter kodon, noe som tyder på at
CSNK2A1P
genet kan potensielt bli indusert eller undertrykt av flere mester regulatorer av utviklingsveier. Forsterkningen av
CSNK2A1P
genet kan føre til overekspresjon av CSNK2A1P protein i kreftceller. Det kan også være mulig at
CSNK2A1
genet er liksom indirekte regulert av uttrykk for
CSNK2A1P
genet. Fremtidige studier er nødvendig for å avdekke mekanismen gjennom som
CSNK2A1P Hotell og
CSNK2A1
genene er regulert. Inntil nå har rundt 10.000 behandlede pseudogener [24] blitt karakterisert i det humane genomet, og noen av disse genene har blitt rapportert å bli uttrykt i cancerceller. For eksempel, onkogene
CRIPTO3
pseudogen er uttrykt i tykktarm, bryst og lunge kreft [25], den menneskelige homolog av vacciniavirus H1 fosfotasesubstrat genet klone 5 (
HVH-5
) pseudogen er uttrykt i brystkreftcellelinjer [26], og
Rac1
pseudogen er uttrykt i hjernesvulster [27]. Tatt sammen med våre resultater, tyder dette på en potensiell onkogen rolle antatte pseudo i enkelte menneske kreft.
Denne studien hadde noen begrensninger. Vi demonstrerte korrelasjonen mellom
CSNK2A1P
gen og PML proteinstabilitet i bare to lungecancercellelinjer in vitro. Prøver fra bare 101 lungekreftpasienter ble analysert, 56 som var heterozygote når det gjelder denne polymorfi og kan brukes for analysen. I fremtidige studier, vil det være viktig å inkludere flere kreftcellelinjer og flere kreftvevet.
Våre resultater gir genetiske bevis for aktivering av intronless CK2α genet i menneskelig kreft. Selv CK2 var tidligere kjent for å være en sentral aktør i kreft, ble virkningsmekanismen aktivering i kreft ikke kjent [10], [28]. På grunn av denne mangelen på kunnskap om mekanismen for CK2 aktivering og dens konstituerende aktivitet, har CK2 vært mest neglisjert som et viktig mål for anti-kreft narkotika. Siden betydelig fremgang har blitt gjort på de strukturelle grunnlaget for CK2 hemming, er det nå mulig å utvikle potente og selektive celle-gjennomtrengelig CK2 hemmere [29], [30]. Forstå forskjellen i sekvenser av de
CSNK2A1P
gen polymorfismer kan tillate oss å utforme spesifikke diagnostiske tester for kreft hos mennesker. Viktigere, våre resultater støtter tanken om at protein kinase CK2α er en tiltalende mål for kreftbehandling som små-molekyl-hemmere [10], [31].
Materialer og metoder
Cellelinjer
Den menneskelige kreft (Jakurt, H1299, A549, A427, H441, H1703, H322, H460, HCT116, H1975, H322, H358, H838, H28, H2052, Hela og H1650) og normal lunge (WI-38 og CCL-211) cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture samlinger (Manassas, VA). H290 og MS-1-cellelinjer ble erholdt fra NIH (Frederick, MD). Cellene ble dyrket i komplett vekstmedium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium for HeLa, A549 og CCL-211, Eagle er Minimum Essential Medium for WI-38; Roswell Park Memorial Institute medium for H1299, A549, A427, H441, H1703, H322, H460, HCT116, H1975, H322, H358, H838, H28, H2052 og H1650) supplert med 10% føtalt bovint serum, 10 enheter /ml penicillin og 10 ug /ml streptomycin ved 37 ° C og 5% CO2.
vevsprøver
Ferske tumorvev og tilstøtende normalt vev ble oppnådd fra pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSLC) som var under kirurgisk reseksjon av primærtumor. Studien ble godkjent av University of California, San Francisco, Institutional Review Board (CHR # H8714-11647-14). Vi innhentet skriftlig informert samtykke fra alle deltakerne i vår undersøkelse. Vevsprøver ble holdt ved -180 ° C flytende nitrogen frysere før bruk, og endelig patologisk diagnose ble bekreftet av en patolog ved University of California, San Francisco (UCSF), USA. Normal voksen genomisk DNA skjema perifert blod ble kjøpt fra BioChain (Hayward, California).
Fluorescens-in situ hybridisering
fluorescens-in situ hybridisering (FISH) probe for CSNK2A1P (RP11-567I13 , kromosom 11p15.3) ble kjøpt fra BacPac Resources (Oakland, California). Den kromosom 11 cent var merket av Vysis CEP 11 SpectrumGreen ™ probe (Abbott Molecular, Abbott Park, IL). Metafase lysbilder ble utarbeidet ved hjelp av standard protokoller fra UCSF Molecular Pathology Core-anlegget. Alle hybridizations ble gjort av UCSF Molecular Pathology Core-anlegget. Den CSNK2A1P BAC probe ble merket med Cy3 red av nick oversettelse. Probe blanding ble fremstilt i henhold til standardprotokollen
DNA og cDNA sekvensanalyse
Genomisk DNA eller total-RNA ble isolert fra cellelinjer og vevsprøver ved hjelp av DNeasy Blood Tissue Kit eller RNeasy Mini Kit (Qiagen Valencia, CA), henholdsvis. Den CSNK2A1P-genet ble PCR-amplifisert ved å bruke dets genspesifikke primere. Forover- og revers primere som brukes for PCR og sekvensering var: 5′-AGAAAATTGCTCCCCACTCC-3 «og 5′-GTGCTGCCAGAGAATGA CAA-3» hhv. PCR-produktene ble gel-renset ved hjelp av QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen Valencia, CA) og ble deretter sekvensert ved MCLab (South San Francisco, California).
Semi-kvantitativ revers transkripsjon-PCR (RT-PCR ) analyse
Total RNA fra cellelinjer og vev ble isolert ved anvendelse av en ekstraksjon kit, og DNA ble fjernet ved på-kolonne behandling med DNase (RNeasy Mini kit, Qiagen, Valencia, CA, USA). Semikvantitativ RT-PCR ble utført ved hjelp av Superscript Ett-trinns RT-PCR med platina Taq-sett (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge produsentens protokoll. Ett-trinns RT-PCR ble utført ved hjelp av par av CSNK2A1P-spesifikke primere (Forward: 5′-AGAAAATTGCTCC CCACTCC-3 «og omvendt: 5′-GTGCTGCCAGAGA ATGACAA-3′), CSNK2A1-spesifikke primere (Forward: 5»-TGGGGACAGAAGATTTATATGA -3 «og bakover: 5′-CTGAAGAAATCCCTGACA TCAT-3′) og CSNK2B-spesifikke primere (Forward: 5»-CAGGTCCCTCACTACCGACA -3 «og bakover: 5′-CAGCTGGTAGGCCATCGGAT-3»). PCR-produktene ble bekreftet ved direkte DNA-sekvensering. Glyseraldehyd-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) ble anvendt som en intern kontroll.
