Abstract
Menneskedachs homolog 1 (
DACH1
) er en viktig komponent i Netthinne Fastsettelse Gene Network. Tap av DACH1 ekspresjon ble funnet i bryst, prostata, lunge, endometrial, kolorektal- og hepatocellulært karsinom. For å utforske uttrykk, regulering og funksjon av
DACH1
i menneskelig spiserørskreft, 11 esophageal kreft cellelinjer, 10 tilfeller av normal esophageal slimhinner, 51 tilfeller av forskjellige grader av dysplasi og 104 tilfeller av primær esophageal plateepitel kreft var ansatt. Metylering spesifikk PCR, immunhistokjemi, western blot, flowcytometri, små interfererende RNA, kolonidannelse teknikker og xenograft mus modell ble brukt. Vi fant ut at
DACH1
uttrykk ble regulert av promoter region hypermethylation i esophageal kreft cellelinjer. 18,8% (6 av 32) av grad 1, 42,1% (8 av 19) av grad 2 og grad 3 dysplasi (ED2,3) og 61,5% (64 av 104) av spiserørskreft ble metylert, men ingen metylering ble funnet i 10 tilfeller av normal esophageal slimhinner. Metylering ble økt i progresjon tendens i løpet av esophageal kreftutvikling (
P
0,01).
DACH1
metylering var assosiert med dårlig differensiering (
P
0,05) og sen tumorstadium (
P
0,05). Restaurering av
DACH1
uttrykk hemmet cellevekst og aktivert TGF-β signalering i KYSE150 og KYSE510 celler.
DACH1
trykkes menneskelig esophageal kreft celle tumorvekst i xenograft mus. I konklusjonen,
DACH1
ofte metylert i menneskelig esophageal kreft og metylering av
er DACH1
involvert i den tidlige fasen av esophageal kreftutvikling. DACH1 uttrykk er regulert av promoter region hypermethylation.
DACH1
undertrykker esophageal kreft vekst ved å aktivere TGF-β signale
Citation. Wu L, Herman JG, Brock MV, Wu K, Mao G, Yan W, et al. (2014) Dempe
DACH1
Fremmer Esophageal kreft vekst ved å hemme TGF-β signalering. PLoS ONE 9 (4): e95509. doi: 10,1371 /journal.pone.0095509
Redaktør: Dajun Deng, Peking University Cancer Hospital og Institute, Kina
mottatt: 17 februar 2014; Godkjent: 26 mars 2014; Publisert: 17 april 2014
Copyright: © 2014 Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra: National Basic Research Program (973 Program No. 2012CB934002, 2010CB912802), National High-tech R D Program (863 Program No. SS2012AA020314, SS2012AA020821, SS2012AA020303), National Key Scientific Instrument Spesial Programme of China ( Grant No. 2011YQ03013405) og Science Foundation National of China (Grant No. 81121004, 81071953, 81161120432, 81072169, 81172422, 81261120395). Nettadressene Funder nettsteder er: National Basic Research Program: https://www.973.gov.cn/Default_3.aspx; National High-tech R D Program: https://www.863.gov.cn/; National Key Scientific Instrument spesialprogram i Kina: https://www.most.gov.cn/index.htm; Foundation National Science of China: https://www.nsfc.gov.cn/. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. JGH er en konsulent til MDxHealth, men dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Esophageal kreft er den femte mest ondartet sykdom og har vært rangert som den fjerde største årsaken til kreft dødsfall i Kina. [1] Esophageal plateepitelkarsinom (ESCC) er den dominerende histologisk type esophageal kreft, og står for ca 90% av esophageal krefttilfeller i den nordlige og sentrale Kina. [2] Til tross for utvikling av multimodale behandlingsformer, forblir fem års overlevelse under 20%. [3] Mekanismene for esophageal kreft fortsatt uklare. Flere genetiske og epigenetiske forandringer ble sett på som viktige faktorer for å utvikle kreftfaren [4] – [6]
Dachs homolog 1 (
DACH1
), en viktig komponent i Netthinne Fastsettelse Gene Network. , er mye uttrykt i epitelceller. Reduksjon av DACH1 uttrykk var assosiert med dårlig prognose i bryst, prostata, lunge, endometrial, tykktarms og leverkreft. [7] – [13] Uttrykket av DACH1 ble regulert av promoter region hypermethylation i livmor, kolorektal og leverkreft. [11] – [13]
DACH1
trykkes human leverkreft ved aktivering av TGF-β signalering. [13] Mens epigenetiske forandringer og funksjonen til
DACH1
i menneskelig ESCC fortsatt uklare. I denne studien analyserte vi hovedsakelig epigenetiske forandringer og mekanismen for DACH1 på esophageal kreftutvikling.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
De studieprotokoller ble godkjent av etikk komiteen for den kinesiske PLA General Hospital (Permit Number: 20090701-015), og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra deltakerne. Alle prosedyrer for dyreforsøk ble godkjent av dyreetikk komiteen av den kinesiske PLA General Hospital (Permit Number: 2013-X8-40) og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Studien ble utført i samsvar med retningslinjene fra 1975 Helsinkideklarasjonen og var i samsvar med gode kliniske retningslinjer og lokale myndighetskrav.
Primær menneske vevsprøver og cellelinjer
En total av 104 tilfeller av primær esophageal plateepitelkarsinom ble samlet som Dypfryst vev fra kinesiske PLA General Hospital. Alle prøver ble klassifisert av TNM trinn, inkludert trinn I (N = 5), trinn II (n = 66), fase III (N = 32), og stadium IV (n = 1). Femti en tilfeller av esophageal dysplasi ble samlet som parafininnstøpte prøvene, inkludert 32 tilfeller av grad 1 dysplasi (ED1), 11 tilfeller av grad 2 dysplasi (ED2) og 8 tilfeller av grad 3 dysplasi (ED3). Ti tilfeller av normal esophageal slimhinner (NE) ble samlet ved biopsi etter endoskopi fra kinesiske PLA General Hospital. Blant 104 kreftprøver, 30 tilfeller av parafinblokker var tilgjengelige med matchet nærliggende vev. Elleve mennesker ESCC cellelinjer (KYSE30, KYSE70, KYSE140, KYSE150, KYSE180, KYSE410, KYSE450, KYSE510, TE1, TE3 og TE8) ble inkludert i denne studien. Alle ESCC cellelinjer ble tidligere beskrevet [14] – [17], og opprettholdt i RPMI-1640 (Invitrogen) supplert med 10% føtalt bovint serum og antibiotika. Den etiske komiteen av den kinesiske PLA General Hospital godkjent denne studien (Permit Number: 20090701-015)., Og skriftlig informert samtykke ble innhentet før innsamling av vevsprøve og cellelinjer
5-Aza-2′ deoxycytidine Treatment, RNA Isolation og Semi-kvantitative Reverse Transcription-PCR
ESCC cellelinjer ble delt i lav tetthet (30% samløpet) 12 timer før behandling. Celler ble behandlet med 5-aza-2′-deoksycytidin (5-AZA) (Sigma-Aldrich) ved en konsentrasjon på 2 uM i vekstmediet, som ble byttet hver 24. time for en total 96-timers behandling. Ved slutten av behandlingsforløpet, ble cellene samlet og total RNA ble isolert ved Trizol reagens (Invitrogen). Semi-kvantitativ revers transkripsjon-PCR (RT-PCR) ble utført som beskrevet tidligere [12].
Bisulfite Modifisering, Metylering Spesifikke PCR og sekvensering Bisulfite
Genomisk DNA fra ESCC cellelinjer og primære ESCC vev ble preparert ved proteinase-K-metoden. Metylering Spesifikke PCR (MSP) og Bisulfite Sekvensering (BSSQ) ble utført som beskrevet tidligere. [18], [19] MSP primere og BSSQ primere [12] ble utformet i henhold til genomiske sekvenser rundt transkripsjon start stedet i CpG øya
DACH1
genet (GenBank NM_080759.4) promoter-regionen og syntetisert (BGI ) for å oppdage unmethylated (U) og metylert (M) alleler.
Immunohistochemistry (IHC)
Immunhistokjemisk farging for DACH1 ble utført på 4 um tykke seriesnitt avledet fra formelle dehyde fiksert parafin blokker med antistoff mot DACH1 (1:500 fortynning, Proteintech) som beskrevet tidligere. [12] Den fargeintensitet og omfanget av de fargede området ble gradert i henhold til den tyske semi-kvantitativ scoring system, som også ble beskrevet tidligere [12].
Plasmid Bygg og Transfeksjon
DACH1
ekspresjonsvektor var en gave fra Dr. Cvekl.
DACH1
ekspresjonsvektor og Smad-bindende elementer (SBE) -4 Luc reporter plasmid ble beskrevet tidligere. [20]
DACH1
ble også subklonet inn plenti6-GFP vektor. Shuttle vektorkonstruksjoner og ViraPower Aging Mix ble kotransfektert 293ft celler for å få lentivirus i henhold til produsentens protokoll (Invitrogen). Lentivirus ble deretter tilsatt til KYSE510 og KYSE150 celler, og sceened ved Blasticidin (5 ug /ml, Invitrogen) for å generere
DACH1
stabilt uttrykket celler. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ble anvendt for plasmid transfeksjon. Alle konstruksjoner ble bekreftet ved sekvensering.
celleviabilitet analysen
DACH1
stabilt uttrykt celler og uuttalte kontroll ble sådd ut på 96-brønners plater (3 × 10
3 celler /brønn), og cellen levedyktighet ble målt daglig i 96 timer ved hjelp av Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratorie) i henhold til produsentens instruksjoner. Resultatene ble nedtegnet som middelverdier ± SD. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer og gjentas for tre ganger.
Colony Forming analyse
DACH1
stabilt uttrykt celler og uuttalte kontroll (5 × 10
2 celler /brønn) ble sådd ut i 2 ml komplett vekstmedium. Mediet og reagenser ble skiftet en gang på 72 timer. Etter 2 uker inkubering ble cellene fiksert med 75% etanol i 30 minutter og farget med 0,2% krystallfiolett (Beyotime) i 20 minutter og telling. For hvert forsøk ble kolonidannelse analysen utført tre ganger.
flowcytometrisystemer Analysis
For cellesyklusanalyse ble Cell Cycle Detection Kit (KeyGen Biotech) brukes i henhold til produsentens instruksjoner. Hver prøve ble analysert ved hjelp av strømningscytometri med et FACScan flow-cytometer (Becton-Dickinson) ved anvendelse av en 488 nm laser. Histogrammer ble analysert for cellesyklus avdelinger bruker ModFit versjon 2.0 (Verity Software House). For apoptose analyse ble Annexin V-FITC apoptose Detection Kit (KeyGen Biotech) utført i henhold til produsentens instruksjoner.
DACH1 Slå ned av siRNA
Fire utvalgte små interfererende RNA (siRNA) målretting
DACH1 Hotell og RNAi negativ kontroll Duplex ble brukt i denne studien, og sekvensene ble beskrevet tidligere. [12] RNAi oligonukleotid eller RNAi negativ kontroll Duplex (GenePharma) ble transfektert inn KYSE140 celler ved hjelp Lipofectamine RNAiMAX Reagens (Invitrogen), i henhold til produsentens instruksjoner.
Dual-luciferase reporter analysen
KYSE510 og KYSE150-celler (3 x 10
3) ble sådd ut på 96-brønners plater, inkubert i 24 timer og transfektert med en passende kombinasjon av reporter, ekspresjonsplasmider og kontroll vektor, inkludert SBE4-luc reporter plasmid (20 ng /brønn ), PRL-TK-kontroll-vektor (2 ng /brønn) som en intern kontroll reporter, og økende mengder av
DACH1
exprssion plasmid. Celler ble serum-sultet i 36 timer og deretter stimulert med eller uten TGF-β1 (Peprotech) i 12 timer før luciferase-assay. Relative luciferase-aktivitet ble målt med den doble luciferase reporter Assay System (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner. For hvert forsøk ble luciferase reporter-målingen ble utført tre ganger.
Protein Fremstilling og Western blot-analyse
Protein isolasjon og western blot ble utført som beskrevet tidligere. [12] Primære antistoffer var som følgende: DACH1 (Proteintech); c-myc, p21, fosfor-Smad3, cyclinD1 (Cellesignalering Technology); CDK4 (Affinity); fosfor-Smad2 (Millipore); cyclinE1, CDK2, Smad2 og Smad3 (BioWorld Technology); P-Actin (Beyotime). Blottene ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence (Pierce Bioscience).
In vivo
tumorigenitet
DACH1
stabilt uttrykt KYSE510 celler og uuttalte kontroll (4 × 10
6-celler i 0,2 ml fosfat-buffret saltvann) ble injisert subkutant inn i den dorsale flanke av fem uker gamle hunn Babl /c nakne mus henholdsvis; hver gruppe inkludert 5 mus. Tumorstørrelsen ble målt hver 5. dag i 4 uker siden 5 dager etter implantering, og tumorvolumet ble bestemt med følgende formel: Tumor volum (mm
3) = [Lengde (mm)] x [bredde (mm) ]
2/2. Alle prosedyrer ble godkjent av dyreetikk komiteen av den kinesiske PLA General Hospital (Permit Number: 2013-X8-40). Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse.
Statistical Analysis
Data som samles inn fra flere uavhengige eksperimenter ble presentert som gjennomsnitt ± SEM, og analysert ved hjelp av Student
t
test. DACH1 uttrykk nivå mellom kreftfaren og matchet prøvene tilstøtende vev ble sammenlignet med Wilcoxon signed-rank test. Spearmans rang korrelasjonskoeffisient ble beregnet for evaluering av sammenhengen mellom uttrykk og metylering av DACH1. Forholdet mellom clinicopathologic egenskaper og DACH1 metylering status ble analysert ved hjelp av chi-kvadrat test. Et
p
verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikans. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 15.0 programvare.
Resultater
DACH1 Expression er ned Regulert av arrangøren Region Hypermethylation i ESCC cellelinjer
DACH1 uttrykk ble regulert av promoter region hypermethylation i human kolorektal og leverkreft. [12], [13] For å undersøke reguleringen av
DACH1
i ESCC, ekspresjon og den metylering status for
DACH1
ble påvist ved RT-PCR og MSP i spiserøret kreftcellelinjer. Som vist i figur 1A, ble Tap av DACH1 ekspresjon funnet i KYSE150, KYSE510, TE1 og TE3 celler, ble redusert DACH1 ekspresjon først i TE8 celler, og ekspresjon av DACH1 ble påvist i KYSE30, KYSE70, KYSE140, KYSE180, KYSE450 og KYSE410 cellene . MSP Resultatene er vist i figur 1B.
DACH1
var helt denaturert i KYSE150, KYSE510, TE1 og TE3 celler, delvis i TE8, og unmethylated i KYSE30, KYSE70, KYSE140, KYSE180, KYSE450 og KYSE410 celler. MSP resultater ble ytterligere validert av bisulfite sekvensering (BSSQ) i KYSE150, KYSE510, TE8 og KYSE140 celler (Fig. 1C). Ovenfor resultater indikerer at promoter-regionen hypermethylation er korrelert med tap /reduksjon av
DACH1
uttrykk. Re-uttrykk /økende uttrykk for
DACH1
ble indusert av 5-aza-2′-deoksycytidin (5-AZA) i
DACH1
metylert esophageal kreft cellelinjer (KYSE150, KYSE510, TE8, fig. 1A). Disse dataene tyder på at
DACH1
uttrykk er regulert av promoter region metylering i ESCC cellelinjer.
(A)
DACH1
uttrykk nivå oppdages ved RT-PCR i esophageal kreftcelle linjer. (B) Metylering status i promoter-regionen; IVD:
in vitro
denaturert DNA, brukt som metylering kontroll; NL: normal blod lymfocytt-DNA som benyttes som unmethylation kontroll; U: unmethylated lene; M: metylert alleler. (C) BSSQ av
DACH1
promoter-regionen (-426 bp til -140 bp) i KYSE150, KYSE510, TE8 og KYSE140 celler; tohodet pil: MSP PCR produkt, som strekker seg over 130 bp. Fylte sirkler: denaturert CpG områder; åpne sirkler. unmethylated CpG nettsider
DACH1 er ofte denaturert i Human Esophageal Cancer
For ytterligere å undersøke metylering status for
DACH1
under menneskelig ESCC utvikling, 10 tilfeller av normal esophageal slimhinner, ble 51 tilfeller av forskjellige grader av dysplasi og 104 tilfeller av primær ESCC oppdaget av MSP. Som vist i figur 2A og 2B, 18,8% (6 av 32) av spiserørs grad 1 dysplasi (ED1), 42,1% (8 av 19) av klasse 2 og klasse 3 dysplasi (ED2,3), og 61,5% (64 av 104) av invasiv spiserørskreft (EF) ble metylert, men ingen av de 10 tilfellene av normal esophageal mukosa ble metylert. Hyppigheten av
DACH1
metylering ble økt i progresjon tendens i løpet av esophageal kreftutvikling (
P
0,01).
DACH1
metylering var assosiert med dårlig differensiering (
P
0,05) og sen tumorstadium (
P
0,05) betydelig. Ingen sammenheng ble funnet mellom
DACH1
metylering og alder, kjønn, metastaser eller tumorstørrelse (
P
0,05, tabell 1). Over Resultatene indikerer at
DACH1
metylering er en tidlig tilfelle av esophageal kreftutvikling og metylering av
er DACH1
akkumulert under utviklingen av spiserørskreft. Ekspresjon av DACH1 ble evaluert ved immunhistokjemi (IHC) i 30 tilfeller av matchet spiserørskreft og prøvene tilgrensende vev. Uttrykket ble betydelig redusert i kreftprøver (
P
. 0,01, figur 2C og 2D). Det tyder på at
DACH1
er en mulig svulst suppressor i spiserørskreft. For å se om DACH1 uttrykk ble regulert av DNA metylering i menneskelig primær kreft, ble foreningen av DACH1 uttrykk og promoter region hypermethylation analysert. Redusert uttrykk ble funnet i 19 tilfeller av kreft vev og 15 saker ble metylert (Fig. 2E). Reduksjon av DACH1 uttrykk var assosiert med promoter region hypermethylation signifikant (
P
0,01). Disse resultatene tyder på at DACH1 ekspresjon blir regulert av promoter region hypermethylation i humane primære ESCC.
(A) Representative MSP resultatene av
DACH1
metylering status i normal esophageal slimhinne (NE), øsofageal dysplasi ( ED) og spiserørskreft (EF). (B)
DACH1
metylering frekvens i NE, ED1, ED2 og ED3, og EC. Hyppigheten av denaturert
DACH1
ble plottet i henhold til histologisk grad og analysert ved hjelp av chi-kvadrat test. **
P
0,01. (C) Representant IHC resultater for DACH1 uttrykk på barnekreftfaren (til venstre) og tilstøtende vev (til høyre); øvre fase, X200; lavere fase, X400. (D) DACH1 ekspresjonsnivået i 30 tilfeller samsvarte primærcancer og prøvene tilstøtende vev; boksplott: representerer DACH1 uttrykk nivå; horisontal linje: representerer medianverdien; den øverste og nederste linjen boksene representerer 75% og 25% uttrykk nivå, henholdsvis; vertikale linjene representerer forskjellige uttrykk nivå. **
P
0,01 versus tilstøtende vevsprøver ved hjelp av Wilcoxon signed-rank test. (E) Foreningen av
DACH1
metylering og tap /redusert uttrykk i 30 tilfeller ESCC. **
P
. 0,01, Spearmans rang korrelasjonskoeffisient
Restaurering av DACH1 Expression Undertrykker Esophageal kreft vekst både
in vitro Hotell og
in vivo
for å se effekten av
DACH1
på ESCC celleproliferasjon, KYSE510 og KYSE150 celler med stabilt uttrykker
DACH1
eller tom vektor ble etablert av lentivirus transduksjon. Celleviabilitet og kolonidannelse ble analysert i
DACH1
stabilt uttrykt celler og uuttalte kontroll. Re-uttrykk for
DACH1
hemmet celledeling (
P
0,01, figur 3A.) Og kolonidannelse (
P
0,05, figur 3B.) I disse cellelinjene. Funksjonen til
DACH1
på spiserørskreft ble også undersøkt i xenograft mus modell (fig. 3C). Svulsten størrelsen var mindre i
DACH1
uttrykt KYSE510 celler enn i kontroll (104.23 ± 21,38 mm
3 vs 494.65 ± 81,98 mm
3
P
0,01, fig . 3D), og svulsten vekten var mindre i
DACH1
uttrykt KYSE510 celler enn i kontrollgruppen (78 ± 28 mg vs 182 ± 37 mg,
P
. 0,01, fig 3E ). Uttrykket av DACH1 ble validert ved IHC i xenograft (Fig. 3F). Disse resultatene tyder på at
DACH1
undertrykker spiserørskreft vekst både
in vitro Hotell og
in vivo
.
(A) Vekstkurvene representerer CCK-8-analyse resultater for
DACH1
uttrykt celler og uuttalte cells.Points, mener fire uavhengige forsøk; barer, SEM. **
P
0,01, Student
t
test. (B) Representative resultatene av kolonidannelse i
DACH1
uttrykte og uuttalte KYSE510 og KYSE150 cellelinjer. Kolonner, mener fire uavhengige forsøk; barer, SEM. *,
P
0,05 versus kontroller ved hjelp av Student
t
test. (C) Representanter resultatene av xenografttumorer i hårløse mus for
DACH1
uttrykte og uuttalte KYSE510 celler. (D) Vekstkurvene representerer tumorstørrelse i
DACH1
uttrykte og uuttalte KYSE510 celler xenograft mus i forskjellig tid. Points, mener av 5 mus; . Barer, SEM *,
P
0,01, Student
t
test. (E) Representative resultater av tumorvekt i
DACH1
uttrykte og uuttalte KYSE510 celler xenograft mus i forskjellig tid. Kolonner, mener av 5 mus; barer, SEM. *,
P
0,01, Student
t
test. (F) Representive DACH1 uttrykk resultater oppdages av IHC for
DACH1
uttrykte og uuttalte KYSE510 celler xenograft. DACH1 uttrykk ble funnet i
DACH1
uttrykt KYSE510 celle xenograft. (høyre). Forstørrelse: øvre fase, X200; lavere fase, X400.
Restaurering av DACH1 Expression Økt G
1 fase og Redusert S Fase Cells
Effekten av
DACH1
på cellesyklusen var analysert ved flowcytometri på KYSE510 og KYSE150 cellelinjer. Som vist i figur 4A, Forholdet mellom G1 faseceller var 51,05 ± 2,28% og 38,56 ± 1,64% i
DACH1
uttrykt og unexpressed KYSE510 cellelinjer (
P
0,05). Forholdet mellom S-fasen var 25,72 ± 0,99% og 37,09 ± 1,49% i
DACH1
uttrykte og uuttalte KYSE510 cellelinjer (
P
0,05). Forholdet mellom G1 fase celle var 65,46 ± 2,84% og 44,41 ± 2,87% i
DACH1
uttrykte og uuttalte KYSE150 cellelinjer (
P
0,05). Forholdet mellom S-fasen var 12,34 ± 0,10% og 32,06 ± 1,32% i
DACH1
uttrykte og uuttalte KYSE150 cellelinjer (
P
0,01). Disse resultatene tyder på at
DACH1
øker G1 fase og reduserte S-faseceller i spiserørskreft
(A) Strømningscytometri resultater viser:. Cellen fasefordelingen i DACH1 unexpressed og uttrykt KYSE510 og KYSE150 cellene . Kolonner, mener tre uavhengige eksperimenter; barer, SEM. *,
P
0,05; **
P
0,01, Student
t
test. (B) Western blot resultatene viser: uttrykk for G1 /S sjekkpunkt relaterte gener i DACH1 uuttalte og uttrykte KYSE510 og KYSE150 celler, ble β-Actin brukes som start kontroll
Økt uttrykk for CDK2. , CDK 4, cyclinD1 og cyclinE1 representerer vanligvis fremme cellesyklusen fra G1 fase til S-fasen. Som vist i figur 4B, uttrykk for CDK2, CDK 4, ble cyclinD1 og cyclinE1 redusert tilsynelatende i
DACH1
uttrykt KYSE510 og KYSE150 celler sammenlignet med uuttalte celler. Det tyder på at
DACH1
undertrykker celleproliferasjon ved å hemme G
1 /S sjekkpunkt i spiserørskreft. Effekten av
DACH1
på celle apoptose ble også analysert ved flowcytometri i KYSE510 og KYSE150 cellelinjer, men ingen apoptose endringen ble funnet før og etter restaurering av
DACH1
uttrykk i disse to cellelinjer (data ikke vist).
Restaurering av DACH1 Expression Aktiverer TGF-β signale i ESCC
Vår tidligere studie fant at
DACH1
utført anti-spredning effekt ved å aktivere TGF β alarm og hemme c-myc uttrykk i humane leverkreft cellelinjer. [13] For å finne ut om TGF-β signale reguleres av
DACH1
i ESCC, dual-luciferase reporter analysen ble ansatt for å undersøke SBE4 luciferase aktivitet i KYSE510 og KYSE150 cellelinjer. Som vist i figur 5A, ble SBE4 promoter-aktivitet økte mer enn tre ganger i KYSE510 og 2,6 ganger i KYSE150 celler etter gjenopprettelse av
DACH1
uttrykk, og aktiviteten ble øket på en doseavhengig måte ved restaurering av
DACH1
uttrykk kombinert med TGF-β1 behandling. For ytterligere å forstå mekanismen for
DACH1
på TGF-β signalering, nivået av fosforylert Smad2 (p-Smad2) og fosforylert Smad3 (p-Smad3), og nedstrøms mål, ble p21 og c-Myc evaluert i
DACH1
uuttalte og uttrykt KYSE510 og KYSE150 cellelinjer. Nivået av p-Smad2 ikke ble endret før og etter re-ekspresjon av
DACH1
, mens nivået av p-Smad3 ble øket etter re-ekspresjon av
DACH1
. Nivået av p-Smad2 og p-Smad3 ble økt etter tilsetning av TGF-β1. p-Smad3 økte tilsynelatende da lagt TGF-β1 til
DACH1
re-uttrykt KYSE510 og KYSE150 celler. Ekspresjonen av gener nedstrøms var forskjellige. p21 ble oppregulert og c-myc ble nedregulert etter re-uttrykk for
DACH1 plakater (fig. 5B). Det antyder at TGF-β signale aktiveres av
DACH1 Hotell og TGF-β1 forsterker denne effekten. For ytterligere å validere effekten av
DACH1
på TGF-β signalering, ble siRNA knockdown teknikk ansatt. Nivået på p-Smad2 ikke endre etter banket ned
DACH1
i
DACH1
uttrykt KYSE140 celler, men nivået på p-Smad3 ble redusert da slå ned
DACH1
. Både p-Smad2 og p-Smad3 ble økt etter tilsetting TGF-β1. p-Smad3 ble økt noe ved å legge til TGF-β1 til siRNA transfekterte KYSE140 celler sammenlignet med bare slå ned
DACH1
. Redusert p21 og økt c-myc uttrykk ble funnet etter banket ned
DACH1
i KYSE140 celler (Fig. 5C og 5D). Over resultater videre foreslå at TGF-β signale aktiveres av
DACH1
i menneskelig esophageal kreft.
(A) Smad-bindende elementer (SBE) -4 Luc reporter aktiviteter i KYSE510 og KYSE150 celler . Kolonner, mener tre uavhengige eksperimenter; barer, SEM. (B) Ekspresjon nivået av TGF-β signalenedstrømsgener i
DACH1
uttrykt celler og unexpressed celler, β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (C) Effektiviteten av siRNAs målretting på
DACH1
i KYSE140 celler. (D) Ekspresjonsnivået av TGF-β signalenedstrømsgener i
DACH1
-siRNA KYSE140 celler og kontrollgruppe, β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
diskusjon
uttrykk for DACH1 ble redusert i bryst, prostata, lunge, endometrial, kolorektal og leverkreft, men det ble økt i eggstokkreft. [7] – [13], [21] DACH1 uttrykk ble regulert av promoter region hypermethylation i livmor, kolorektal og leverkreft. [11] – [13] I denne studien, viste vi at DACH1 uttrykket ble redusert og uttrykk for DACH1 ble regulert av promoter region hypermethylation i menneskelig esophageal kreft. Vi hadde rapportert at mange kreftdempere var denaturert med en progresjon tendens i løpet av esophageal kreftutvikling. [15], [16], [22], [23] I denne studien har vi analysert metylering status for
DACH1
i normal esophageal slimhinner, ulike grader av dysplasi og invasiv kreft.
DACH1
ofte ble metylert i spiserørskreft og frekvensen ble økt med utviklingen av esophageal kreftutvikling fra normal esophageal mucosa til invasiv kreft. Det tyder på at
DACH1
er en spiserørskreft tidlig oppdagelse markør. Foreningen av dårlig differensiering og sent svulst scenen med
DACH1
metylering tyder på at
DACH1
metylering kan tjene som spiserørskreft prognostisk markør.
DACH1
ble betraktes som en tumor suppressor eller et onkogen i forskjellige typer av cancer. [7] – [13], [21] I vår studie,
DACH1
ble funnet å undertrykke kreftfaren vekst både
in vitro Hotell og
in vivo
. TGF-β superfamilien er et sett av multifunksjonelle cytokiner som regulerer cellevekst, differensiering, apoptose, migrasjon og angiogenese. [24] – [27] I normale epitelceller, innebærer TGF-β signalisering i transkripsjonen aktivering av cyklin-avhengig kinase inhibitor p21Cip1, og undertrykkelse av den vekstfremmende transkripsjonsfaktoren c-Myc. Samarbeide, disse genet svarene megle cellesyklus arrest i G1 fasen. [28] – [30] TGF-β signalering spiller en avgjørende rolle, men paradoks i forskjellige krefttyper [31] – [33]. I brystkreft, undertrykker TGF-β signalecellevekst i tidlig stadium og fremme kreft invasjon i sent stadium. [34] Forrige studie i brystkreft viste at DACH1 hemmet TGF-β signalering gjennom bindende Smad4. [20] Mens i leverkreft, vi fant DACH1 aktivert TGF-β signalering ved å øke p-Smad3. Den forbedrede undertrykkelse av c-myc ekspresjonen og celleproliferasjon. [13].
Til støtte av tidligere rapport som DACH1 indusert p21 protein overflod og antagonized Myc-indusert onkogene fenotype i brystkreft, [35] fant vi her at ektopisk uttrykk for DACH1 alene esophageal kreftceller økt p21 og nedsatt c-Myc-proteinet nivå (fig. 5B). Dessuten, DACH1 synergized med TGF-β å forbedre induksjon av p21 og undertrykkelse av c-Myc; tilsvarende, slå ned DACH1 trykt TGF-β signalering i KYSE140 celler. TGF-β signalering kan crosstalk med mange andre veier. p53 og smads fysisk interaksjon og synergically coregulated TGF-β målgener som p21 og p15. [36] Nylige studier har vist at DACH1 forbundet med p53 og p53 forbedret funksjon å indusere apoptose og hemmer tumorvekst. Videre studier viste at DACH1 delt belegg på -15% p53-bundet gener i ChIP sekvensering. [7], [9] Som DACH1 aktivert TGF-β signalering (fig. 5A) og indusert fosforylering av smad2 /3 (fig. 5B), er en mulig forklaring aktivering og stabilisering av smad2 /3-protein-komplekset ved DACH1 som p53 . Imidlertid må detalj mekanismen som skal bevises.
I konklusjonen,
DACH1
ofte metylert i menneskelig esophageal kreft og metylering av
DACH1
er involvert i den tidlige fasen av esophageal kreftutvikling. DACH1 uttrykk er regulert av promoter region hypermethylation.
DACH1
undertrykker esophageal kreft vekst ved å aktivere TGF-β signalering.
Takk
Takk Dr. Cvekl for å gi DACH1 ekspresjonsvektorer.
