Abstract
Den dystre dødeligheten av lungekreft skyldes sent stadium ved diagnose og iboende terapeutisk motstand. Innlemmelsen av målrettet terapi har beskjedent bedre kliniske resultater, men identifisering av nye mål ytterligere kan forbedre kliniske resultater ved å lede lagdeling av dårlig risiko tidlig stadium pasienter og individualizing terapeutiske valg. Vi antok at en sekvensiell, kombinert microarray tilnærming ville være verdifullt å identifisere og validere nye mål i lungekreft. Vi profilert genekspresjonssignaturer under lunge epitelcelledifferensiering immortalization og transformasjon, og viste at gener involvert i mitose ble gradvis forbedret i kreftutvikling. 28 gener ble validert ved immunoblotting og 4 gener ble videre undersøkt i ikke-småcellet lungekreft microarray. Selv CDK1 ble sterkt uttrykt i tumorvev, tapet fra cytoplasma uventet spådd dårlig overlevelse og overdro motstand mot kjemoterapi i flere cellelinjer, spesielt mikrotubulidynamikk styrt agenter. En analyse av uttrykk for CDK1 og Cdk1 assosierte gener i NCI60 cellelinje database bekreftet bred sammenslutning av disse genene med kjemoterapeutisk respons. Disse resultatene har implikasjoner for å tilpasse lungekreft terapi og markere potensialet av kombinerte metoder for biomarkører
Citation. Zhang C, Elkahloun AG, Robertson M, Gills JJ, Tsurutani J, Shih JH et al. (2011) Tap av Cytoplasmatiske CDK1 Spår dårlig overlevelse i Human Lung Cancer og overfører kjemoterapeutiske Resistance. PLoS ONE 6 (8): e23849. doi: 10,1371 /journal.pone.0023849
Redaktør: Carlo Gaetano, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Italia
mottatt: Mai 10, 2011; Godkjent: 26 juli 2011; Publisert: 24 august 2011
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av egenutført Research Program fra NIH, National Cancer Institute, Senter for Cancer Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i hele verden, noe lag 1,2 millioner dødsfall årlig og anslagsvis 157,300 dødsfall i USA i 2010 [1]. NSCLC oppstår som oftest hos røykere [2]. I USA er ca 90% av dødsfall av lungekreft hos menn og 79% hos kvinner i forbindelse med røyking [3]. De fleste lungekrefttilfellene er av epitelceller opprinnelse. Derfor er utvikling av lungekreft reflekterer den kumulative effekten av røyking-induserte molekylære forandringer i luftveis epitelceller. Fordi omtrent 90 millioner nåværende eller tidligere røykere i USA har en permanent økt relativ risiko for å utvikle lungekreft, kan identifisering av tidlige molekylære hendelser som ligger til lunge tumorigenesis gi grunnlag for tiltak for å hindre den fenotypiske progresjon som ligger til grunn for kreftutvikling.
Molecular endringer i lungekreft er komplekse og omfatter genetisk, epigenetisk, og biokjemiske forandringer. De første molekylære hendelser som skal identifiseres var genetisk og inkludert inaktivering av tumorsuppressorgener slik som p53 [4], og aktivering av onkogener slik som K-Ras [5]. Epigenetiske hendelser inkluderer stanse av CDK-hemmer, p16, tumor suppressor RASSF1, og andre gener gjennom metylering [6], [7]. Nylig, biokjemiske hendelser som konstitutiv aktivering av signaltransduksjonsveier som fremmer cellulær overlevelse og legemiddelresistens er også blitt rapportert [8], [9], [10]. Til syvende og sist, må disse molekylære endringer kjøre fenotypiske progresjon av epitelceller bestemt for transformasjon. Den eksperimentelle transformasjon av normale epitelceller i tumorigene celler krever to forskjellige trinn. Den første er celle immortalisering, som er nødvendig for å gjøre cellene utsatt for det andre trinnet, transformasjon. Menneskelige celler må omgå to barrierer for å oppnå immortalization, replicative senescence og cellulær krise. Disse barrierer for immortalisering er regulert av telomerer forkortes og av retinoblastom (Rb) og p53 tumor suppressor-trasé [11]. Andre endringer er nødvendig for full transformasjon. Selv om et økende antall molekylære endringer har blitt identifisert i den fenotypiske progresjon av epitelceller transformasjon, andre hendelser er sannsynligvis viktig.
For å identifisere et bredt spekter av molekylære endringer iboende til prosesser av immortalisering og transformasjon av luftveis epitelceller, brukte vi et modellsystem etablert av Reddel
et al.
, som skapte udødeliggjort, ikke-tumorigene bronkiale epitelceller (BEAS-2B) ved å infisere normale menneskelige bronkiale epitelceller (NHBE) med adenovirus-12 SV40 hybrid virus [12]. Forstyrrelse av p53 og Rb trasé med SV40 T-antigen, sammen med økt telomerase uttrykk, udødeliggjort BEAS-2B celler. BEAS-2B-celler ble så gjort fullstendig ved å eksponere tumorigen BEAS-2B-celler in vivo til tobakken spesifikke kreftfremkallende, nitrosamin 4- (methylnitrosamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanon (NNK), i 6 måneder. NNK eksponering indusert fenotypiske endringer i BEAS-2B celler som var lik den progressive endringer som skjer i løpet av human lunge kreftutvikling [13].
I disse studiene, vi systematisk profilert genuttrykk i normal (NHBE), udødeliggjort ( BEAS-2B)) og fullt transformert (NNK-BEAS-2B) humane bronkiale epitelceller, så vel som en ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinje (H157) fra en røyker (figur 1A. Expression profiler som følger med immortalization og /eller transformasjon av bronkial epitelceller ble generert, og uttrykket av 28 gener ble validert av immunoblotting. 4 av dem ble videre undersøkt i immunhistokjemiske analyser av microarray som inneholder NSCLC prøvene, omkringliggende ikke-syke vev og ikke-lunge normalt vev. Selv om alle 4 gener ble hovedsakelig uttrykt i tumorvev, tap av ekspresjon av cytoplasmatisk CDK1 var klinisk viktig fordi det var assosiert med en dårlig prognose for NSCLC. Denne dårlige prognostisk verdi kan være assosiert med terapeutisk motstand, fordi avtagende nivåer av cytoplasmisk CDK1
in vitro
øket motstand mot standard kjemoterapi anvendes ved behandling av NSCLC, særlig mikrotubul midler hvor motstanden var nesten fullført. Disse studiene viser hvordan en kombinert mikromatrisemetoden kan lette identifisering av nye, relevante mål i kreft.
A. Systemet og strategi for å studere genekspresjon profil, sin kliniske betydning og funksjonell rolle under NSCLC kreftutvikling og kjemoterapeutiske motstand. B. Klassifisering av 1,688 regulerte gener blant BEAS-2B (b), NNK-BEAS-2B (NB) og H157 (H) i forhold til NHBE (N). Gener hvis ekspresjon nivå ikke endres mellom cellelinjer ble ekskludert. Forholdene grafisk visualisert ved Cluster og Utforsker programmer (https://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm). Par av baner og gjensidige røde og grønne farger indikerer fargestoff bytte. C. genuttrykk dynamikk i løpet immortalisering og /eller transformasjon. Grafene ble generert av Cluster analyse av genuttrykk Dynamics-programmet (https://www.genomethods.org/caged). A, C, J og H symboler skildre grupper av gener identifisert i figur 1B.
Resultater
Klassifisering av forskjellig uttrykt gener i BEAS-2B, NNK-BEAS-2B og H157 celler sammenlignet med NHBE celler
med NHBE som referanse, ble 1,688 genene forskjellig uttrykt i BEAS-2B, NNK-BEAS-2B og /eller H157 celler. Differensielt uttrykte gener ble klassifisert i bokstavgrupper (A-P) basert på fordelingen av de uttrykk endringer (figur 1B). Genuttrykk profiler ble gruppert basert på fenotypiske egenskaper. NHBE, Beas-2B, NNK-BEAS-2B-celler representert normal, udødeliggjort, og transformert stadier av lunge carcinogenesis, henholdsvis, og H157-celler ble anvendt som et ubeslektet fullt transformert cellelinje avledet fra en pasient NSCLC. Gener i gruppene A (65, 3,9%) eller J (101, 6%) ble oppregulert eller nedregulert, henholdsvis i BEAS-2B, NNK-BEAS-2B og H157-celler, noe som indikerer at disse genene uttrykk endringene var felles for immortalisering og transformasjon av NHBE. Ekspresjon av gener i gruppe B (38, 2,3%) eller I (31, 1,8%) ble økt eller redusert, henholdsvis i BEAS-2B og NNK-BEAS-2B, men ikke H157-celler, noe som antyder at disse endringene resulterte fra SV40- mediert immortalization. Gener i gruppe C (112, 6,6%) eller H (39, 2,3%) ble uttrykt forskjellig i NNK-BEAS-2B og H157 celler, impliserer at disse genene bidrar til full celle transformasjon. Grupper D (407, 24,1%) og G (571, 33,8%) består det største antall gener og var spesifikke for NNK-BEAS-2B celler. Dette tyder på at NNK-mediert transformasjon er et komplekst arrangement som krever endringer i ekspresjon av mange gener. Andre endringer i genekspresjon var spesifikke for en gitt celletype, og ble utelukket fra videre analyse. Den komplette gen liste og tilhørende forholdsdata er gitt i saksdokumenter (tabell S1).
Gene uttrykk profil merknader og biologisk analyse
Blant de klassifikasjoner, gruppene A og J har gener som er avgjørende gjennom tumor utvikling, fra immortalisering til transformasjon, og gruppene C og H inkludere gener som er assosiert med full transformasjon. De kvantitative endringer i genuttrykk er vist (figur 1C). For å analysere genuttrykk endringer av disse gruppene på en genomisk skala og gi kobling til mulige biologiske prosesser, utførte vi Høy Throughtput GoMiner analyse (tabell 1, de relaterte gener ble oppført i tabell S2). I gruppe A, gener involvert i mitose var høyanriket. I gruppe J, ble gener involvert i ectoderm utvikling redusert. Ingen signifikant genet ontologi (GO) kategorier ble registrert for grupper B og I. I gruppene C eller H hvor genuttrykk endringer ble forbundet med transformasjon, gener involvert i mitose regulering ble forbedret, mens gener som negativt regulerer celleproliferasjon og biologiske prosesser ble redusert (tabell 1). Flere GO kategorier ble registrert for grupper D og G som er relatert til endringer knyttet til transformasjon av NNK (tabell S3). Disse resultatene ble utvidet ved å utføre Gene microarray Pathway Profiler analyse som viste at den kumulative effekten av genuttrykk endringer i kreftutvikling vil bli spådd å øke autonom progresjon gjennom cellesyklusen (Figur S1) og unndragelse av apoptose (figur S2).
Validering av uttrykk profiler på proteinnivå av immunblot
for å validere våre microarray data, vi utførte immunoblotting for 28 kandidat gener hentet fra ulike grupper (figur 2). Valget av gener var basert på den kommersielle tilgjengeligheten av antistoffer som tidligere var blitt anvendt i immunoblottingforsøk eksperimenter. Gruppe A eller J representert gener som var over- eller under uttrykt i immortalization og transformasjon, henholdsvis. Sammenlignet med NHBE, BEAS2B, NNK-BEAS-2B og H157 celler hadde økt uttrykk for CDK1, cyclin A, STMN1, PTTG1, og TOP2A (gruppe A), og redusert uttrykk for KRT14, PERP, S100A8, Maspin, TRAIL og p63 (gruppe J). Når man sammenligner mRNA uttrykk for protein uttrykk i gruppene A og J, bare p63 dukket feilklassifisert i at p63 ble kategorisert i gruppe J basert på microarray data, men immunoblotting avslørte at redusert p63 uttrykk ble kun observert i H157 celler (gruppe N). Dette kan være relatert til variabel antistoff-spesifikk reaktivitet mot p63 isoformer og spleisevarianter. Genene i gruppe C eller G, ble klassifisert som transformasjonsspesifikke basert på mikroarray data. Immunoblotting avdekket at mange gener i denne gruppen C ble feilklassifisert. For eksempel, Cyclin B2, Galectin1 og PBK syntes å være overveiende uttrykt i NNK-BEAS-2B celler (gruppe D), mens Cyr61 og hnRNPA2 /B1 var felles for celler som ble udødeliggjort og forvandlet (gruppe A). p21 og KLF4 fra gruppe H var nøyaktig klassifisert, fordi deres mRNA og proteinnivåer ble redusert i NNK-BEAS-2B og H157 transformerte celler. Grupper D eller G representert NNK-spesifikke gener. NNK-BEAS-2B celler unikt oppregulert protein uttrykk for Survivin, DNMT1, HIP1, PLK1, SPARC og ETS1 (gruppe D), og nedregulert protein uttrykk for p15, FKHR og TAO1 (gruppe G). Korrelasjonen mellom mRNA-ekspresjon og protein ekspresjon var høy for disse gruppene. XAGE1, opprinnelig klassifisert som en H157-celle-spesifikt gen (gruppe M), viste størst ekspresjon i H157-celler. Samlet sett immunoblotting avslørte at 22/28 gener (79%) ble korrekt klassifisert fra microarray data, noe som indikerer en høy korrelasjon mellom mRNA og protein uttrykk.
Immunoblotting analyse i NHBE (N), BEAS-2B (B ), NNK-BEAS-2B (NB) og H157 (H) celler for 28 molekyler fra representative grupper, og sammenligning av uttrykket endres med mRNA nivåer fra microarray data.
Immunhistokjemisk farging på lungevev microarray
for å avgjøre om gener som ble identifisert i microarray analyse og videre validert ved hjelp av immunoblotting hadde klinisk betydning, utførte vi immunhistokjemi (IHC) for å vurdere uttrykk i humane NSCLC prøver. Av de 22 korrekt klassifisert gener, ble CDK1, TOP2A, PTTG1 og Survivin valgt basert på kommersielle tilgjengeligheten av antistoffer som hadde blitt validert i IHC. Expression ble vurdert i microarray (TMA) som inneholder 300 NSCLC tilfeller (150 adenokarsinomer (AD) og 150 plateepitelkarsinom (SCC)), 100 tilstøtende ikke-syke lunge vev fra AD og SCC tilfeller, og 50 ikke-lunge normalt vev [14]. Scoring var basert på intensitet, distribusjon, og subcellulære lokalisering. Farging mønstre for CDK1, PTTG1 og Survivin var like i at fargingen var enten overveiende cytoplasma eller begge kjernekraft og cytoplasma. I motsetning til dette, farging for TOP2A var enten utelukkende nukleær eller begge cytoplasma og kjerne (figur 3A). Sammenlignet med tumorceller, farging av omgivende stromale vev var minimal eller fraværende.
A. Eksempler på CDK1, PTTG1, Survivin og TOP2A subcellulære flekker i kliniske kreftprøver (C: cytoplasma farging, N: nukleær farging). Farging er vist 400 × forstørrelse. B. Tissue distribusjon av positive prisene CDK1, PTTG1, Survivin og TOP2A. AD: Adenocarcinoma; SCC: Plateepitelkarsinom; N-AD: Tilstøtende ikke-syke lunge vev fra adenokarsinom; N-SCC: Tilliggende ikke-syke lunge vev fra plateepitelkarsinom; N-O: Ikke-lunge normale organer. C. Oversikt over hele vevet mikromatrise farging for ekspresjon av disse antigenene i cytoplasma eller kjernen.
Alle fire proteiner ble hovedsakelig uttrykt i tumorvev, sammenliknet med de tilstøtende ikke-sykt lungevev (figur 3B ). Dette var spesielt tydelig når atom farging ble vurdert. De fleste NSCLC-prøvene var positive for CDK1, cytoplasmatisk farge (86% for AD og SCC), og 40% av prøvene AD og 36% av SCC prøvene viste nukleær farging. Omkringliggende normale lungevev og andre normale vev uttrykt cytoplasma CDK1, men uttrykte ikke atom CDK1. Farging for TOP2A var generelt mindre utbredt hos NSCLC prøvene enn for de andre proteiner (20-34%), men ble mer jevnt fordelt mellom cytoplasma og nukleær farging. Farging for TOP2A var eksklusivt for NSCLC prøvene vs. omkringliggende normale lungevev. PTTG1 og Survivin viste en høy forekomst av cytoplasma farging (PTTG1- 79% i år og 69% i SCC, Survivin- 73% i år og 61% i SCC), samt nukleær farging (PTTG1- 35% i år og 49 % i SCC, Survivin- 44% i år og 33% i SCC). Samlet, farging for alle fire proteiner var selektiv for NSCLC prøvene vs. omliggende normalt vev, uavhengig av subcellulære lokalisering (Figur 3C).
Vi brukte to-veis clustering å analysere fargemønstre, og χ
2 test for å undersøke avtalen mellom hver antistoff og foreningen av antistoff farging med kliniske faktorer. Svulster som farget for TOP2A var mest tydelig, sammenlignet med CDK1, PTTG1 og Survivin (figur 4A). Den sterkeste foreningen av antistoffarging ble mellom TOP2A nukleær og cytoplasmatisk farge (tabell 2), noe som er konsistent med den observasjon at TOP2A er lokalisert til kjernen og ofte ledsaget av cytoplasmisk farging (figur 3A). I motsetning til TOP2A, flekker for CDK1, PTTG1, og Survivin var overveiende cytoplasma. Cytoplasmisk eller nukleær farging for PTTG1 og Survivin også gruppert meget likt, og dette var i samsvar med den χ
2 tester (tabell 2). CDK1 atom farging ble sterkt assosiert med enten kjernekraft eller cytoplasma TOP2A farging. Totalt er avtalen mellom farging med disse antistoffene var veldig sterk, med unntak av foreningen av cytoplasma CDK1 farging med atom Survivin farging (figur 4A og tabell 2).
A. Den hierarkisk clustering for både antistoffer og svulster ved hjelp Cluster 3.0 og Java Utforsker. B. De positive tallene for CDK1, PTTG1, Survivin og TOP2A i tidlige stadier (1-2) og avanserte stadier (3-4). C. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse for cytoplasma CDK1 fargemønster i NSCLC. Permutasjon test ble brukt til å beregne
p
verdi for alle svulster og svulster av scenen.
Når analysert av scenen, farging for alle fire proteiner var større i scenen 1-2 sykdom (figur 4B). Dette gjaldt spesielt for TOP2A nukleær farging, hvor 56% av scene 1-2 prøver var positive, mens bare 26% av scene 3-4 prøver var positive. Ved farging var forbundet med kliniske variabler, var det ingen forbindelse med alder, kjønn eller differensiering (tabell 2). Cytoplasmatiske TOP2A farging ble sterkt assosiert med mindre svulster ( 5 cm) (
p
= 0,00745), og cytoplasma Survivin farging ble assosiert med stadium I sykdom (stadium 1 stadium 2-3-4,
p
= 0,0436) (tabell 2)
Bare cytoplasma CDK1 farging ble assosiert med overlevelse, selv om det var en trend mot lavere overlevelse med cytoplasmatiske PTTG1 positive pasienter med svulster. 5 cm (
p
= 0,089). Uavhengig av scenen, tap av cytoplasmatisk CDK1 overfører en dårlig prognose (
p
= 0,040) (tabell 2). Siden antallet stadium 2 svulster negativt for cytoplasma CDK1 er for liten og forbudt en meningsfylt sammenligning med positive stadium 2 svulster, og den totale overlevelsen av pasienter i dette datasettet med trinn 1 og trinn 2 pasienter er like, vi kombinert trinn 1 og stadium 2 svulster som tidlig stadium svulster. Når man sammenligner tidlig stadium (1 og 2) og avansert stadium svulster (3 og 4), fant vi at tap av cytoplasma CDK1 var borderline betydning for tidlig stadium svulster (
p
= 0,063), men stor betydning for sent stadium tumorer (
p
= 0,008) (Figur 4C og tabell 2).
tap av cytoplasma CDK1 og kjemoterapi motstand
Det faktum at tap av cytoplasma CDK1 tillagt en dårlig prognose , spesielt for avanserte NSCLC pasienter som er mer sannsynlig å få kjemoterapi eller kjemoradioterapi, foreslo det kan bidra til kjemoterapeutiske motstand. For å teste denne hypotesen, en temperaturfølsom p34CDC2 /CDK1 mutant murine carcinoma FT210 cellelinje ble brukt. Når FT210 celler dyrkes på en ikke-permissive temperatur på 39 ° C fra en permissive temperatur på 32 ° C, blir CDK1 fortrinnsvis inaktivert og degradert fra cytoplasma [15]. Kjemoterapier vanligvis brukes til behandling av NSCLC ble testet i disse cellene ved hver temperatur. Etoposid, en topoisomerase II-inhibitor, eller cisplatin, et DNA-ødeleggende middel, betydelig økt apoptose ved den permissive temperaturen. Ved den ikke-permissive temperaturen, apoptose ble delvis inhibert (figur 5A). Lignende resultater ble observert ved den permissive temperaturen for tre forskjellige mikrotubul-baserte terapier, hvor markert økning i apoptose ble observert (figur 5B). I motsetning til dette, under ikke-permissive betingelser, ble cellene nesten fullstendig resistent mot hverandre mikrotubul-målsøkt agens. Totalt nivåer av CDK1 protein ble redusert ved 39 ° C, som var fosforylering av CDK1 på Y15. Fosfor-Tyr15 CDK1 er en inaktiv cytoplasma form for CDK1 grunn av fosforylering av Myt1. Spalting av PARP ved hver temperatur av paclitaxel var i overensstemmelse med måling av apoptose (figur 5B). Sammenlignet med sin foreldrecellelinje FM3a, FT210 celler fortrinnsvis tapt cytoplasma CDK1 protein uttrykk (figur 5C) og aktivitet angitt med redusert fosforylering av survivin på Thr34, et nettsted for CyclinB-CDK1 kinase [16] (figur 5D). Paclitaxel forårsaket signifikant cytotoksisitet i FM3a og FT210 cellene ved 32 ° C, men bare FM3a celler ved 39 ° C. Tilsvarende ble FM3a celler drept av docetaxel og vinorelbin på enten 32 ° C eller 39 ° C (figur 5E). Dermed tap av CDK1 i FT210 celler økt relativ motstand mot etoposid og cisplatin, men indusert markert motstand mot mikrotubulidynamikk målretting midler.
A. FT210 celler ble serum-starvated i 0,1% FBS RPMI 1640 medium natten over, deretter behandlet med 10 uM etoposid eller cisplatin i 0,1% FBS inneholdende medium i 4 dager ved 32 ° C eller 39 ° C. Apoptose (sub-G1 DNA-innhold) ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri (C: kontroll; T: Behandling). B. FT210 celler ble dyrket i normalt medium og behandlet med 1 pM paclitaxel eller docetaxel og 0,1 uM vinorelbin for 1-4 dager. Den CDK1-proteinet ble påvist på dag 3 ved anvendelse av CDK1 eller p-Y15 CDK1 antistoffer, og apoptotisk død ble overvåket ved PARP-spaltning. Apoptose ble bestemt på dag 4. C. FT210 og dens opphavelige cellelinje FM3a celler ble dyrket i 6 timer og deretter underkastet fraksjonering subcellulære for immunblotanalyse. αTubulin og p53 fungerte som laste kontroller for cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner, henholdsvis. D. FM3a og FT210 celler ble dyrket ved 39 ° C i 72 timer og underkastet subcellulære fraksjonering. Uttrykk av CDK1, p-Survivin (Thr34) og Survivin ble vurdert ved immunoblotting. E. FM3a og FT210 celler ble behandlet med 1 mikrometer paclitaxel eller docetaxel og 0,1 mikrometer vinorelbin. Apoptose ble bestemt på dag 4.
Vi undersøkte videre rolle CDK1 i kjemoterapeutisk motstand ved å modulere nivåer av CDK1 i humane NSCLC-celler. Overekspresjon av CDK1 i H157-celler litt forhøyet basale nivåer av apoptose og forsterkes paclitaxel-indusert apoptose (figur 6A). I motsetning til nedregulering av CDK1 i H157 celler ved hjelp av siRNA dratt motstand mot paclitaxel. Lignende resultater ble observert i en separat NSCLC cellelinje (A549) når CDK1 ekspresjon ble redusert ved bruk av siRNA (figur 6B). Selv knockdown av CDK1 ikke påvirker cellesyklus distribusjon av ubehandlede A549 celler, gjorde det redusere sub-G1 DNA innhold og PARP cleavage når A549 cellene ble utsatt for paclitaxel. Økningen i G2 /M-fraksjon med CDK1 knockdown er forenlig med rollen som CDK1 på G2 til M faseovergang. For å dissekere en rolle for CDK1 i apoptose vs. G2 /M overgang, ble A549 celler transfektert med tom vektor, vill type
CDK1
eller dominant negativ
CDK1 product: (
CDK1DN
) konstruerer, vekst arrestert med serum deprivasjon og et PI3K-inhibitor LY294002, og deretter behandlet med paclitaxel. Nedsatt celleformering ble observert mikroskopisk og bekreftet ved mangel på G2 /M anriking med paklitaxel behandling (figur 6C). Til tross for cellesyklus arrest, overekspresjon av CDK1 fortsatt økte sub-G1 brøkdel som korrelert med tap av G1 befolkningen. Disse effektene ble ikke sett med overekspresjon av CDK1DN, som mangler kinase aktivitet via en dominerende punktmutasjon (D146N) [17].
A. CDK1 protein over eller under uttrykt i H157 celler. Celler ble transfektert med
CDK1
plasmid eller siRNA, 48 timer eller 72 timer senere, ble behandlet med 1 pM paclitaxel i 2 dager. CDK1 proteinnivået ble overvåket ved CDK1 eller p-Y15 CDK1 antistoffer. Sub-G1 DNA-innhold ble bestemt ved flow-cytometri. B. knockdown av CDK1 i A549 celler. Celler ble transfektert med
CDK1
siRNA, 72 timer senere, ble behandlet med 1 pM paclitaxel i 2 dager. Apoptose ble bestemt av PARP spalting ved hjelp av immunoblotting eller sub-G1 DNA-innhold ved hjelp av flowcytometri. CDK1 proteinnivået ble overvåket ved CDK1 eller p-Y15 CDK1 antistoffer. C. Overuttrykte CDK1 eller CDK1DN i A549 celler. Cellene ble transfektert med
CDK1
eller
CDK1DN
plasmider, 48 timer senere, celle sykling stoppet av natten forbehandling av lavt serum (0,1% FBS) medium med PI3K inhibitor LY294002 (10 mm), deretter cellene ble behandlet med 1 pM paclitaxel i lav seruminneholdende medium LY294002 (10 pM, ferskt tilsatt) i 2 dager. Sub-G1 fraksjon og cellesyklusprofil ble bestemt ved flow-cytometri. Over ekspresjon av CDK1 og CDK1DN ble detektert ved CDK1 antistoff.
De ovenfor angitte forsøk viser at CDK1 proteinnivå og aktivitet er forbundet med følsomheten av kreftceller til kjemoterapi. For å bekrefte denne observasjonen, vi søkte på NCI60 menneskelige kreftcellelinje sammensatte følsomhet og molekylære mål databaser og utført Sammenlign [18] analyser. Ekspresjon av CDK1 aktivator CDC25A, p-Y15 /T14 CDK1, total CDK1, så vel som CDK1 bindingspartnere cyclin B og cyklin A var positivt assosiert med sensitivitet overfor paclitaxel, etoposid, og docetaxel. De høyeste Pearson Korrelasjonskoeffisientene (PCC) ble observert med docetaxel og paklitaxel (tabell 3). Selv CDC25A, p-Y15 CDK1 og cyclin A ble beskjedent forbundet med cisplatin, CDK6 og TYMS var toppen korrelater. Dermed CDK1 og dens aktivemaskinkomponenter (figur 7A) ble grovt identifisert som faktorer som ligger til grunn følsomhet for mange agenter som brukes til å behandle kreft hos mennesker, særlig mikrotubulidynamikk styrt agenter.
A. En modell av CDK1 aktivering. Når inaktive p-Y15 /T14 CDK1 er dephosphorylated på Y15 og T14 ved CDC25A, assosierer den med syklin A /B og blir aktive i cytoplasma, deretter raskt translocates inn i kjernen, hvor det fremmer G1 til S og G2 /M overganger. Aktiv CDK1 inaktiveres via sekvensiell fosforylering av Y15 og T14 ved Wee1 og Myt1, og sequestrated av 14-3-3σ i cytoplasma. Denne prosessen gjentas med celle sykling til å drive mobilnettet spredning. B. Et diagram for å illustrere den doble rollen CDK1 som tumorigent driver i lunge kreftutvikling og sensibilisator i kjemoterapeutisk respons.
Diskusjoner
Identifiseringen av klinisk relevant protein mål i kreft er vanskelig. Vi strategisk profilert transkripsjons endringer i modeller av lunge kreftutvikling, validert mål på et proteinnivå, og evaluert uttrykk og subcellulære lokalisering av de beste kandidatene på kliniske mikromatriser vev. Av genene som er identifisert i cDNA mikromatriser og bekreftet av immunoblotting ble CDK1, TOP2A, PTTG1 og Survivin valgt for videre evaluering. CDK1, PTTG1 og Survivin ble sterkt uttrykt i lunge tumorvev. Nuclear CDK1 og TOP2A ble utelukkende uttrykt i tumorvev i forhold til normalt vev, inkludert ikke-lunge normale organer. Det faktum at disse genene ble fortrinnsvis uttrykt i tumorvev, spesielt tidlig stadium NSCLC, tyder på at de kan ha nytte som biomarkører og terapeutiske mål i tidlig stadium NSCLC.
CDK1 er en viktig, nye mål i kreft. CDK1 er en katalytisk subenhet av M-fase-fremmende faktor, som er avgjørende for G1 /S og G2 /M-faseoverganger av den eukaryote cellesyklusen. Den høyeste flekker i NSCLC kliniske prøver og den sterkeste uttrykk i tumorigen NNK-BEAS2B celler tyder på at CDK1 spiller en sentral rolle i tumorigenesis. Faktisk har overekspresjon av CDK1 blitt observert i tidlige stadium lunge adenokarsinomer [19]. Våre data viser at selv om de fleste NSCLC prøvene uttrykt cytoplasma CDK1, tapet overdratt en dårlig prognose, spesielt for avanserte NSCLC pasienter. Tap av cytoplasmisk CDK1 kunne forklares ved tap av totalt protein ekspresjon eller translokasjon til kjernen. Svært få tumorprøver (4 tilfeller) uttrykker atom men ikke cytoplasma CDK1, noe som tyder på at tap av proteiner som 14-3-3σ som binder CDK1 i cytoplasma kan bidra til dette funnet [20] [21], men tap eller reduksjon av 14-3-3σ er svært sjelden i grunnskolen NSCLC prøvene [4]. Våre kjemoterapi eksperimenter viser at å senke de totale nivåer av CDK1 eller cytoplasmatiske nivåer av CDK1 overfører kjemoterapeutisk resistens mot mange agenter som brukes til å behandle lungekreft, spesielt mikrotubulidynamikk styrt agenter.
Data avledet fra NCI 60 menneskelige kreftcellelinje database antyder at status for mange komponenter i CDK1 maskineri potensielt kan spille en rolle i bred følsomhet for kjemoterapi som ikke bare er begrenset til NSCLC-cellelinjer. CDC25 dual-spesifisitet fosfataser er viktige regulatorer av cellesyklusprogresjon gjennom aktivering av CDK av dephosphorylating CDK på treonin 14 og tyrosin 15, to kritiske aminosyreresidier fører til påfølgende sammenslutning av CDK med tilhørende sykliner. Tre homologer finnes hos pattedyr: CDC25A, CDC25B, og CDC25C. CDC25A [22], [23], [24] og CDC25B har onkogene egenskaper og er overexpressed i noen typer svulster [25]. CDC25B og CDC25C er innblandet som regulatorer av mitose men tapet av disse genene i mus eller celler endrer ikke cellesyklus eller sjekkpunkt svar, noe som tyder på en mulig funksjonell kompensasjon av CDC25A [26]. De CDC25A protein skyttel mellom kjernen og cytoplasma [27], [28] og har et omfattende funksjon i regulering G1 /S, S og G2 /M overganger [29]. Dermed CDC25A tid og rom har flere sjanser enn CDC25B /C til tidlig aktivere CDK1. Medfølgende CDK1 defosforylering av CDC25A, Cdk1 forbinder med cyclin A /B og deretter beveger seg raskt inn i kjernen [30]. Cellesyklus må reguleres både i tid og rom [31]. En elektronisk, for tidlig eller vedvarende CDK1 aktivering kan føre til celledød, mitotisk katastrofe eller apoptose-induksjon [32], [33], [34], spesielt når CDK1 aktivering av maskinkomponenter er sterkt uttrykt [35]. Fosforylert CDK1, en inaktiv form hovedsakelig i cytoplasma [31], er et substrat for CDC25A, og sin overflod i cytoplasma forbedrer CDK1 aktivering potensial.
