Abstract
Bakgrunn
Anterior gradient homolog 2 (AGR2) er et funksjonelt protein med kritiske roller i en rekke ulike biologiske systemer, inkludert virveldyr vev utvikling, inflammatorisk vev skade reaksjoner, og kreft progresjon. Kliniske studier har vist at den AGR2 protein er overuttrykt i et bredt spekter av humane kreftformer, inkludert karsinomer i spiserør, bukspyttkjertel, bryst, prostata og lunge, noe som gjør proteinet som en potensiell kreft biomarkør. Men den generelle biokjemiske funksjoner av AGR2 i menneskelige celler forblir udefinert, og signalmekanismer som driver AGR2 å hemme p53 er fortsatt ikke klart illustrert. Derfor er det av stor interesse å utvikle molekylære prober som spesifikt gjenkjenner AGR2 for sin oppdagelse og for belysning av AGR2-forbundet molekylære mekanismen.
Metodikk /hovedfunnene
Gjennom en perle basert og flowcytometri overvåket SELEX teknologi, har vi identifisert en gruppe av DNA aptamerer som spesifikt bindes til AGR2 med
K
d
verdier i nanomolar serien etter 14 runder med valg. Aptamer C14B ble valgt for videre studier, på grunn av høy bindingsaffinitet og spesifisitet. Den optimaliserte og forkortet C14B1 har spesielle G-rike egenskaper, og G-rike regionen av denne bindingsmotiv ble videre karakterisert for å avdekke en intramolekylær parallell G-quadruplex av CD-spektroskopi og UV-spektroskopi. Våre eksperimenter bekreftet at stabiliteten til G-quadruplex struktur var sterkt avhengig av arten av de monovalente ioner og dannelsen av G-quadruplex struktur var også viktig for bindingskapasiteten av C14B1 til målet. Videre har vi laget et slags allosterisk molekyl beacon (AMB) probe for selektiv og sensitiv deteksjon av AGR2.
Konklusjon /Betydning
I dette arbeidet har vi utviklet nye aptamer prober for spesifikk anerkjennelse av AGR2. Strukturell studie har identifisert at bindingen motiv av aptamer er en intramolekylær parallell G-quadruplex struktur og dens struktur og bindingsaffinitet er sterkt avhengig av arten av det monovalente ion. Videre med vår design av AGR2-amb, kan AGR2 være følsomt og selektivt oppdaget. Dette aptamer sonde har stort potensial til å tjene som et nyttig verktøy for tidlig diagnose og prognose av kreft og for grunnleggende forskning for å belyse de biokjemiske funksjoner av AGR2
Citation. Wu J, Wang C, Li X, Song Y Wang W, Li C, et al. (2012) Identifisering, karakterisering og anvendelse av en G-quadruplex Strukturert DNA Aptamer mot kreft Biomarker Protein Anterior Gradient homolog 2. PLoS ONE 7 (9): e46393. doi: 10,1371 /journal.pone.0046393
Redaktør: Pierre Busson, Institute of Cancerology Gustave Roussy, Frankrike
mottatt: 02.06.2012; Godkjent: 29 august 2012; Publisert: 28.09.2012
Copyright: © Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Basic Research Program of China (2010CB732402), National Instrument Program (2011YQ03012412), Foundation Natural Science of Fujian-provinsen for Distinguished Young Scholars (2010 J06004), og National funnet for Fremme Talenter av Basic Science (J1030415). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
anterior gradient homolog 2 (AGR2) ble først identifisert som en sekretorisk faktor uttrykt i fremre område av rygg ektoderm i Xenopuslaevis embryoer, hvor det ble antatt å mediere spesifikasjon av dorsoanterior ectodermal skjebne, særlig i formasjonen av sementkjertel [1]. Kliniske studier har videre vist at den AGR2 protein er overuttrykt i et bredt spekter av humane kreftformer, inkludert karsinomer i spiserør, bukspyttkjertel, bryst, prostata, lunge og [2] – [6]. Flere biologiske studier i disse kreftcellelinjer har antydet en betydelig rolle for AGR2 i tumorassosierte trasé, inkludert tumorvekst, cellulær transformasjon, cellemigrasjon, lem gjenfødelse og metastase [5], [7] – [9]. Men den generelle biokjemiske funksjoner av AGR2 i humane celler forblir udefinert, og signalleringsmekanismer som driver AGR2 til å hemme p53 fremdeles ikke klart illustrert [10]. Derfor er utviklingen av molekylære ligander som spesifikt gjenkjenner AGR2 er av stor betydning for tidlig diagnose og prognose av kreft og for å fundamental forskning for klarlegging av de biokjemiske funksjoner av AGR2.
Forskjellige ligander er blitt utviklet for spesifikk molekylær gjenkjennelse , for eksempel små molekyler, antistoffer, peptider og [11] – [13]. Mer nylig er en annen type molekyl ligand, kalt aptamer, trukket betydelig oppmerksomhet. Aptamerer, enkelttrådet modifisert eller umodifisert oligonukleotider (RNA eller DNA), genereres gjennom
in vitro
utvelgelsesprosessen eller SELEX (Systematisk Evolution of ligander ved eksponentiell berikelse) med høy bindende affinitet og spesifisitet mot definerte mål [14 ], [15]. De valgte aptamerer kan gjenkjenne et vidt spekter av mål, som består av små molekyler, proteiner, celler og vev som baserer seg på deres ulike tertiære strukturer. Sammenlignet med antistoffer, aptamerer har lav molekylvekt, fast vev inntrengningshastighet, høy stabilitet og lav immunogenesis [16]. De kan bli kjemisk syntetisert med lave kostnader og lett modifisert med forskjellige reportere [17]. Dessuten kan de bli ligert og /eller forsterket av enzymer
in vitro product: [18]. Disse fordelene gjør aptamerer lovende ligander for medisinsk og farmasøytisk forskning, for eksempel narkotika utvikling, sykdom diagnose og målrettet terapi [19].
De mulighetene som aptamerer er enorme, og noen aptamerer har allerede vist mange viktige bruksområder i bioanalysisand biomedisin [20] – [23]. Spesielt har flere aptamerer blitt generert mot kreft-relaterte proteiner, slik som PDGF, VEGF, HER3, NFkB, tenascin-C, eller PMSA [24] – [26]. Mange aptameric sensorer, følere og analyser er blitt utviklet for å tillate sensitiv og selektiv påvisning av disse kreft biomarkør proteinene [27]. For eksempel, Yang
et al
har rapportert en lett-å bytte excimer aptamer prober for sensitiv kvantitativ påvisning av PDGF i celle media [28]. Kwon
m.fl.
har utviklet en funksjon polypyrrole nanorør med aptamer å bygge en VEGF biosensor [29]. Aptamerer har også blitt brukt for molekylær avbildning til
in vivo
karakterisere komplekse sykdomsfremkallende aktiviteter som følger tumorvekst for sykdommen tidlig diagnose og patogenesen måling [30] – [33]. Siden målene for aptamerer kan være intracellulær, ekstracellulære eller celle-overflate biomolekyler, ulike terapeutiske metoder har blitt utviklet ved hjelp av aptamerer som målgruppe reagenser [34] – [37], som i stor grad utvide omfanget av målrettet terapi. I tillegg har noen terapeutisk anvendbare aptamerer blitt funnet å hemme protein-protein interaksjoner, slik som reseptor-ligand interaksjoner, og derved fungere som antagonister [38].
I denne studien, ved hjelp av kulebaserte og strømnings cytometri overvåket SELEX teknologi, rettet vi å innhente spesifikke aptamerer til AGR2 og studere deres struktur og potensielle funksjon. Perler baserte SELEX tillot bruk av enkle, men effektive, flowcytometri analyse for å overvåke fremdriften av utvalget, unngå den kjedelige, tidkrevende og radioaktivt EMSA prosessen [39] – [43]. Etter 14 runder med valg, har vi identifisert en gruppe av DNA aptamerer som spesifikt bundet til AGR2 med høy affinitet. Strukturelle studier på en av de aptamer sekvenser, C14B, avslørte en intra parallell G-quadruplex, og dens struktur og bindende affinitet til AGR2 avhenge K
+ ion intensivt. Videre har vi utviklet et allosterisk molekyl sjømerke AGR2-amb basert på de identifiserte aptamer, som muliggjør enkel, sensitiv og selektiv deteksjon AGR2. De aptamer sekvenser og AGR2-amb rapportert i denne studien er potensielt nyttige verktøy for tidlig diagnose og prognose av kreft og for grunnleggende forskning for å belyse de biokjemiske funksjoner av AGR2.
Diskusjon
Resultater og
Utvalg DNA aptamerer å gjenkjenne AGR2
for å identifisere aptamerer mot AGR2, ble rekombinant AGR2 smeltet sammen med glutation-S-transferase (GST) for å lette monteringen av protein til faste bærere (Sepharose GSH-perler). De resulterende AGR2-GST-perler ble anvendt som den positive mål i SELEX mens GST-perlene som negativ kontroll for å fjerne ikke-spesifikke overflate bindende sekvenser. Prosessen med
in vitro
sepharose-kule-baserte SELEX er skjematisk illustrert i figur 1.
I sepharose-kuler basert SELEX fremgangsmåte for protein AGR2, ble GST-kulene inkubert med den ssDNA bibliotek for kontra utvalg for å fjerne ikke-spesifikke sekvenser. De ubundne DNA ble deretter inkubert med AGR2-GST-perler for target-utvalget. Etter hardt vasking ble AGR2 spesifikke DNA-sekvenser senere forsterket av PCR for neste runde av valget, eller for kloning og sekvensering for å identifisere individuelle aptamerer etter flowcytometri analyse.
En 87-nukleotid ( 87-nt) enkelt-trådet DNA (ssDNA) bibliotek med 45 vilkårlige baser, flankert av to primer-sekvenser (22-nt og 20-nt) ble underkastet den SELEX prosedyre. Biblioteket ble først tillatt å interagere med overskytende negative kontroll kuler, og bare de DNA-sekvenser som ikke er bundet til GST-kulene ble oppsamlet. De oppsamlede sekvensene ble deretter inkubert med AGR2-GST-perler. Etter grundig vasking ble de sekvenser som enten ikke binder seg, eller bare svakt bundet til målet kassert. Bare de sekvensene som bandt sterkt nok ble holdt tilbake på kulene, og perle-ssDNA-kompleksene ble samlet opp og amplifisert ved PCR for den neste seleksjonsrunde. Etter flere runder med utvelgelse, subtraksjonsprosessen effektivt redusert DNA-sekvensene som er bundet til GST-kulene, mens de AGR2-spesifikk aptamer kandidater ble gradvis anriket. Fremdriften av utvelgelsesprosessen ble overvåket av flowcytometri. Jo sterkere binding av DNA-bibliotek for å AGR2, jo mer FAM merkede sekvensene som er bundet til kulene, og dermed jo høyere fluorescensintensitet kulene ville slippe ut. Med det økende antall valgsykluser, ble jevn økning i fluorescens intensitet på målet perler observert (figur 2a). Bindingsaffiniteten til det anrikede biblioteket etter 14 runder med utvelgelse var bestemt til å være i det nanomolare området (K
d = 64,1 ± 5,4 nM), mens det var ingen observerbar binding av biblioteket for å styre kulene (figur 2b). Resultatene antydet at DNA aptamerer spesifikt gjenkjenner AGR2 ble beriket i utvelgelsesprosessen.
a) Flowcytometri analyse for å overvåke bindingen av et valgt basseng med AGR2 (target protein) og GST (kontroll protein). Den røde kurven representerer bakgrunnen bindingen av umerket bibliotek. For målet protein AGR2, var det en økning i bindingskapasitet av bassenget som utvalget kommet, mens det var ingen observerbar endring for kontroll protein GST. Den endelige konsentrasjonen av den valgte bassenget i bindingsbuffer var 100 nM. b) Bestemmelse av dissosiasjonskonstanten av den anrikede biblioteket og umarkert biblioteket til AGR2. c) Fluorescensmålingene for å bestemme dissosiasjonskonstanten valgt aptamer C14B. To negative kontroller, GST-perler og GSH-perler, ble utført. Dataene var gjennomsnittet av tredoble resultatene fra eksperimentet.
Karakterisering av utvalgte aptamer sekvenser
Etter 14 runder med valg, beriket DNA bassenget ble klonet og sekvensert. Sekvenseringsdata for kloner ble analysert ved hjelp av sekvensanalyse-programvare Clustal W 6.0 [44]. Sekvensene ble gruppert basert på homologien likhet av DNA-sekvensene fra individuell klon. Blant de sekvenser fra 62 kloner, var det to underfamilier som hver inneholder flere sekvenser med fellestrekk. En underfamilien er guanosine rike sekvenser (22 kloner), og den andre er tymin rike sekvenser (40 kloner) (Figur S1). Fire sekvenser ble valgt og syntetisert for ytterligere karakterisering (tabell S1): tre sekvenser fra G-rik underfamilien, C14A (dukket 2 ganger), C14B (dukket 3 ganger) og C14C (dukket opp 5 ganger), og en sekvens C14D (dukket opp to ganger) fra T-rike underfamilie. Bare en T-rik sekvens ble valgt på grunn av T-rike sekvenser som har en tendens til fra ikke-stive tertiære strukturer og muligheten til å være aptamer ble antatt å være meget lav. Som vist i figur 2c, kan C14B binde AGR2 med den høyeste affinitet (
K
d
= 13,1 ± 7,2 nM). Titrering av C14B til GST-perler viste ingen observerbar binding, som fastslår at bindingen målet for C14B var faktisk AGR2. Andre tre sekvenser har lignende bindende konstanter til AGR2 men litt svakere enn C14B, der
K
d
av C14A er 20,9 ± 5,2 nM, er C14C 44,6 ± 7,0 nM og C14D er 48,4 ± 15,6 nM. (Figur S2).
Sekvens optimalisering av aptamer C14B
Siden C14B er den beste aptamer vi hentet fra de fire sekvenser som ble testet, var det choses for fremtidig optimalisering og karakterisering. Lengden av C14B er 87mer, noe som er ufordelaktig for fremtidige anvendelser, fordi det er upraktisk og kostbart å syntetisere en lang sekvens. Å identifisere bindende regionen av aptamer, de marginale sekvenser av C14Bwas gradvis avkortet. To avkortet sequencesC14B0 og C14B1 fra C14B ble vist i Tabell 1. Etterskudds bindingsaffinitet eksperimenter viste at både C14B0 (8,5 ± 3,6 nM) og C14B1 (19,1 ± 5,1 nM) har lignende
K
d
til AGR2 som beskrevet i original C14B (13,1 ± 7,2 nM). Flertallet av elimineres sekvenser ble primer-sekvenser, noe som tyder på at bindingsområdet av aptamer var midten av tilfeldige sekvenser og primersekvensene ikke eller bidra lite til bindingsaffiniteten aptamer. C14B1 har fem porsjoner av poly-G og vi utviklet fem avkortede sekvenser ved å fjerne en av poly-G del hver (tabell S2). Fjerning av poly-G-del ville ødelegge dets bindingsaffinitet til visse forlenge (figur S3), noe som tyder på hele G-motiv er nødvendig for aptamer binding. Tar sammen, disse resultatene tyder på at C14B1, som var bare 33 mer, var det avgjørende bindende region til AGR2. Dermed C14B1 ble søkt om ytterligere karakterisering og probe design.
selektivitet Aptamer C14B1
For å demonstrere spesifikk interaksjon mellom AGR2 og C14B1, tre kontroll proteiner BSA, trombin og trypsin ble koblet med NHS-Sepharose-kuler og deretter ble inkubert med C14B1. Som vist i figur 3, kan C14B1 binde til målet AGR2 sterkt, mens det var liten eller ingen bindingsaffinitet mot trombin, trypsin og BSA, som demonstrerer den høye selektiviteten til aptamer.
Signal-til-bakgrunnsforhold (SBR) er definert som den fluorescens signal forholdet av FAM-merket aptamer til FAM-merket tilfeldig sekvens ved behandling med protein modifiserte perler. Dataene var gjennomsnittet av tredoble resultatene fra eksperimentet.
Aptamer C14B1 er en intra Parallel G-quadruplex
Videre undersøkelser viste at C14B1 har flere strekninger av guanines (CGGGTGGGAGTTGTGGGGGGGGGTGGGAGGGT). Det er godt kjent at guanin rike sekvenser kan kaste i fire-strandet sekundære strukturer som kalles quadruplexes. Ifølge G-quadruplex prediksjon formel d (G
3 + N
1-7G
3 + N
1-7G
3 + N
1-7G
3 +) [45], C14B1 hadde stor sannsynlighet for å danne en G-quadruplex struktur. I G-quadruplex er planar torget arrangement av fire guanines (Tetrad) stabilisert av Hoogsteen hydrogenbinding. Avhengig av retningen av trådene eller deler av en tråd som danner tetrader, kan strukturer bli beskrevet som parallelt eller antiparallelt. Videre kan disse quadruplexes danne gjennom intermolekylær assosiasjon av fire eller to DNA-molekyler, eller ved intramolekylær brettingen av en enkelt tråd som inneholder fire blokker med guanines [46] CD eksperimenter ble utført for å undersøke den sekundære struktur av aptamerC14B1. CD-spekteret av C14B1 viste en negativ topp nær 240 nm og en positiv topp i nærheten av 260 nm, et typisk spektrum for en parallell G-quadruplex [47]. For å undersøke hvorvidt C14B1 danner en intermolekylær 4-trådet eller enkelt-trådet intramolekylær G-quadruplex struktur, ble avhengigheten av smeltetemperaturen av konsentrasjonen av C14B1 studert [48]. Smeltetemperaturen for C14B1 ble funnet å være 59 ° C, som var uavhengig av oligonukleotid-konsentrasjon (fig S4), som indikerer at den aptamer danner en intramolekylær G-quadruplex.
bindingsaffinitet og struktur Stabilitet i C14B1 er K
+ Dependent
Mange DNA aptamerer er blitt funnet å danne G-quadruplex strukturer [49] – [51]. Det er vel etablert at eksistensen av et enverdig kation (spesielt kalium) i midten av disse tetrader kan i betydelig grad stabilisere G-quadruplexes [52] – [54]. Således undersøkte vi hvordan en kation vil påvirke den strukturelle stabiliteten av C14B1 og dets bindingsaktivitet mot å AGR2. Som vist i figur 4a, er stabiliteten av C14B1 G-quadruplex struktur er sterkt avhengig av nærværet av enverdig ion. Med 60 mM KCl, ble sterke CD topper observert, noe som tyder på dannelsen av stabile G-quadruplex struktur. Skifte KCl med den samme konsentrasjon av LiCl, NaCl, og MgCl
2 førte til en dramatisk reduksjon i intensitet CD.
a) CD spektrene til aptamer C14B1 i nærvær av forskjellige kationer. Dette aptamer har en positiv bånd nær 260 nm som kan tildeles en parallell quadruplex strukturer. b) Den strukturelle stabiliteten i aptamer er sterkt avhengig av [K
+]. c) Fluorescerende signal migrering av C14B1 binding til AGR2-perler ved forskjellige konsentrasjoner av K
+ ble undersøkt. d) Bindings konstanter C14B1 i buffer w /og w /o K
+. Dataene var gjennomsnittet av tredoble resultatene fra eksperimentet.
Vi studerte videre effekten av K
+ konsentrasjon på stabiliteten av G-quadruplex. I figur 4b, tilsetning av 0,1 mM K
+ i fosfatbuffer dramatisk økt CD intensitet ved 240 og 260 nm. CD absorpsjon intensitet forsterket med økning av K
+ -konsentrasjon og nådde et platå ved K
+ konsentrasjonen var høyere enn 20 mM. Bindingsaffiniteten til C14B1 ved forskjellige konsentrasjoner av K
+ ble også undersøkt. Som flowcytometri resultatene vist i figur 4c, meget svak binding av C14B1 mot AGR2-perler ble observert når det ikke var noen K
+ i bufferen, og bindingsaffiniteten holdt øke ved tilsetning av K
+. Bindings-konstantene i C14B1 ble målt og sammenlignet i nærvær eller fravær av K
+ (figur 4d).
K
d
verdi i nærvær av K
+ var fast bestemt på å være 6,2 ± 1,9 nM. Resultatene viste at dannelsen av G-quadruplex er viktig for bindingsevne av aptamer C14B1 til dens mål, noe som er svært K
+ avhengig.
allosterisk molekyl radiofyr for deteksjon AGR2
kliniske studier har allerede vist at AGR2 protein er overuttrykt i et bredt spekter av humane kreftformer. Den følsomme og selektiv påvisning av AGR2 er derfor av stor betydning for tidlig kreftdiagnostikk. Heri, ved å bruke den valgte og optimalisert aptamer C14B1, vi designet og utviklet en allosterisk molekylær fyrtårn mot AGR2, oppkalt AGR2-AMB, som konverterer molekylet anerkjennelse eiendom aptamer til fluorescens flowcytometri signal for AGR2 sensing [55]. Figur 5 illustrerer arbeidsprinsippet AGR2-amb. En AGR2-amb er et ssDNA som består av et streptavidin (SA) aptamer sekvens [56], et C14B1 sekvens, en kort sekvens komplementær til en liten del av det SA aptamer-sekvens, og en fluorofor. En stabil hårnål struktur dannes ved intramolekylær hybridisering mellom SA aptamer-sekvensen og den komplementære sekvens, midlertidig deaktivering sondens evne til å binde med SA perler. Følgelig, når inkubert sammen med SA perler, kan ingen sonde binde til SA kuler, og kulene viser meget lav fluorescens. I nærvær av AGR2 imidlertid C14B1 sekvens i løkken amb bindes til målsekvensen, som i sin tur forstyrrer hårnål struktur for å frigjøre SA bindingssekvensen, for derved å aktivere sondens bindingsaffiniteten til SA perler. Dermed vil AGR2-bundne proben bindes til SA perler, noe som vil fluorescere sterkt fordi sonden FAM merket. Target molekyler kan oppdages og kvantifiseres ved å lese fluorescens intensitet SA perler gjennom strømningscytometeret
Vi har utformet AGR2-AMB, med følgende rekkefølge:. CGACGCACCGATCGCAGGTTCGGGATTTTCGGGTGGGAGTTGTGGGGGGGGGTGGGAGGGTT-FAM, hvor AGR2 bindende regionen er understreket og SA aptamer sekvensen er i fet skrift. Stabil hårnål struktur dannes ved intramolekylær hybridisering (figur S5). I vårt eksperiment, når bare AGR2-amb inkubert med SA perler, kan ingen sonde binde seg til SA perler og perler fluorescerte svært svakt. I nærvær av AGR2 imidlertid fluorescensintensiteten av SA perler øke betydelig, noe som tyder på at binding av AGR2-bundet probe til SA perler. Med økningen av AGR2 konsentrasjon, ble jevn økning i fluorescens intensitet på målet perler observert. AGR2 på 100 nM konsentrasjon kan lett oppdages (figur 6a). En serie av proteiner, inkludert BSA, trypsin, trombin, og IgG ble anvendt som kontroller (500 nM), og ingen distinkte fluorescente signaler ble observert (figur 6b), som indikerer en utmerket spesifisitet AGR2-AMB mot målmolekylet. Resultatene viste sensitiviteten og spesifisiteten til allosterisk molekyl beacon probe, noe som tyder på dens potensial for anvendelse i det virkelige prøveanalyse, slik som protein funksjon studium og sykdomsdiagnose.
a) Reaksjon av AGR2-amb til forskjellige konsentrasjoner av AGR2 i Tris-HCl-buffer. b) Response av AGR2-amb til forskjellige mål inkludert AGR2 (100 nM), BSA, IgG, Trypsin og trombin (500 nM hver for kontroll proteiner). Dataene var gjennomsnittet av tredoble resultatene fra eksperimentet.
I konklusjonen, har vi utviklet nye aptamer prober for innpassing av AGR2. I SELEX prosessen ble AGR2-GST-koblet protein anvendt som målproteinet, og bundet til Sepharose-kuler gjennom den milde, men også spesifikt, ikke-covalent GST-glutation interaksjon. Perler baserte SELEX tillot bruk av enkle, men effektive, flowcytometri analyse for å overvåke fremdriften av utvalget, unngå den kjedelige, tidkrevende og radioaktivt EMSA prosess. Gjennom flere runder med valg med GST som en kontroll, har vi identifisert aptamerer som selektivt gjenkjenner AGR2 med nanomolar
K
d
verdier. CD-målinger og smeltetemperatur analyser viste at den optimale aptamer C14B1 danner en intramolekylær parallell G-quadruplex struktur og dens struktur og bindingsaffinitet er sterkt avhengig av arten av det monovalente ion. Videre med vår design av AGR2-amb, kan AGR2 være følsomt og selektivt oppdaget aptamer sekvenser og sensorer rapporteres her har et stort potensial til å tjene som et nyttig verktøy for tidlig diagnose og prognose av kreft og for grunnleggende forskning for å belyse de biokjemiske funksjoner av AGR2.
Materialer og metoder
Første bibliotek design
HPLC-renset bibliotek som inneholder en sentral randomisert sekvens av 45 nukleotider flankert av to 20-nt og 22-nt primer hybridisering nettsteder. Initial biblioteket var: 5′-TCT CGG ACG CGT GTG GTC GG-N45-C TCG CTG CCT GGC CCT AGA GTG-3 «, frem primer: 5′-FAM-TCT CGG ACG CGT GTG GTC GG-3′, reverse primer : 5»-Biotin-CAC TCT AGG GCC AGG CAG CGA G-3 «
Utarbeidelse av AGR2-GST koblet protein
plasmid pGEX-GST-AGR2 ble forvandlet til ingeniør belastning. BL-21 og GST-merket AGR2 protein ble uttrykt. Etter rensing med glutation sepharosekuler (GE Healthcare) ved affinitetskromatografi ble GST-AGR2 koblet protein knyttet til sepharose perler for positiv seleksjon. Etter å ha blitt vasket flere ganger med W1-buffer (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,07% β-merkaptoetanol, 1% Triton X-100), ble den endelige rensede AGR2-GST-perler som er lagret i sterilisert PBS-buffer. Flowcytometri analyse med TAMRA-merket anti-AGR2 monoklonalt antistoff (Santa Cruz) og SDS-PAGE indikerte at GST-AGR2 koblet protein ble vellykket knyttet til sepharosekuler.
Valg av AGR2 bindende aptamerer
prosedyrene av utvalget var som følger. Den ssDNA basseng (200 pmol) oppløst i bindingsbuffer (200 ul, 1 x PBS buffer som inneholder 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na
2HPO
4 og 2,0 mM KH
2PO
4, pH 7,4) ble denaturert ved oppvarming ved 95 ° C i 5 minutter og deretter hurtig avkjølt på is i 10 min, og deretter inkubert i ytterligere 10 minutter ved romtemperatur før binding. Den ssDNA Bassenget ble deretter inkubert med negative GST perler (1,0 × 10
5 perler) for teller valg for å fjerne sekvenser som ikke er spesifikt bindende til GST perler. Etter filtrering med et filter hjemmelaget kolonne, filtratet ble inkubert med positive AGR2-GST-perler (1,0 x 10
5 perler) ved 37 ° C i 45 min. De ubundne eller ikke-spesifikt bundet oligoes ble fjernet ved filtrering. Sekvensene bundet til mål-belagte perler ble deretter amplifisert ved PCR med FAM og biotin-merkede primere (5-15 sykluser av 0,5 minutter ved 94 ° C, 0,5 min ved 53 ° C og 0,5 minutter ved 72 ° C, etterfulgt etter 5 min ved 72 ° C; den Easytaq pluss-polymerase og dNTP-er ble erholdt fra Transgen Beijing). Etter denaturering i NaOH (0,1 M), ble det valgt forstand ssDNA adskilt fra det biotinylerte antisense-ssDNA tråd på streptavidin-belagte sepharosekuler (GE Healthcare) og anvendt for neste runde valg. For den første runden valg, mengden av første ssDNA pool var 5 nmol, ble oppløst i 500 ul bindingsbuffer, og telleren-seleksjonstrinnet ble eliminert. For å skaffe aptamerer med høy affinitet og spesifisitet, ble det merkede styrke forbedres gradvis ved å øke antall vaskinger (fra tre til ti ganger med 200 pl 1 x PBS-buffer hver), og redusere mengden av ssDNA biblioteket per runde (fra 200 til 150 pmol).
Kloning og DNA-sekvensering
den resulterende bassenget fra 14
th runde ble PCR forsterket, klonet og sekvensert (Shanghai Sangon sekvense anlegg). De resulterende 62 sekvenser ble utsatt for multippel sekvenssammenstilling analyse ved hjelp av Clustal W 6.0-programvare for å oppdage høyt konserverte motiver i grupper av utvalgte DNA-sekvenser. De oppdaget konsensussekvenser med høye gjengangere blant utvalgte bassengene ble deretter kjemisk syntetisert for videre testing.
flowcytometrisk analyse
For å overvåke anriking av aptamerer etter valget, ble FAM-merket ssDNA basseng inkuberes med 5 x 10
4 AGR2-GST-kuler eller GST-perler i bindingsbuffer (200 ul) ved 37 ° C i 45 min. Perlene ble vasket tre ganger med 200 ul bindingsbuffer ved hjelp av filtrering, og suspenderes i bindingsbuffer (250 ul). Fluorescensintensiteten av de resulterende perler ble overvåket med en FACSAria cytometer (Becton Dickinson Immuno-cytometri-systemer) ved å telle 10000 hendelser. Bindingsaffinitetene av aptamerer ble bestemt ved inkubering av AGR2-GST-kuler (5 x 10
4) med forskjellige konsentrasjoner av FAM-merkede aptamerer (pre-varmebehandlet) i bindingsbuffer (200 ul) ved 37 ° C i 45 min i mørket. Perlene ble deretter vasket tre ganger med bindingsbuffer, og deretter resuspendert i bindingsbuffer (250 ul) og underkastet strømningscytometri-analyse. FAM-merkede uselektert ssDNA bibliotek ble anvendt som negativ kontroll for ikke-spesifikk binding evaluering. Alle bindingsforsøk ble gjentatt to til fire ganger. Den midlere fluorescensintensitet av målproteinet merket ved aptamerer ble brukt til å evaluere bindingsaffinitet ved å subtrahere den midlere fluorescensintensitet av ikke-spesifikk binding som produseres av umerket ssDNA bibliotek. Dissosiasjonskonstantene (
K
d
) av de fluoriserende ligander ble oppnådd ved å montere avhengighet av fluorescensintensiteten av spesifikk binding av konsentrasjonen av ligandene til ligning (1): Y = B
maxX /(
K
d
+ X) med Sigmaplot programvare.
sirkulærdikroismeanalyse spek
CD målinger ble utført på et Jasco J-810 spectropolarimeter utstyrt med en programmerbar temperatur-styreenheten (Julabo HP-4). Konsentrasjonen av DNA-prøvene var 2 mM. Før den CD spektrumet målingen, ble DNA-prøver glødet ved oppvarming til 95 ° C i 5 minutter og deretter hurtig avkjølt på is i 10 min, og inkubert i ytterligere 10 minutter ved romtemperatur. Den spektra fra 400 til 200 nm ble oppnådd ved hjelp av en nm spaltebredde og 0,1 nm skanneoppløsningen. Hver CD spekteret var i gjennomsnitt 8 skanninger med buffer bakgrunnen trekkes fra.
UV termisk-denaturering eksperimentet
UV absorbans og smelte studier ble utført på en Agilent 8453 spektrofotometer utstyrt med en programmerbar temperatur -kontroll enhet (Agilent 89090A). Smeltetemperaturer (T
m) ble tatt da temperaturen av halv-dissosiasjon av quadruplex og ble oppnådd fra det maksimale av den første deriverte dA /dT-plott ved 295 nm. De varmebehandlede DNA-oppløsninger ved flere konsentrasjoner ble innført i en kvartskuvette og belagt med et tynt lag av silikonolje for å forhindre fordampning. Den optiske veilengden var 1 cm. Absorbans og temperatur ble registrert hver 2 ° C.
Evaluering av AGR2-amb
AGR2-AMB (40 nM) ble glødet ved oppvarming til 95 ° C i 5 minutter i 200 mL Tris- HCl-buffer (25 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 2 mM MgCl
2 ved pH 7,4), og deretter hurtig avkjølt på is i 10 min, og deretter å vente på ytterligere 10 minutter ved romtemperatur før bruk. Til løsningen av AGR2-amb, ble forskjellige konsentrasjoner av AGR2 tilsatt, og de resulterende løsninger ble inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Til blandingen, 1 pl av streptavidin kuler (ca. 5 x 10
4 kuler) ble tilsatt og blandingen fikk anledning til å sette i 45 minutter i mørke. Etter vasking to ganger med Tris-HCl-buffer, ble SA perler filtrert for å fjerne ubundet AGR2-AMB og resuspendert i Tris-HCl-bufferoppløsning 250 ul før strømningscytometri-analyse.
