Abstract
Skriv en iodothyronine deiodinase (DIØ1) katalyserer omdannelsen av prohormone tyroksin til aktiv thyroid hormon 3,3 «, 5-trijodtyronin (T3), viktig regulator av celledeling og differensiering. DIØ1 uttrykk er redusert i den vanligste typen av nyre neoplasi, klarcellet nyrecellekarsinom (ccRCC). MicroRNAs er små, ikke-kodende RNA som regulerer genekspresjon på posttranskripsjonelt nivåer. Målet med denne studien var å analysere potensialet regulering av DIØ1 uttrykk ved microRNAs i ccRCC. Bioinformatiske analyse viste at 3’UTR av menneske
DIØ1
genet transkripsjon inneholder MIR-224 og MIR-383 målse, som er konservert over pattedyrarter. Semi-kvantitativ real-time PCR ble brukt for å analysere ekspresjon av MIR-224 og MIR-383 i 32 prøver av ccRCC tumorer (T) og i 32 matchet kontroll (C) prøver. Vi observerte statistisk signifikant (p = 0,0002) mer enn fire ganger økning i Mir-224 uttrykk og nesten to ganger økning i Mir-383 uttrykk i prøvene T sammenlignet med prøvene C. Tumor konkrete endringer i uttrykket av MIR-224 negativt korrelert med endringer i DIØ1 uttrykk og intracellulær T3 konsentrasjon. Transfeksjon av HeLa cellelinje med MIR-224 og MIR-383 trykkes aktiviteten til en luciferase reporter inneholder 3’UTR av
DIØ1
. Dette ble avskaffet da konstruerer muterte på MIR-224 og MIR-383 målse ble brukt i stedet, noe som indikerer at MIR-224 og MIR-383 direkte bindes til
DIØ1
3’UTR. Endelig indusert ekspresjon av MIR-224 i Caki-2 celler resulterte i signifikant (p 0,01) reduksjon av
DIØ1
mRNA. Denne studien gir en roman miRNA-mediert reguleringsmekanisme for
DIØ1
uttrykk i ccRCC
Citation. Boguslawska J, Wojcicka A, Piekielko-Witkowska A, Master A, Nauman A (2011) MiR -224 Targets den 3’UTR av type 1 5′-iodothyronine deiodinase Muligens Bidra til Tissue Hypotyreose i nyre kreft. PLoS ONE 6 (9): e24541. doi: 10,1371 /journal.pone.0024541
Redaktør: Marian Ludgate, Cardiff University, Storbritannia
mottatt: 12. mai 2011; Godkjent: 12 august 2011; Publisert: 02.09.2011
Copyright: © 2011 Boguslawska et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av den polske staten komité for Scientific Stipend (NN 401 071 939, NN 401 0386 37), og Medisinsk senter for etterutdanning Grant (501-2-1-24-06 /08) (til AN). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Thyreoideahormoner: 3,5,3′-L-triiodothyronine (T3) og tyroksin (T4), spiller viktige roller i vekst, utvikling, differensiering og regulering av metabolske veier i cellene. Menneskelig type 1 iodothyronine deiodinase (DIØ1), produkt av
DIØ1
genet katalyserer to typer dejodisering reaksjon, en ytre ring (5′-dejodisering – 5’D) og en indre ring (5-dejodisering – 5D). Disse prosessene resulterer i henholdsvis aktiveringen og inaktivering av skjoldbruskkjertelhormoner (1). DIØ1 er en selenoenzyme uttrykt hovedsakelig i lever, nyre, skjoldbruskkjertelen, og hypofysen. Tidligere rapporter har vist at ekspresjon av dette enzym er forstyrret i ulike typer av kreft. For eksempel
DIØ1
mRNA og aktivitet er redusert i papillær thyroideakarsinom (2-5) og økt i follikulær adenom og follikulær skjoldbruskkjertelen karsinom (2). I tidligere arbeider viste vi redusert uttrykk for
DIØ1
mRNA og aktivitet (6), og forstyrret alternativ spleising av
DIØ1
pre-mRNA i klarcellet nyrecellekarsinom (ccRCC) (7).
DIØ1
ekspresjon er også blitt foreslått som en differensieringsmarkør for kreftceller (8, 9).
ccRCC representerer den mest vanlige nyrekreft histologi, som representerer 75% av primær ondartede sykdommer i nyrene ( 10, 11). Den brukte behandling er kirurgisk fjerning mens kjemo- og stråleterapi være ineffektiv. Ingen av flere foreslåtte molekylære markører er godkjent for klinisk bruk (10).
microRNAs (mirnas) er små, ikke-kodende RNA som styrer genene uttrykk ved helt eller delvis komplementært binding til 3′-uoversatt region av mål-mRNA (12, 13) som forårsaker nedbrytning av mRNA eller, mer vanlig, blokkerer oversettelse (14-16). Tidligere studier har vist at mirnas spiller viktige roller i viktige prosesser, slik som differensiering, proliferasjon og apoptose (17, 18). Tiden nye resultater viste at mirnas er involvert i kreft patogenesen. Hyppige endringer av miRNA ekspresjon har blitt funnet i en rekke humane ondartede sykdommer slik som skjoldbruskkjertelen (19), lunge (20), bukspyttkjertel (21), tykktarm (22), bryst (23), lever (24), prostata (25) eller andre faste tumorer (26, 27). Ulike studier har identifisert paneler av microRNAs som er forskjellig uttrykt mellom normal nyre vev og tumor eller mellom histologiske subtyper av nyretumor (28-33). MikroRNA uttrykk profilering har vist ulike kliniske applikasjoner for diagnose, prognose og prediktiv formål (34, 35). Flere mirnas funksjon som onkogener eller tumor-suppressorer og flere gener som koder for mirnas befinner seg i genomiske regioner som er involvert i kreftformer (36).
Vårt tidligere resultater (6) har vist at DIØ1 aktivitet dårlig korrelert med dets mRNA nivå hos friske nyre vev. Denne observasjonen antyder betydelig posttranskripsjonelt regulering av
DIØ1
uttrykk som kan formidles av miRNAs. Derfor er målet med dette arbeidet var å undersøke potensialet
DIØ1
regulering av mirnas og for å avgjøre om deregulering av DIØ1 i ccRCC kan skyldes endrede handlinger mirnas.
Resultater
Computational prediksjon av miRNAs binding til
DIØ1
3’UTR
for å identifisere de antatte miRNA målretting av 3’UTR av
DIØ1
mRNA, brukte vi beregningsprogrammer, TargetScan, PicTar, miRBase og Miranda. Den 1087 nukleotider av 3’UTR av
DIØ1
ble screenet for komplementaritet til frø sekvenser av kjente miRNAs. Bare den mirnas identifiseres ved minst to av fire uavhengige bioinformatikkdataene tilnærminger ble vurdert for videre analyse. Vi identifiserte 7 potensielle mirnas rettet mot 3’UTR av menneskelig
DIØ1 plakater (tabell 1): MIR-224, MIR-383, MIR-610, MIR-659, MIR-637, MIR-1202 og speil 1266.
MIR-224 og MIR-383 er overexpressed i ccRCC
i forstudier, ved hjelp av semi kvantitativ real-time PCR (SQ-PCR), fant vi ut den relative uttrykk av 7 kandidat miRNAs i ccRCC og sammenkoblede kamp kontrollprøver fra 32 pasienter som bruker universal primer UniAmpHindIII (37) med sekvenshomologi overheng av primere som brukes i revers transkripsjon og miRNA-spesifikke primere (sekvenser er vist i supplerende data, i tabell S2). Vi observerte ulike uttrykk for MIR-224 og MIR-383, mens uttrykk for de fem andre kandidat mirnas: Mir-610, MIR-637, MIR-659, hadde MIR-1202 og MIR-1266 ikke signifikant forskjellig mellom ccRCC og kontroll vev (Figur S1, Company data).
Induced uttrykk for MIR-224 og MIR-383 i ccRCC ble bekreftet i en bestemt TaqMan mikroRNA analysen. Disse studiene viste statistisk signifikant (p = 0,0002) i løpet av fire gangers økning i ekspresjon av MIR-224 og nesten to ganger økning (p = 0,0236) i uttrykket av MIR-383, i prøver T sammenlignet med kontrollprøver C (Figur 1 ). Mean ganger endring av MIR-224 og MIR-383 ble analysert i ulike kreft graderinger, men ikke avhengig av differensiering karakteren av tumorprøve. Men mener ganger endring av MIR-224 hadde en tendens til å avta når differensierings karakterer økt fra G1 til G3 (figur 1).
A. Økt MIR-224-ekspresjon i ccRCC tumorprøvene (T) sammenlignet med kontrollprøver (C). Uttrykket er vist som prosent av kontroll C. B. Mean kaste T: C endring av uttrykk for MIR-224 224 i prøver fordelt i henhold til tumor differensiering karakterer (G1, G2, G3). C. Økt MIR-383-ekspresjon i ccRCC tumorprøvene (T) sammenlignet med kontrollprøvene (C). Uttrykket er vist som prosent av kontroll C. D. Mean kaste T: C endring av uttrykk for MIR-383 224 i prøver inndelt etter tumor differensiering karakterer (G1, G2, G3). Data er gitt som middelverdi ± SEM n = 32 for T, n = 32 til C (i A og C), n = 11 for G1, n = 11 for G2, n = 10 for G3 (i B og D). Statistisk analyse ble utført ved bruk sammen
t
-test for å sammenligne C og T-prøver (i A og C) eller ANOVA å sammenligne G1, G2 og G3 prøver (i B og D) * p 0,05, * ** p .. 0.001
Dermed ble forstyrret uttrykk for MIR-224 og MIR-383 i ccRCC bekreftet av to forskjellige analytiske tilnærminger
MIR-224 korrelerer negativt med DIØ1 og T3 nivå i ccRCC
SQ-PCR-analyse viste 2,7 ganger nedregulering av
DIØ1
mRNA i 32 paret tumor og kontroll vevsprøver (p = 0,0009), noe som er i tråd med våre tidligere rapporter ( 6) (figur 2). Som vist i figur 2, ble det observert en statistisk signifikant negativ korrelasjon mellom MIR-224 og
DIØ1
mRNA-tumor-spesifikke forandringer i ekspresjonen (Spearman r
r = -0,556 ved p = 0,001). I kontrast, ble ingen korrelasjon observert for MIR-383 og
DIØ1
. Videre Western-blot analyse utført på elleve parede prøver av ccRCC og normalt nyrevev avdekket tap av DIØ1 protein (figur 2B).
A. Uttrykk for
DIØ1
mRNA i vevsprøver. n = 32 for T og n = 32 for C. Uttrykket er vist som prosent av kontroll C. Plottet viser medianverdier med 95% KI som data ikke var normalfordelt. Statistisk analyse ble utført ved bruk av Wilcoxon parret test for å sammenligne C og T prøver. *** P 0,001. B. Western-blot av DIØ1 utført på par-matchet kontrollgruppe-ccRCC prøver. p-aktin-ekspresjon ble anvendt som en intern kontroll. Fire representative kontroll (C) og tumor (T) prøver er vist. C og D. Spredningsplott av T: C prosenter av
DIØ1
mRNA
versus
T: C MIR-224 (C) og T: C MIR-383 (D) uttrykk forholdstall. Ikke-parametrisk Spearmans rank korrelasjonsanalyse ble utført på data fra 32 par av kontroll- og tumor vevsprøver. p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. E og F. Scatter plott av T3 konsentrasjon T: C ratio kontra T: C MIR-224 (E) og Mir-383 (F) uttrykk forholdstall. Pearson korrelasjonsanalyse ble utført på data fra 11 par av kontroll- og tumor vevsprøver. p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
DIØ1 er en regulator av skjoldbruskkjertel hormon biotilgjengelighet.. I vår siste undersøkelse fant vi at T3 konsentrasjonen ble redusert i ccRCC svulster sammenlignet med par matchet kontroller. For å sjekke om MIR-224-mediert nedregulering av DIØ1 påvirker DIØ1 aktivitet produkt, T3, analyserte vi sammenhengen mellom kreftspesifikke endringer av MIR-224 og T3 nivå. T3 nivå ble analysert i 11 pair-matchet ccRCC og kontrollprøver som ble brukt for DIØ1 Western-blot analyse. T3-konsentrasjon ble bestemt som beskrevet tidligere (37). Vi fant en statistisk signifikant (Pearson r = -0,624, p = 0,04) negativ korrelasjon mellom T: C forholdstall på MIR-224 og intratumoral T3 (figur 2).. MIR-383 endringer gjorde heller ikke korrelerer med T3.
Senket intratumorale T3 konsentrasjoner kan føre til ikke bare fra redusert uttrykk for DIØ1 men også fra økt aktivitet av type 3 deiodinase (DIØ3) som er en skjoldbrusk hormon inaktivere enzymet. Ved hjelp av Q-PCR, analyserte vi uttrykk for DIØ3 mRNA i 11 pair-matchet ccRCC og kontrollprøver. DIØ3 mRNA var umulig å oppdage i alle de analyserte prøvene (resultater ikke vist). Dermed fikk vi bekreftet at redusert intratumorale T3 nivå skyldes senket DIØ1 uttrykk.
Transfeksjon med MIR-224 reduserer uttrykk for endogen
DIØ1
For å bestemme den funksjonelle effekten av MIR -224 og MIR-383 på endogen
DIØ1
mRNA, Caki-2-celler ble transfektert med pre-MIR-224, pre-MIR-383 (mikroRNA forløpere), anti-MIR-224, anti-speil 383 (mikroRNA-hemmere), eller egge kontroll. Vellykket transfeksjon ble bekreftet i SQ PCR-analyse av et stort induksjon av MIR-224 og MIR-383 etter transfeksjon med mikroRNA forløpere og betydelig reduksjon av mirnas uttrykk når inhibitorer ble anvendt (figur 3).
A. Uttrykk for
DIØ1
mRNA i Caki-2 cellelinje. Cellene ble transfektert med 37,5 pmol av pre-Mirs, anti-Mirs eller egge pre-MIR (negativ kontroll); etter 48 timers total-RNA ble ekstrahert for påfølgende SQ-PCR-analyse av
DIØ1
nivå. Uttrykket er vist som prosent av kontroll (celler transfektert med egge mikroRNA). Data er gitt som middelverdi ± SEM. Data ble analysert ved hjelp av ANOVA etterfulgt av Dunnetfs multiple sammenligningstest. ** P 0,01. B og C. Graden av MIR-224 (B) og MIR-383 (C) i celler transfektert med pre-Mirs eller anti-Mirs. Data er presentert som prosent av kontroll (celler transfektert med egge mikroRNA). Data er gitt som middelverdi ± SEM Verdier for mirnas ble normalisert til U6 genet. Data ble analysert ved hjelp av ANOVA etterfulgt av Dunnetfs multiple sammenligningstest. *** P. 0,001
mRNA nivåer av
DIØ1
ble målt ved SQ-PCR og en betydelig reduksjon (56%, p 0,01) av
DIØ1
karakternivået ble observert etter innføringen av pre-MIR-224. pre-MIR-383 ikke har denne effekten (figur 3). Transfeksjon av Caki-2-celler med anti-MIR-224 resulterte i økning av
DIØ1
uttrykk, med 45%, p 0,01, sammenlignet med egge kontroll. Vi observerte ikke dette overuttrykk når cellene ble transfektert med anti-MIR-383 (figur 3).
Disse dataene viser at endogen
DIØ1
mRNA uttrykk i Caki-2 celler moduleres av MIR -224.
Den 3’UTR av
DIØ1
er et direkte mål for MIR-224 og MIR-383
Computational analyse av
DIØ1
3 «UTR med TargetScan5.1 avdekket to mulige bindingssteder for MIR-224 og MIR-383, som ligger på nukleotider 1788-1794 og 898-904 av
DIØ1
transkripsjon (NM_00792.5), henholdsvis (figur S2 i Supplemental data). Disse to områdene ble konservert over pattedyrarter. For å studere direkte interaksjon mellom MIR-224, MIR-383 og
DIØ1
transkripsjon vi klonet 3’UTR av
DIØ1
nedstrøms luciferasereportergenet i pGL3-kontroll vektor – (DIO1-3’UTR). Kontroll-plasmid, der DIØ1 3 «UTR ble innsatt i en motsatt retning (DIØ1-rev3’UTR) ble også konstruert. Parallelt har vi opprettet to ekstra reporter konstruerer der de konserverte rettet mot regioner ble spesielt mutert, å avskaffe binding av miRNAs (figur 4). HeLa cellelinje, viser lav endogen uttrykk for
DIØ1
ble brukt for transfeksjon eksperimenter. Cellene ble transfektert med innhentet konstruksjoner og forløpere for microRNAs: pre-MIR-224, pre-MIR-383 eller kontroll (kryptert miRNA). I HeLa celler transient transfektert med
DIØ1
-3’UTR konstruere og miRNA forløpere, ble det observert en signifikant hemming av luciferase aktivitet. Både MIR-224 og MIR-383 forårsaket nedgang i luciferase-aktivitet med ca. 45% og 25%, respektivt, sammenlignet med kontrollen egge miRNA. Begge pre-mirnas unnlatt å utøve en betydelig effekt på
DIØ1
-rev3’UTR og den tomme pGL3-Control vektor (figur 4).
A.
DIØ1
3’UTR klonet nedstrøms luciferase i pGL3-Control vektor. Villtype og mutert 3’UTR av
DIØ1
med frø regionen (fet skrift) og base erstatninger (stor skrift og understreket) avskaffe binding av en bestemt miRNA (verifisert
i silico
) nedenfor presenteres. To typer 3’UTR mutanter ble konstruert:
DIØ1
-3’UTR224mut og
DIØ1
-3’UTR383mut. B. Dual luciferase assay. Den relative luciferase aktivitet av konstruksjoner med 3’UTR av
DIØ1
:
DIØ1
-3’UTR,
DIØ1
-rev3’UTR,
DIØ1
-3’UTR224mut,
DIØ1
-3’UTR383mut og pGL3-Control i nærvær av pre-miRNA eller egge pre-miRNA (negativ kontroll). Data er uttrykt som middelverdier ± SEM og er vist som prosent av kontroll (celler transfektert med egge mikroRNA). Hver søyle representerer verdier fra tre uavhengige eksperimenter, målt i tre paralleller. Den relative aktivitet av ildflueluciferase ekspresjon ble normalisert til Renilla luciferase-aktivitet. Data ble analysert ved hjelp av ANOVA etterfulgt av Dunnetfs multiple sammenligningstest. . ** P 0,01
Luciferaseaktiviteten av reporteren konstruerer:
DIØ1
-3’UTR224mut og
DIØ1
-3’UTR383mut, der målet sider anerkjent av mikroRNA ble mutert, var upåvirket av transfeksjon med pre-MIR-224 eller pre-MIR-383, henholdsvis (figur 4). Denne observasjonen bekreftet spesifisitet for handling av både microRNAs som mutasjon i erkjennelsen området skal hindre miRNA binding til 3’UTR. Hva er mer viktig, mutasjon i erkjennelsen åsted for en mikroRNA påvirket ikke binding av andre analysert miRNA. Luciferase aktivitet i celler transfektert med
DIØ1
-3’UTR383mut ble hemmet med 40% etter pre-MIR-224 tillegg, mens transfeksjon med
DIØ1
-3’UTR224mut og pre-speil 383 resulterte i ~23% reduksjon i luciferase aktivitet (figur 4).
samlet utgjør disse dataene viser at 3’UTR av
DIØ1
inneholder spesifikke bindingsseter for microRNAs MIR-224 og MIR-383.
Diskusjoner
i denne studien har vi vist for første gang at type 1 iodothyronine deiodinase transkripsjon er en direkte funksjonell mål for mikroRNA MIR-224. Binding av MIR-224 til
DIØ1
3’UTR resulterer i nedregulering av endogen
DIØ1
uttrykk i nyrekreftceller. Videre
DIØ1
3’UTR inneholder spesifikke konservert bindingsseter for MIR-224 og MIR-383, som viste i luciferaserapportørplasmid analyser. Begge microRNAs er markert overexpressed i klarcellet nyrekreft og muligens står for tap av
DIØ1
uttrykk i tumor. Dette har vært støttet av den negative korrelasjonen mellom tumor-spesifikke endringer i MIR-224 og
DIØ1
mRNA nivåer og tap av DIØ1 protein i ccRCC prøver. Videre tumor-spesifikke forandringer i konsentrasjonen av produktet fra DIØ1 aktivitet, T3, korrelerer negativt med forandringer av MIR-224 uttrykk. Disse resultatene gir et sterkt bevis for en ny mekanisme for
DIØ1
regulering.
De mekanismene som regulerer
DIØ1
uttrykk er dårlig forstått. I våre tidligere studier observerte vi manglende samsvar mellom DIØ1 protein og mRNA nivå i ccRCC (6) som foreslo mulig involvering av posttranskripsjonelt mekanismer, som mikroRNA avhengig regulering. I denne studien ble det observert nesten tre ganger reduksjon av
DIØ1
mRNA uttrykk mens DIØ1 protein gikk tapt i tumorprøver. En interessant observasjon gjort i denne studien er at uttrykket av MIR-224 har en tendens til å forandre seg med tumor differensiering karakterer og er høyest i G1 og lavest i G3 (fig. 2). Selv om disse endringene mellom de respektive tumor differensiering karakterer er ikke statistisk signifikant kan de muligens tyder på at så svulst fremgang virkningen av MIR-224 på
DIØ1
uttrykk senker og kanskje andre posttranskripsjonelt mekanismer er involvert. Som vi tidligere har vist, en annen mekanisme som bidrar til svekket DIØ1 uttrykk i ccRCC er dens forstyrret alternativ spleising resulterer muligens fra endringer i uttrykket av spleise faktorer (7, 38). I forsøkene utført i Caki-2 celler, gjorde MIR-383 ikke påvirker uttrykket av endogen DIØ1. Dette kan tyde på at Mir-383 virker på en posttranskripsjonelt nivå, forårsaker oversettelse blokkering fremfor nedbrytning av
DIØ1
mRNA. Den andre muligheten er at andre faktorer (inkludert MIR-224) kan utøve sterkere effekt på DIØ1 uttrykk i ccRCC. Denne ideen er støttet av resultatene fra luciferease eksperimenter hvor induserte MIR-383 uttrykk resulterte i bare 25% reduksjon av luciferase-aktivitet i sammenligning med virkningen av MIR-224 som forårsaket 45% nedregulering av ekspresjon. Luciferasepreparater eksperimenter bekrefter hypotesen om at bindingen av MIR-383 til
DIØ1
3’UTR resultater i oversettelse blokkering, som luciferase aktivitet er en direkte konsekvens av faktiske luciferase protein nivåer.
Siden endret uttrykk for MIR-224 og MIR-383 ble observert i svulster i vev uttrykker type 1 iodothyronine deiodinase det tyder på at disse svulstene kan også presentere forstyrret uttrykk for
DIØ1
. Faktisk, i papillær tyroid cancer, ekspresjon av MIR-224 var signifikant forhøyet (39) mens våre studier viste at i dette kreft, uttrykk for
DIØ1
reduseres (3). Omvendt, i brystkreft, er MIR-383 mistet (40), mens
DIØ1
uttrykk øker betydelig (41). Enten svekket uttrykk for
DIØ1
virkelig skyldes endrede MIR-224 og MIR-383 nivåer i disse kreftformene må vurderes av egne studier.
Betydningen av våre funn kommer fra rollen som DIØ1 i mobilnettet fysiologi. DIØ1 er et enzym som regulerer biotilgjengelighet av thyreoideahormoner. Nylig ble det foreslått at DIØ1 ikke bidrar til sirkulerende T3 nivå, men snarere virker som en scavenger enzym som er involvert i jodid resirkulering (42). Imidlertid kan muligheten for at DIØ1 bidrar til lokalt syntetisert T3 i DIØ1 uttrykker vev ikke utelukkes som det var tidligere foreslått (43, 37). Dermed kan microRNAs regulerer DIØ1 uttrykk i ccRCC har potensial innflytelse på intratumorale thyroid hormonnivået. Faktisk, som vi viser i denne studien, tumorspesifikke endringer i intracellulær T3 konsentrasjonen korrelerer med endringer av Mir-224 uttrykk. Interessant, i vår nyere studie fant vi at transkripsjon av skjoldbruskkjertel hormon reseptor beta genet (
THRB
) er også et mål for mikroRNA avhengig regulering (37). MIR-204 er overuttrykt i ccRCC og resultater ved samtidig nedregulering av
THRB
uttrykk. Disse resultatene sammen med funnene i denne studien tyder på at microRNAs kan muligens bidra til vev hypotyreose i ccRCC resulterer i nedregulering av viktige gener av skjoldbruskkjertel hormon vei,
THRB Hotell og
DIØ1 Hotell og, i følge , som fører til reduksjon av intratumorale T3 nivå. Dette er en viktig observasjon fordi flere studier vist at THRB kan fungere som en tumor suppressor og at hypotyroidisme kan påvirke tumorvekst (44-48). Således kan mikroRNA avhengig regulering av intracellulær thyroid tilstand muligens ha potensiale til å påvirke neoplastisk prosess. Interessant, kan dette være et mer generelt fenomen i svulster med forstyrret uttrykk for
DIØ1 Hotell og
THRB
. I vår siste studie flere microRNAs som ble oppregulert i papillær skjoldbrusk svulster (PTC) ble vist til direkte rettet mot THRB avskrift resulterer i betydelige nedregulering av uttrykket (49). Det ville være interessant å se om uttrykket av microRNAs målretting
DIØ1
er også forstyrret i PTC svulster. Våre tidligere undersøkelser viste at tap av DIØ1 ekspresjon i PTC er ledsaget av manglende korrelasjon mellom mRNA og protein uttrykk (3). Dette tyder på mulig posttranskripsjonelt regulering inkludert mikroRNA engasjement. Men om svekket
DIØ1
uttrykk i PTC resultater fra mikroRNA-mediert deregulering må verifiseres av videre studier.
Disturbed mikroRNA uttrykk i ccRCC har allerede blitt rapportert i andre studier. Interessant, blant microRNAs forskjellig uttrykt i kontroll- og tumorprøver MIR-224 har gjentatte ganger blitt funnet av uavhengige studier (30, 33, 50). Dette tyder på mulig bruk av MIR-224 som en markør skille ccRCC svulster fra friskt vev. Angå MIR-383, ble det rapportert som nedregulert i leverkreft (51), bryst og eggstokkreft, melanom (40), akutt myelogen leukemi (52) og sentralnervesystemet svulster (53). Dermed er vår jobb den første som viser oppregulering av MIR-383 i kreft. Hvorvidt dette er en spesifikk funksjon i nyre neoplasi gjenstår å bli bekreftet av fremtidige eksperimenter. Begge microRNAs, MIR-224 og MIR-383 antas å være innblandet i kontroll av spredning eller apoptose. MIR-224 ble vist å øke celledød ved apoptose og proliferasjon i hepatocellulær karsinom (54), mens overekspresjon av MIR-383 inhiberte proliferasjon av testikkel embryonale karsinom-celler (55). Spørsmålet om MIR-224 og MIR-383 er involvert i ccRCC spredning venter fremtidige studier
I sammendraget, vi demonstrert at
DIØ1
3’UTR er rettet av to microRNAs. MIR-224 og MIR-383. MIR-224 formidler tap av DIØ1 i nyrekreft, hva resulterer i redusert intratumoral T3 konsentrasjon. Disse resultatene gir et sterkt bevis for en ny mekanisme som regulerer ekspresjonen av type 1 jodtyronin deiodinase. Tidligere rapporter avdekket at forstyrret uttrykk for THRB, et annet gen av skjoldbruskkjertel hormon vei, observert i ccRCC, kan også skyldes mikroRNA-avhengige deregulering. Sammen disse resultatene tyder på at den nye klassen av små, ikke-kodende RNA kan muligens bidra til intracellulær hypotyreose i ccRCC.
Materialer og metoder
Vevsprøver og cellelinjer
Vevsprøver ble oppnådd med tillatelse fra bioetikkomité av Medical Centre for videreutdanning i Warszawa fra pasienter med klarcellet nyrecellekarsinom (32 pasienter). Skriftlig informert samtykke ble oppnådd fra alle pasienter som deltok i denne studien. Prøvene ble delt i to grupper: tumorprøver (n = 32, T) og kontrollprøver (sammenkoblet normalt vev fra den motsatte pol av den ondartede nyre med ingen histologiske tegn på svulst; n = 32, C). Klarcellet nyrecellekarsinom ble diagnostisert histologisk henhold til WHO-kriterier (56). Svulster ble delt inn i tre grupper avhengig av graden av differensiering. G1 (høyt differensiert) G2 (middels grad av differensiering), G3 (dårlig differensiert kreft)
Livmorhalskreft (HeLa) og klarcellet nyrecelle kreft (Caki-2) cellelinjene anvendt i denne studien ble kjøpt fra American Type Culture Collection, (USA) og dyrket i henhold til ATCC protokollen. Cellene ble sådd på 12 brønners kulturplater på tetthet 5 × 10
4 (Caki-2) eller 1 × 10
5 (HeLa-celler) /brønn 24 timer før transfeksjon.
luciferaserapportørplasmid konstruerer
1023 bp fragment av
DIØ1
ble forsterket ved bruk av cDNA fra HeLa cellelinje (primere
DIØ1
-3’UTR F og R, Tabell S1, Opplysning data), klonet inn XbaI stedet umiddelbart nedstrøms for stoppkodonet i pGL3-Control Firefly luciferase reporter vektor (Promega, USA), sekvensert og navnet
DIØ1
-3’UTR, eller
DIØ1 Anmeldelser – rev3’UTR, avhengig av orienteringen av det klonede innsatsen. Den omvendt satt inn
DIØ1
-rev3’UTR ble brukt som negativ kontroll vektor. Seterettet mutagenese av Mir-224 og MIR-383 målse: GTGACTT av MIR-224 innen nt 1788-1794 og TCTGATCT av MIR-383 innen nt 898-904 i
DIØ1
3’UTR var utføres med hurtigkoblings mutagenese kit (Stratagene, Tyskland). Primere Mut224 F /R og Mut383 F /R (tabell S1, Supplemental data) og
DIØ1
-3’UTR plasmid som mal ble brukt. To konstruksjoner.
DIØ1
-3’UTR224mut og
DIØ1
-3’UTR383mut ble oppnådd
Sekvense reaksjonen ble utført ved hjelp BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA).
Cells transfeksjon og luciferase assay
Caki-2-celler ble sådd på 0,5 × 10
5 celler per 12-brønners skål og transfekterte 24 timer senere ved hjelp Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, USA) som beskrevet av produsenten med 37,5 pmol av miRNA forløpere: pre-MIR-224 og pre-MIR-383 (pre-MIR
™ miRNA Precursor Molecule, Ambion, USA), mirnas hemmere: anti -miR-224 og anti-MIR-383 (anti-MIR ™ miRNA Inhibitor Molecule, Ambion, USA) eller kontroll egge mikroRNA (Negativ mikroRNA Control, Ambion, USA). Cellene ble høstet etter 48 timer for RNA-ekstraksjon.
miRNA forløpere er syntetiske RNA tomannsboliger som etterligner endogene mirnas, mens hemmere har en sekvens som er komplementær til modne mirnas og funksjon av sequestering /nedverdigende endogene mirnas.
For reportergen assays, ble HeLa-celler sådd ut i 1 x 10
5 i 12-brønners plater, og 24 timer senere, kotransfektert med Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, USA). Hver kotransfeksjon reaksjon inneholdt 100 ng PRL-TK vektor (Promega, USA) uttrykker Renilla luciferase, 1 ug PGL-3 «UTR vektorer og 37,5 pmol av pre-Mirs eller egge mikroRNA. Etter 48 timer ble cellene lysert, og luciferase-aktiviteten ble analysert i dual-luciferase-assay (Promega, USA) ved anvendelse av et luminometer Synergy2 (BioTek, USA). Ildflue luciferase-aktiviteten ble normalisert til Renilla luciferase-aktivitet. I alle forsøkene ble transfeksjon og luciferase-analyser utført in triplo.
RNA isolering og revers transkripsjon
Total cellulær RNA ble isolert som beskrevet tidligere (37). Revers transkripsjon ble utført ved hjelp RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Litauen). For revers transkripsjon, ble 200 ng av total RNA brukes med Random heksamerprimere eller spesifikke stilk-løkke primere med 5′-overheng (Tabell S2, Supplemental data) for microRNAs.
cDNA for MIR-224 og speil 383 ble også syntetisert med spesifikke miRNA primere fra TaqMan mikroRNA Analyser (Applied Biosystems, USA) og reagenser fra TaqMan mikroRNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems, USA).
SQ-PCR
DIØ1
uttrykk analyse i Caki-2-celler ble utført ved hjelp av DNA SYBR Grønn jeg Master (Roche Diagnostics, Tyskland) i tre paralleller i henhold til produsentens protokoller. SQ-PCR-reaksjonen ble utført under følgende betingelser: 95 ° C i 10 minutter, 45 sykluser:. 95 ° C, 15 s; 57 ° C, 15 s; 72 ° C, 15 s, 68 ° C, 15 s; etterfulgt av smelting kurve analyse: 95 ° C, 5 min .; 65 ° C, 1 min .; kontinuerlig avlesning av fluorescens fra 65 ° C til 97 ° C med 0,11 ° C /s rampehastighet og 5 oppkjøp per hver ° C. Resultatene ble normalisert til uttrykk av 18sRNA host-genet
RN18S1
.
DIØ1 Hotell og
DIØ3
uttrykk analyse i vevsprøver ble utført som beskrevet tidligere (37). Sekvensene til primerne er vist i tabell S1, (Supplemental data).
