Abstract
Magekreft inkludert Cardia og ikke -cardia typer er den andre hyppig årsak til kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis. En undergruppe av ikke-Cardia magekreft genetisk mottakelighet loci har blitt løst blant asiatiske gjennom genom-wide assosiasjonsstudier (GWASs). Denne studien var å evaluere effekten av enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) lange intergeniske ikke-kodende RNA (lincRNAs) på ikke-Cardia magekreft mottakelighet i kinesiske populasjoner. Vi valgte lange intergeniske ikke-kodende RNA (lincRNAs) ligger i ikke-Cardia magekreft risikomessige loci og identifisert 10 SNPs ligger innenfor lincRNA exonic regioner. Vi undersøkte om genetisk polymorfisme i lincRNAs eksoner er assosiert med ikke-Cardia magekreft risiko i 438 ikke-Cardia mage kreftpasienter og 727 kontrollpersoner i kinesiske befolkninger benytter logistisk regresjon. Funksjonell relevans ble videre undersøkt av biokjemiske analyser. Vi fant ut at
lincRNA-NR_024015
rs8506AA føreren ble signifikant assosiert med risiko for ikke-Cardia magekreft (justert odds ratio [OR] = 1,56, 95% CI = 1,03 til 2,39, sammenlignet med rs8506 AG eller GG . genotype Ytterligere fordeling analyse viste at risikoen effekten var mer uttalt hos undergrupper av røykere (
P
= 0,001) Biokjemisk analyse viste at G til A baseendring på rs8506G . En forstyrrer bindingssetet for har- . MIR-526b og dermed påvirke transkripsjonen aktivitet av
lincRNA-NR_024015 Hotell og påvirker celleproliferasjon Vår studien etablert en robust sammenheng mellom rs8506G en polymorfisme i
lincRNA-NR_024015
exon og risikoen for ikke-Cardia magekreft
Citation: Fan QH, Yu R, Huang WX, Cui XX, Luo BH, Zhang LY (2014) den har-MIR-526b Binding-Site rs8506G en polymorfisme. i
lincRNA-NR_024015
Exon Identifisert ved GWASs disponere for Non-Cardia Gastric Cancer Risk PLoS ONE 9 (3). e90008. doi: 10,1371 /journal.pone.0090008
Redaktør: Xiaoping Miao, MOE Key Laboratory for miljø og helse, School of Public Health, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Kina
mottatt: 11. desember 2013, Godkjent: 25 januar 2014; Publisert: 04.03.2014
Copyright: © 2014 Fan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Suzhou Social Development Fund Project (SS08047), Jiangsu-provinsen er Key Medisinsk avdeling i 2011. de bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den nest største årsaken til kreft død på verdensbasis etter lungekreft i 2010, selv om dødelighet dødsfall. har gått noe ned fra 774 000 i 1990 til om lag 755 000 i 2010 [1], [2]. Epidemiologiske studier har vist at miljøfaktor, inkludert diett, tobakksrøyking, alkoholholdige forbruk og, spesielt, er infeksjon med Helicobacter pylori forbundet med en høyere risiko for GC [3], [4]. Til tross for disse kjente risikofaktorer, forskerne overbevist likevel at genetiske faktorer, særlig enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs), vil kunne spille en viktig rolle i den enkeltes risiko for å utvikle magekreft som bare en brøkdel av utsatte individer utvikle magekreft [5] .
til dags dato, med forkant av neste generasjon transkriptomet sekvensering (RNA-Seq), har det vært en betydelig endring i vår forståelse av hele settet av transkripsjons avvik i en sykdom, inkludert nye utskrifter og non-koding RNA (ncRNAs) ikke måles ved konvensjonelle analyser [6] – [9]. Av alle de for tiden karakterisert klasser av ikke-kodende RNA-molekyler, har disse blitt kalt lange mellom ncRNAs (lincRNAs) i mer enn 200 nukleotider (nt) som mangler en åpen leseramme og ikke overlapper protein-kodende gener [7], [10]. Grupper av lincRNAs har blitt godt karakterisert i noen grad og vist å korreleres med viktige cellulære prosesser som for eksempel preging, X-kromosom inaktivering, pluripotency vedlikehold, og transkripsjonsregulering [10] – [15]. Videre har nye bevis for feilregulert lincRNA uttrykk i en rekke kreftformer dukket lincRNA som en ny del av biologien, med bevis som tyder på at en stor rolle for involvering av lincRNA i menneskelig tumorigenesis og metastasering [16], [17]. Faktisk et godt beskrevet eksempel
hotair
har blitt studert bidragene til trinnvis progresjon av tumorigenesis [11], [18], fremhever rollen lncRNAs i kreft biologi. I tillegg er den lange ikke-kodende RNA
MALAT1 plakater (metastase-assosierte lungeadenokarsinom transkripsjon 1), er hyppig misregulation og som en prediktiv markør for en rekke humane kreft i tykktarmen, bryst og prostata [19] – [ ,,,0],22]. Likevel mekanismene bak den spesifikke funksjon lincRNAs i kreftutvikling er ikke fullstendig avgrenset.
I det siste tiåret, flere objektive genom-wide assosiasjonsstudier (GWAS) har utvidet vår forståelse av genetiske variasjoner knyttet til ulike typer sykdommer og kreft av høy gjennomstrømning teknologier [23]; imidlertid, i det minste en tredjedel av de identifiserte varianter innenfor ikke-kodende intervaller [24]. Nylig, to GWAS avdekket at flere mottakelighet risiko loci som er assosiert med ikke-Cardia magekreft (NCGC) risiko i en kinesisk befolkning. Bioinformatikk analyser har avdekket en rekke lincRNAs nær disse loci. Videre er det flere relevante enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) ligger i exonic regionene lincRNAs som kan assosiere med NCGC ble identifisert; har imidlertid sammenheng mellom genetiske variasjoner i lincRNAs eksoner og kreft mottakelighet sjelden rapportert.
I denne studien hypotese vi at SNPs i exonic regionen lincRNAs kan endres uttrykk nivåer og dermed kan bidra til NCGC. For å teste denne hypotesen, gjennomførte vi en sykehusbasert case-control studie for å undersøke sammenhenger mellom disse SNPs og mottakelighet for NCGC i en kinesisk befolkning.
Materialer og metoder
forsøkspersonene
Alle fag i denne studien var etnisk homogene Han-kinesere inkludert 438 NCGC pasienter og 727 friske kontroller. Pasienter som gjennomgikk kirurgi på Affiliated Hospitals of Suzhouuniversitetet (Suzhou) ble fortløpende rekruttert 2003-2009, med en svarprosent på 94%. Pasientene var fra Suzhou byen og dens omkringliggende områder, og det var ingen alder, kjønn, og histologi restriksjoner. Detaljer om kliniske kjennetegn pasientene er oppsummert i tabell 1. svulst, node, metastase (TNM) klassifisering og svulst staging ble evaluert i henhold til 2002 amerikanske Joint Committee on Cancer Staging system. Befolknings kontroller var kreftfrie mennesker som bor i Suzhou regionen; De ble valgt ut fra et ernæringsmessig undersøkelse gjennomført i samme periode som sakene ble samlet. Kontrollprøvene var tilgjengelig for oss fra tidligere studier som ble tilfeldig valgt fra en database bestående av 3500 individer basert på en fysisk undersøkelse [25] – [27]. Målingen for serum H. pylori immunoglobulin G i NCGC pasienter og kontroller ble bestemt ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). Denne studien ble godkjent av medisinsk etikk komité av Suzhouuniversitetet. Alle deltakerne var genetisk urelaterte etniske Han-kinesere og ingen hadde blodoverføring i løpet av de siste 6 månedene. Etter å ha gitt et skriftlig informert samtykke, ble hver deltaker planlagt for et intervju med en strukturert spørreskjema for å samle utvalgt informasjon, og til å donere 5 ml perifert blod.
SNP Utvalg
All publisert litteratur undersøker en sammenheng mellom genetisk disposisjon og NCGC risiko var kvalifisert. Vi søkte etter studier opp til august 2013 ved hjelp av PubMed databasen og Web of Science. Relevante søkeord var «genome-wide forening studie», «GWAS», «NCGC», «magekreft», «magekreft», og «asiatisk». Vi har også manuelt søkte referanselistene i utvalgte artikler. Vi først ekskludert noen artikler ved å skanne titler og sammendrag av studier som ikke var skrevet på engelsk. Så, etter å ha lest hele teksten i de resterende artikler, identifiserte vi et endelig sett av studier. Alle de valgte studiene med følgende kriterier: (1) resultatet undersøkt var basert på GWAS i forhold til NCGC hos mennesker; (2) artiklene ble publisert på engelsk; (3) de siste studiene ble valgt blant overlappende data og duplisert data; (4) GWAS ble utført ved bruk av brikketeknologi. De viktigste eksklusjonskriteriene var (1) anmeldelser, opplæring, bokstaver, og ledere; (2) kopiere data; (3) ikke en case-control design; og (4) overlappende data eller data dumpet av de siste rapportene. Neste, vi skurte mottakelighet loci identifisert av GWAS for NCGC i utvalgte artikler, ble 4 lincRNAs som ikke overlapper med noen anerkjente gener innen en 1-MB utvalg av disse loci, i begge retninger (totalt spenn på 2 MB) til slutt identifisert fra menneskelige lincRNAs databasen [28]. Videre ble Haploview programvare 4.2 brukes for bioinformatikk analyse av haplotype blokk basert på den kinesiske Han Beijing (CHB) befolkningsdata i HapMap (HapMap data Slipp 27 Fase II + III, februar 2009, på NCBI B36 montering, dbSNP B126). Disse SNPs med mindre allelfrekvensene på mer enn 5% i den kinesiske befolkningen ble hentet. Det var tre haplotype blokker i den kinesiske befolkningen (figur 1A). De haplotype merking SNPs ble valgt med Haploview programvare 4.2 Tagger program; ble det funnet at den rs11752896, rs11752942, rs4714336 og rs4711631 dekket haplotype i blokken 1 på en 100% hyppighet (rs11752896 og rs11752942: D «= 1,0, r
2 = 1,0; rs11752896 og rs4714336: D» = 1,0, r
2 = 1,0; rs11752896 og rs4711631: D «= 1.0, r
2 = 1,0). I tillegg rs2467950, rs2450764 og rs9312, rs8506 dekket haplotype i blokk 1 på en 100%, henholdsvis (rs2467950 og rs2450764: D «= 1.0, r
2 = 1,0; rs9312 og rs8506: D» = 1.0, r
2 = 1,0). SNPs rs2304285 og rs2477757 er utenfor blokkene. Derfor ble det SNPs rs11752896, rs2467950, rs8506, rs2477757 og rs2304285 valgt som fem mulige funksjonelle SNPs i exonic av de valgte lincRNAs som skal analyseres for sine assosiasjoner med risiko for magekreft.
(A) koblingsulikevekt (LD) kart for utvalgte SNPs av
lincRNA-NR_024015
exon. Den viste at rs11752896, rs11752942, rs4714336 og rs4711631 er i LD med D «= 1; rs2467950 og rs2450764 er i LD med D «= 1; rs9312 og rs8506 er i LD med D «= 1. (B) Nivåene av kjernefysisk kontroll avskrift (
U6
), cytoplasma kontroll transkripsjon (
GAPDH
mRNA), og
lincRNA -NR_024015
ble vurdert av RT-qPCR i kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner. Dataene er gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet. Data er presentert som en prosentandel av
U6
,
GAPDH Hotell og
lincRNA-NR_024015
nivåer og forvaltningsnivåer for hvert ble tatt for å være 100%. (C-D)
In-silico
prediksjon av foldestrukturer indusert av rs8506G A i
lincRNA-NR_024015
. Fjellet tomten er et xy-graf som representerer en sekundær struktur inkludert MFE struktur, den termodynamiske ensemble av RNA-strukturer (pf), og den sentroide struktur i et plott av høyde i forhold til posisjon. «MFE» representerer minimum fri energi struktur; «Pf» indikerer partisjon funksjon; «Tyngdepunktet» representerer Tyngdepunktet struktur.
Genotyping Analyse
Genome DNA ble ekstrahert fra perifere blod lymfocytter hos forsøkspersonene. Allel-spesifikk MALDI-TOF massespektrometri ble brukt til å genotype de markører som brukes i forening analyser, slik som tidligere beskrevet [27], [29]. Totalt 60 prøver ble vilkårlig valgt for direkte sekvensering for å bekrefte resultatene fra genotyping massespektrometrisk analyse, og resultatene var på 100% enighet. Omtrent 10% av prøvene ble også tilfeldig valgt for en blindet gjentakelse av genotyping uten forkunnskaper i forrige genotyping resultat eller status av å være en sak og kontroll, og resultatene var i 100% enighet.
Cell Culture
293T eller HGC-27 celler ble kjøpt fra Celle Bank of Type Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences, Shanghai Institute of Cell Biology, og ble passert for mindre enn 6 måneder. De 293T eller HGC-27-celler ble holdt i DMEM med høy glukose (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) eller RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) og 50 ug /ml streptomycin (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) ved 37 ° C i nærvær av 5% CO
2.
subcellulære Fraksjone
HGC- 27 cellene ble dyrket i en fuktet inkubator i 2 dager. For subcellulære fraksjoneringseksperimenter, opp til 2 x 10
6-celler ble anvendt. Cytosoliske og kjernefysiske ekstrakter fra brystkreft celler ble samlet ved hjelp av en kjernefysisk /cytosol Fraksjone kit (Biovision, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
In-silico
Prediksjon av Folding Structures indusert av Rs8506G A i
LincRNA-NR_024015
Som visse strukturer er mer sannsynlig til å spille viktige roller i biologiske funksjoner; dermed har vi brukt RNAfold og SNPfold algoritmer for å forutsi den antatte påvirkning av rs8506G A på de lokale foldestrukturer av
lincRNA-NR_024015
ved å analysere 61-bp regioner flankerer polymorfisme
Bygging av. reporter plasmider
To reporter plasmider som inneholder 160 bp
lincRNA-NR_024015
ekson region fragment flankerer rs8506G eller rs8506A allelet ble syntetisert ved Genewiz Company (Suzhou, Kina) og deretter klonet inn i psiCHECK- 2 grunnleggende vektor (Promega, Madison, WI) (figur 1B). Den resulterende konstruere med
lincRNA-NR_024015
rs8506 SNP (psiCHECK-to-lincRNA-rs8506G og psiCHECK-to-lincRNA- rs8506A) ble bekreftet ved sekvensering.
Forbigående transfections og Luciferase Analyser
Bioinformatikk analyse viste at rs8506G En polymorfisme finne på bindingssetet av mikroRNA har-MIR-526b (https://snpinfo.niehs.nih.gov/). Dermed ble de etterligner og hemmere av har-MIR-526b (GenePharma Co, Shanghai) brukes til å analysere effekten av har-MIR-526b på psiCHECK-to-lincRNA-rs8506 reporter gener
in vitro
. De 293T eller HGC-27-celler ble sådd ut i 24-brønners plater (1 x 10
5 celler per brønn) og dyrket til 60-70% konfluens før transfeksjon; Cellene ble så transfektert med rapportør plasmidene som er beskrevet ovenfor under anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA) som tidligere beskrevet [25]. I hver brønn, kotransfeksjonen ble utført med 800 ng konstruert plasmid DNA og 0, 1, eller 40 pmol mikroRNA har-MIR-526b ligner (Shanghai GenePharma Co., Ltd.), og med eller uten 40 pmol har-MIR -526b inhibitor, i henhold til produsentens instruksjoner. Luciferase-aktiviteten ble målt med Dual-luciferase reporter analysesystemet (Promega, Madison, WI, USA) ved anvendelse av et TD-20/20 luminometer (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA, USA), og resultatene ble normalisert mot aktiviteten
Renilla
luciferase genet. Hver gruppe inkludert 6 gjentak, og uavhengige tredoble eksperimenter ble utført.
Ekspresionsvektor Construction
For å studere rollen til
lincRNA-NR_024015 videre
i kreft progresjon, den full- lengde cDNA av
lincRNA-NR_024015
husing rs8506G og rs8506A alleler ble syntetisert ved Genewiz Company (Suzhou, Kina) og deretter klonet i pcDNA3.1 vektorer. Den resulterende konstruere med
lincRNA-NR_024015
rs8506 SNP (pcDNA-lincRNA-rs8506G og pcDNA-lincRNA-rs8506A) ble bekreftet ved sekvensering.
RNA Isolation og kvantitativ RT-PCR analyse
Trettito NCGC vevsprøver ble oppnådd fra biopsier av individuelle pasienter og lagret ved -80 ° C før analyse. Totalt RNA ble oppnådd fra disse cancervev med TRIzol Reagent (Molecular Research Center, Inc.). cDNA ble generert fra mRNA ved å bruke den tilfeldige primer og Superscript II (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) ble utført for å kvantifisere den relative genekspresjon av
lincRNA-NR_024015
, ved hjelp av en ABI Prism 7500 sekvens deteksjonssystem (Applied Biosystems) basert på SYBR-grønn metode, og
GAPDH
ble brukt som en intern referanse genet i hver reaksjon.
Cell Sikt analysen
i 96-brønnen, flatbunnede plater (BD Biosciences, Bedford , MA), 100 ul HGC-27 celler transfektert med pcDNA-lincRNA-rs8506SNP og har-MIR-526b eller kontroll ble porsjonert i hver brønn. Celleviabilitet ble målt ved celletelling Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratory, Kumamoto, Japan) basert på produsentens instruksjoner.
Statistical Analysis
Forskjellene i fordelinger av valgt demografiske variabler mellom saker og kontroller, samt allel og genotypefrekvensene ble vurdert av tosidige chi-squared tester. Ubetinget logis regresjonsmodeller ble brukt for å estimere sammenslutninger av genotyper av SNPs med risiko for magekreft ved odds ratio (OR) med 95% konfidensintervall (CIS), etterfulgt av stratifisering analyse av alder, kjønn, røyking og drikking status. Logistisk regresjon modellering ble benyttet i utviklingen testen, samt for å evaluere potensialet multiplikativ og additiv-gen-genet og gen-miljøfaktor interaksjoner. Videre dataene ble ytterligere stratifisert ved undergrupper av klinikken-patologisk variabler. Statistisk styrke ble beregnet ved å bruke PS programvare (https://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSampleSize, åpnes den 14 desember 2010). Enveis ANOVA test ble brukt for å evaluere effekten av ulike SNPs på
lincRNA-NR_024015
transkripsjon uttrykk. Alle testene var tosidige ved hjelp av SAS (versjon 9.1, SAS Institute, Cary, NC, USA). En
P
. 0,05 ble brukt som kriterium for statistisk signifikans
Resultater
genotyper og risikoen for ikke-Cardia Gastric Cancer
I studien, fem SNPs ble genotypet mellom saker og kontroller. Som vist i tabell 2, ble en signifikant sammenheng med NCGC risiko observert for rs8506G A. Spesielt resultatene av genotyping viste at sammenlignet med rs8506GG eller AG genotype,
lincRNA-NR_024015
rs8506AA føreren ble signifikant assosiert med risiko for ikke-Cardia magekreft (justert odds ratio [OR] = 1,56, 95% CI = 1,03 til 2,39). I tillegg ble det ingen signifikante forskjeller undersøkt i de andre fire SNPs (
P
0,05). Dermed kan vi konkludere med at genetisk variant rs8506G En polymorfisme i
lincRNA-NR_024015
spiller en betydelig rolle i formidling risikoen for NCGC
Stratifisering Analyse av Rs8506G . A genotyper og fare for NCGC
Vi utførte ytterligere en lagdeling analyse av assosiasjoner mellom variant genotyper og risikoen for NCGC av undergrupper av clinicopathological funksjoner i NCGC i denne studien. Som vist i tabell 3, ble det observert en signifikant sammenheng mellom variant genotyper og risikoen for NCGC hos pasienter med røyking (justert OR = 2,48, 95% CI = 1,63 til 3,78, homogenitet test
P
= 0,001) , noe som tyder på at røyking modulerer sammenhengen mellom
lincRNA-NR_024015
rs8506G en variant genotyper og risikoen for NCGC. Ingen signifikant sammenheng ble funnet i andre undergrupper.
Cellular Karakterisering av
LincRNA-NR_024015
Nivåene av kjernefysisk kontroll transkripsjon (
U6
), cytoplasma kontroll transkripsjon (
GAPDH
mRNA), og
lincRNA-NR_024015
ble vurdert ved RT-qPCR i kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner av HGC-27 celler, henholdsvis. Resultatene viste at
GAPDH
mRNA ble påvist utelukkende i den cytoplasmiske fraksjon, mens kjerne-beholdt
U6
ble hovedsakelig funnet i atomfraksjonen. Og
lincRNA-NR_024015
uttrykk var overveiende cytoplasma (figur 1B)
In-silico
analyse av effekten av Rs8506G . A i
LincRNA-NR_024015
Folding
ved hjelp RNAfold og SNPfold algoritmer i
in-silico
analyse, spådde vi lokale strukturelle endringer av
lincRNA-NR_024015
forårsaket av rs8506G En polymorfisme ligger innenfor den exonic regionen
lincRNA-NR_024015
. Som vist i figur 1C og D, resultatene antydet at G til A baseendring av rs8506G påvirker en direkte brettingen av
lincRNA-NR_024015
, noe som kan påvirke bindingssete for den mikroRNA. Dette kan da påvirke
lincRNA-NR_024015
genekspresjon
Rs8506G . A genotyper Påvirke
LincRNA-NR_024015
Expression ved å forstyrre Binding av Has-MIR-526b
in vitro
To luciferasereportergenet konstruksjoner inneholdt rs8506G eller A-allelet ble analysert ved forbigående co-transfeksjon med ligne og hemmer av har-MIR-526b som ble betinget binding til rs8506G En polymorfe sete av bioinformatikk analyse. Resultatet av luciferaseaktiviteten viste at HEG-27-celler transient ko-transfektert har-MIR-526b etterligner og konstruksjon inneholdende rs8506G allelet oppviste betydelig redusert luciferase-aktivitet, i en konsentrasjonsavhengig måte, og de har-MIR-526b inhibitorer betydelig reversert og oppregulert sine aktiviteter. Men ingen tydelig endring ble observert for reporter gen med et allel behandlet med has-MIR-526b etterligner eller hemmere (
P
0,05) (figur 2A). De samme resultatene ble også observert når disse forsøkene ble gjentatt ved bruk av 293T celler (figur 2B).
Representant graf av luciferase aktiviteten variant allel på luciferase reporter gener bærer
lincRNA-NR_024015
exonic region spenner over 160 bp flankerer rs8506G en polymorfisme segmenter i HEG-27 (A) og 293T celler (B). Resultatene er vist som prosent relativt til luciferase-aktivitet (Renilla luciferaseaktivitet ble målt og normalisert til ildflue luciferase). Relativ luciferase aktivitet av psiCHECK-2-
lincRNA-NR_024015
-G-allel og psiCHECK-2-
lincRNA-NR_024015
-A-allel konstruksjoner kotransfektert med has-MIR-526b ligne og inhibitor. Seks replikater for hver gruppe og eksperimentet gjentas minst tre ganger. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. Stjerne indikerer en betydelig endring (
P
0,001). (C)
LincRNA-NR_024015
uttrykk nivåer i trettito non-Cardia mage kreftpasienter for ulike rs8506G A genotyper (15 rs8506GG, 11 rs8506AG og 6 rs8506AA); data er gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet. (D) HEG-37 celler ble transfektert pcDNA-lincRNA-rs8506G eller pcDNA-lincRNA-rs8506A med has-MIR-526b. Etter 24 timer ble cellene oppsamlet, RNA ekstrahert og sanntids-PCR utført. Dataene er gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet. «Stjerne» representerer
P
0,05. (E) Cells «spredning raten signifikant hemmet når celler cotranfected
lincRNA-NR_024015
haboring rs8506G allel og har-MIR-526b. Celleformering ble utført ved cellelevedyktigheten analysen og effekten ble klart fra dag 2. Seks replikater for hver gruppe og eksperimentet gjentas minst tre ganger. Dataene er gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet. «Stjerne» representerer
P
. 0,05
Association of Rs8506G En genotyper med
LincRNA-NR_024015
Expression
Vi har samlet 32 tumorvev fra ubehandlede NCGC pasienter med ulike genotyper og utført real-time PCR for å evaluere effekten av
lincRNA-NR_024015
rs8506G A på
lincRNA-NR_024015
uttrykk. Resultatet viste at pasienter med rs8506AG og rs8506AA genotyper uttrykt betydelig høyere
lincRNA-NR_024015
mRNA nivåer (gjennomsnitt ± SEM) sammenlignet med bærere av rs8506GG genotype (AG: 0,029 ± 0,005, AA: 0,040 ± 0,005; GG: 0,019 ± 0,004;
P
= 0,023), som vist i figur 2C
Effekten av miRNA avhengig regulering av
LincRNA-NR_024015
Expression på celleproliferasjon.
Vi videre undersøkt om
lincRNA-NR_024015
rs8506G A genotyper ha effekter på cellevekst i
vitro
. Som vist i figur 2D,
lincRNA-NR_024015
ekspresjon ble redusert etter 24 timers transfeksjon i celler forbigående ko-transfektert med pcDNA-lincRNA-rs8506G og har-MIR-526b sammenlignet med de ko-transfektert med pcDNA-lincRNA- rs8506A og har-MIR-526b (
P
0,001). Celler med redusert uttrykk for
lincRNA-NR_024015
hadde en svak celle vekst sammenlignet med celler transfektert med pcDNA-lincRNA-rs8506A og har-MIR-526b fra dag 2 (
P
= 0,004 ) (figur 2E)
dicussion
i dagens sykehusbasert case-control studie med totalt 438 pasienter og 727 friske kontroller, vår gruppe fant rs8506G . A er assosiert med risikoen for NCGC. Våre data viste at personer som bærer rs8506AG og rs8506AA genotyper hadde en betydelig økt risiko for NCGC sammenlignet med GG genotype (
P
0,05). I tillegg viste det seg at en høy risiko virkning av denne polymorfisme var mer uttalt Hos røykere. Så vidt vi vet, er dette den første studien omfattende vurdere sammenhengen mellom variantene i exonic av lincRNA og risiko for NCGC.
Som en annen klasse av regulatoriske ikke-kodende RNA, lincRNAs, har nylig flyttet til i forkant av kodende RNA studien. Disse mRNA-lignende molekyler som mangler en vesentlig åpen leseramme, generelt avkortet, spleiset og polyadenylert har vært implisert i en rekke cellulære prosesser som kjernekraft arkitektur, regulering av genekspresjon, immunovervåkning, eller embryonale stamceller pluripotency. En håndfull studier har vist lincRNAs dukket opp som et nytt aspekt av biologi i en rekke sykdomstilstander, og endringer i uttrykk nivåer av lincRNAs kan bidra til kreft biologi ved transkripsjons, post-transkripsjon og epigenetiske nivåer [18], [30] – [32]. En fremtredende lincRNA,
ANRIL
, hadde blitt funksjonelt innblandet i kreft progresjon, typisk undertrykke epigenetisk genekspresjon via binding til og rekruttere kromatin modifisering komplekser [33], [34]. Et annet kjent eksempel er den lincRNA,
GAS5
; genetiske avvik på dette lincRNA locus har blitt funnet i mange typer av tumorer, inkludert melanom, bryst og prostata-kreft [35] – [37]. Disse linjene av bevis støttet betydningen av lincRNAs i cellebiologi og onkogenese. Nylig, to GWASs har rapportert en undergruppe av NCGC mottakelighet loci (5p13.1, 3q13.31, 8q24.3, 6p21.1 og 7p15.3) som er knyttet til utvikling av NCGC. Bioinformatikk analyse avdekket flere lincRNAs stengt for disse loci. Videre ble flere aktuelle enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) ligger i exonic regionene lincRNAs som kan assosierer med NCGC identifisert. Som vi alle kjent, det siste tiåret, med tilgjengeligheten av store RNA sekvensering, det er nå blitt bemerkelsesverdig tydelig at tusenvis av sykdomsrelaterte genetiske varianter oppholdt seg utenfor av gener eller selv i ikke-kodende transkripsjoner har allerede blitt oppnådd ved genom-prosjektet hos pattedyr [24]. Siste nye bevis har vist sammenhengen mellom SNPs bodde i lincRNAs og kreft hos mennesker. For eksempel, basert på 1000 genomer data, Guangfu Jin og colleages har funnet at regioner av lncRNA hadde en SNP’er densitet lik protein-kodende regioner og videre anmerkes at fenotype-relaterte SNP’er rapportert av GWAS ved lncRNA region kan bidra til prostata risiko [ ,,,0],38]. En fersk undersøkelse rapporterte også at en genetisk polymorfisme i
lincRNA-uc003opf.1
genet er assosiert med en økt risiko for å utvikle esophageal plateepitelkarsinom i kinesiske populasjoner [39]. Kollektivt, er vår nåværende studie i samsvar med tidligere funn viste at
lincRNA-NR_024015
var moderat mer rikelig i cytoplasma enn i kjernen av fraksjonerte magekreftceller, noe som tyder på at funksjonen av dette lincRNAs utøves i cytoplasma . Våre resultater ga et sterkt bevis som støtter en hypotese for cytoplasma regulering, der
lincRNA-NR_024015
rs8506G . En SNP kan påvirke uttrykket av dette lincRNA ved å modifisere bindingssetet for den har-MIR-526b
i denne studien vår resultat av tilknytning mellom en genetisk polymorfisme i exonic regioner av en lincRNA og mottakelighet for NCGC ble først oppnådd i kinesiske populasjoner. De relativt store utvalgsstørrelser brukes redusert størrelsen på ORS som kan oppdages statistisk. Videre har vi oppnådd en studie kraft på over 90% (tosidige test, α = 0,05) for å påvise en ELLER på 1,28 for de rs8506AG + AA-genotype (som forekommer ved en frekvens på 42,5% blant kontrollene), sammenlignet med den rs8506GG genotype. Spesielt, er foreningen biologisk plausibel og er i samsvar med funnene våre funksjonelle studier.
I konklusjonen, denne studien gitt den første bevis for at genetisk polymorfisme i exonic regionene lincRNAs spiller en viktig rolle som formidler individuelle mottakelighet for NCGC. Våre resultater støtter videre hypotesen om at genetiske varianter i lincRNA exonic regioner kan påvirke mikroRNA-mediert regulering og forbundet med risiko for GC. Våre funn tilsier validering i større, fortrinnsvis populasjonsbasert, case-kontrollstudier, samt av veldesignede mekanistiske studier.
