Abstract
bukspyttkjertelen adenokarsinom (PAC) er en av de vanskeligste svulster å behandle. Mye av denne er knyttet til sen diagnose. For å identifisere biomarkører for tidlig deteksjon, undersøkte vi DNA-metylering forskjeller i leukocytter DNA mellom PAC saker og kontroller i en to-fase studie. I fase I, vi målte metylering nivåer på 1,505 CpG steder i behandlingsnaive leukocytter DNA fra 132 aldri-røyker Pac pasienter og 60 aldri-røyker friske kontroller. Vi fant signifikante forskjeller i 110 CpG nettsteder (falske funnraten 0,05). I fase II, vi testet med og godkjent 88 av 96 fase Jeg valgte CpG steder i 240 Pac tilfeller og 240 matchede kontroller (p≤0.05). Bruke straffet logistisk regresjon, bygde vi en prediksjon modell bestående av fem CpG nettsteder (IL10_P348, LCN2_P86, ZAP70_P220, AIM2_P624, TAL1_P817) som diskriminert PAC pasienter fra kontroller (C-statistikken = 0,85 i fase I, 0,76 i fase II). Interessant, kan en CpG nettsted (LCN2_P86) alene diskriminere resektable pasienter fra kontroller (C-statistikken = 0,78 i fase I, 0,74 i fase II). Vi utførte også metylering kvantitativ egenskap loci (methQTL) analyse og identifisert tre CpG sider (AGXT_P180_F, ALOX12_E85_R, JAK3_P1075_R) hvor metylering nivåene var signifikant assosiert med enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) (falske funnraten 0,05). Våre resultater viser at epigenetisk variasjon i lett oppnåelig leukocytt-DNA, manifestert ved reproduserbare metylering forskjeller, kan brukes til å detektere pac pasienter. De metylering forskjeller på enkelte CpG nettsteder er delvis tilskrives genetisk variasjon. Denne studien støtter sterkt fremtid epigenome omfattende forening studie ved hjelp av leukocytter DNA for biomarkører i menneskelige sykdommer
Citation. Pedersen KS, Bamlet WR, Oberg AL, de Andrade M, Matsumoto ME, Tang H, et al. (2011) Leukocytt DNA Metylering Signatur Skiller bukspyttkjertelkreft pasienter fra friske kontroller. PLoS ONE 6 (3): e18223. doi: 10,1371 /journal.pone.0018223
Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 17 november 2010; Godkjent: 24 februar 2011; Publisert: 24 mars 2011
Copyright: © 2011 Pedersen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Mayo Clinic SPORE i bukspyttkjertelkreft (P50 CA102701) og Institutt for laboratoriemedisin og patologi, Mayo Clinic. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen (PAC) er 10
th vanligste svulsttypen for menn og kvinner i årlig forekomst i USA og den fjerde største årsaken til kreftdødelighet [1]. PAC er forbundet med en svært dårlig prognose som det er fortsatt en av de mest vanskelige å behandle svulster. Mye av dette kan tilskrives den sent stadium hvor kreften er vanligvis oppdages. Mellom 1999 og 2006 ble det bare 8% av pasientene diagnosen, ofte ved tilfeldig funn på radiologisk avbildning, på en lokal scene hvor umiddelbar kirurgisk reseksjon og påfølgende kur kan anses [2]. For tiden er det ingen anbefalte screening tiltak [3]. Med få eller ingen karakteristiske symptomer og ufølsomme metoder for tidlig påvisning er sjelden kurativ behandling.
epigenetikk spiller en viktig rolle i sykdomsutviklingen, fordi det forener atom omprogrammering under utvikling, miljøinduserte endringer på kroppen, og evnen av cellene til å reagere riktig på ytre stimuli [4]. Epigenetiske variasjoner er arvelige endringer i genekspresjon som oppstår i fravær av en forandring i DNA-sekvensen i seg selv. DNA metylering, histoner modifikasjon og mikroRNA regulering kan endre genene «uttrykk profiler. Disse uttrykk endringer fører ofte til de avvikende vekst mønstre av neoplastiske celler [4].
Mange studier peker på funn som en DNA-metylering profilen er fundamentalt endret i humane kreftformer, hvor global tap av DNA metylering og formidler hypermethylation er begge rapportert [5], [6]. For Pac, har tidligere studier identifisert et panel av gener som er abnormt metylert og brakt til taushet i tumorvev, inkludert
ppENK
,
SPARC
,
TFPI2
,
FOXE1
,
NPX2
,
TSLC1
,
p16
,
P14
,
p57
, og
CCND2
[7] – [12]. Disse genene er tungt metylert i bukspyttkjertelen tumorvev og blir sjelden metylert i nonneoplastic bukspyttkjertel vev [13]. En fersk studie rapporterte at uttrykket av 58 gener ble regulert av differensial metylering. I tillegg ble 10 metylering markører assosiert med endret uttrykk av gener kritiske til
gemcitabin
respons [14]. Imidlertid har disse studiene er utført ved hjelp av enten
in vitro
systemer, for eksempel cellelinjer, eller
in vivo
med bukspyttkjertelen juice prøver og primære tumor vev, som er vanskelig å skaffe seg for kreft screening på grunn av invasiv art av disse prøvetakingsprosedyrer [13]. På grunn av risiko, kostnader og problemer med å skaffe pancreatic sekret og vev for tidlig diagnose, en minimal invasiv teknikk som prøvetaking blod er en mer gjennomførbar tilnærming for screening.
Differensial metylering mellom kreftpasienter og friske kontrollpersoner har vært rapportert i perifere blod-DNA, selv om lite er kjent for Pac [15] – [18]. Moore
et al.
[16] rapporterte en sammenslutning av leukocytter DNA hypometylering med blærekreft, uavhengig av røyking og de andre vurderes risikofaktorer. Widschwendter
et al.
[18] undersøkte locus-spesifikk metylering og funnet ut at spesielle DNA metylering mønstre i perifert blod kan tjene som surrogatmarkører for brystkreft. I en fersk liten kreft studie celle lunge, metylering profilering analysen i leukocytter DNA identifisert to CpG områder som i fellesskap diskriminert kreftpasienter fra ikke-kreft kontroller [17]. Resultatene viste at metylering status på leukocytter DNA prøver kan gi en nyttig biomarkør for potensiell tidlig diagnose og differensialdiagnose. Å identifisere metylering markører for kliniske applikasjoner, undersøkte vi metylering profiler i en to-fase case-control studie, som inkluderte kandidat markør oppdagelse og validering, samt bygging av prediksjonsmodeller.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle fag som tilbys skriftlig informert samtykke; og studien ble godkjent av Mayo Clinic IRB.
studiepopulasjonen
Pac indeks tilfellene var voksne pasienter med histologisk bekreftet primært adenokarsinom i bukspyttkjertelen sett på Mayo Clinic i perioden 1. oktober, 2000 og 1. juni 2006. Kvalifiserte Mayo bukspyttkjertelen adenokarsinom saker ble identifisert gjennom en ultra-rask pasientidentifikasjonssystem og rekruttert til en potensiell forskning registret. Studie koordinatorer identifisert potensielle pasienter fra den elektroniske pasientplanleggingssystem og daglige patologi rapporter. Alle kvalifiserte pasienter ble kontaktet enten i klinikken ved sin avtale, eller senere via mail eller telefon hvis klinikken kontakten ikke var mulig. Hvis kontaktes på klinikken, en studiekoordinator innhentet informert samtykke, arrangerte et venepunksjon for 40 ml blod før start av behandling (når det er mulig), og ba deltakeren å fullføre studiet spørreskjemaet. Hvis e-postkontakt var nødvendig (ca. 28% av tilfellene ble kontaktet av post), studieveileder sendt en invitasjon brev til pasientens hjemmeadresse. En oppfølging telefonsamtale ble gjort om prøven eller skjemaer ikke ble mottatt etter en måned. Omtrent 74% av alle kvalifiserte pasienter ble innmeldt i registeret. Fra registret, valgte vi 132 aldri-røyker pasienter i fase I og 240 pasienter i fase II med lik representasjon av kjønn, røykestatus (røyker /nonsmoker) og stadium av Pac (resectable, lokalavansert og metastatisk).
Den sunne kaukasiske kontrollene ble valgt ut fra en Mayo Clinic basert forskning register av primærhelsetjenesten kontrollpasienter som har rutinemessig sjekk-up besøk (generell medisinsk eksamen) mellom 1 mai 2004 og 31. august 2006. kontrollene ble frekvens-matchet til saker på alder (± 5 år), kjønn og stat /region bostedsfordeling av tilfellene. Kontrollene hadde ingen tidligere diagnostisering av kreft (unntatt non-melanom hudkreft) på tidspunktet for registrering. Før sin avtale, ble potensielle kontroller sendt en informasjonsbrosjyre som beskriver studien og et brev med invitasjon. På dagen for avtalen, en studie assistent nærmet emnet, bekreftet kriteriene, og innhentet informert samtykke. Hver deltaker fullførte studiespørreskjemaer (som inkluderte en selvrapporterings av høyde, vekt og diabetes status) og gitt 30 ml av forskning blodprøve. Omtrent 70% av alle nærmet kontroller deltok i denne studien. Fra dette registeret vi valgt 60 aldri røyker kontroller for fase I og 240 kontroller (halvparten er aldri røykere) for fase II.
DNA modifisering av natriumbisulfitt
Vi hentet DNA fra 5 ml helhet blod benytte en Autogen FlexStar (AutoGen, Inc., MA) og modifisert de genomiske DNA-prøver ved hjelp av EZ DNA Metylering kit fra Zymo Research Corporation (Orange, CA) som kombinerte bisulfite konvertering og DNA rensing. Settet er basert på tre-trinns reaksjon som finner sted mellom cytosin og natriumbisulfitt hvor cytosin omdannes til uracil. Vi brukte 1 pg av genomisk DNA fra perifert blod DNA for modifisering i henhold til produsentens anbefaling. Behandlet DNA prøver ble lagret ved -20 ° C og ble analysert i løpet av to uker.
DNA metylering profilering analyse
Illumina (San Diego, California) Golden metylering Beadchip (kreft panel) og Illumina tilpasset VeraCode metylering analyse ble brukt for fase i og fase II, henholdsvis, etter produsentens prosedyre. Vi avbildes matriser ved hjelp av en BeadArray Reader skanner (Illumina, Inc.). Andelen metylert (β-verdi) på hvert CpG stedet ble beregnet ved hjelp BeadStudio programvare (Illumina, Inc.) fratrukket bakgrunn intensitet, som ble beregnet fra negative kontroller, fra hver analysedatapunkt. Den β-verdi som er representert relative forholdet av fluorescerende signaler mellom M (metylerte) allel, og M + U (unmethylated) alleler. Denne verdien varierer kontinuerlig fra 0 (unmethylated) til 1 (fullt denaturert).
Differensial metylering analyse
På grunn av ikke-gaussisk fordeling av CpG metylering verdier, vi brukte Wilcoxon Rank Sum tester for å undersøke forskjeller i median beta verdier mellom saker og kontroller i både fase i og fase II. For å korrigere for flere tester i fase I, har vi brukt q-verdier til å representere den falske funnraten (FDR) [19]. De CPGs med en FDR q-verdi ≤0.05 nivå ble betraktet som signifikant. Disse CPGs var så kandidater for fase II validering, hvor en p-verdi ≤0.05 ble betraktet som signifikant. Bland-Altman plott og Spearman korrelasjonskoeffisient ble brukt for å evaluere avtalen mellom de to metylering analyser i de 40 fagene analysert i både fase I og fase II. De Bland-Altman plott tillate evaluering av analysen uenighet som en funksjon av grad av metylering [20].
methQTL analyse
Ved hjelp plink (https://pngu.mgh.harvard.edu/~ Purcell /plink /) for denne studien, utførte vi en kvantitativ egenskap krets analyse ved å behandle hver CpG β-verdi som fenotypen (kvantitativ egenskap), og de SNP genotyper avledet fra et tidligere genom-wide krets studie (GWAS) som prediktor [21]. FDR ble beregnet basert på P-verdier fra kvantitativ egenskap foreningen Wald test. CpG-SNP par med en FDR ≤0.05 ble ansett som signifikant (dvs. bevis for en SNP – CpG metylering forening). Fordi alder, kjønn, røykestatus og studiefasen kan påvirke metylering nivåer, methQTL analyse justert for disse variablene. Resultater fra denne analysen ble brukt for å evaluere den genetiske effekt på CpG metylering.
Tippemodellbygging
Å utvikle prediksjonsmodeller, vi utnyttet sjansen cross-validert straffet logis regresjonsmodeller som iverksettes enten en L1 straff (Lasso) [22] eller en L2 straff (Ridge) ved hjelp av R-pakke «straffet» [23]. En Lasso modell (eller L1 straff) ble benyttet i fase I tester studien på grunn av sin ønskelig funksjon for modellvalg, som har en minimal effekt på tilhørende CpG koeffisienter mens innstillingen ikke er tilknyttet, CPGs «koeffisientene til null. En Ridge regresjonsmodell (eller L2 straff) som krymper alle koeffisientene til små verdier, men ikke nuller ble også ansett for modellbygging. Den variable Utvelgelsesprosessen styres av en parameter som tvinger alle koeffisienter som skal krympes nær null i begynnelsen, deretter frigjøres gradvis for å redusere mengden av krymping. Den optimale verdien av denne parameteren blir bestemt via kryssvalidering. Mønet modellresultatene ble også sammenlignet med resultatene fra Lasso modell for å finpusse den endelige modellen.
Den endelige modellen identifisert gjennom straffet tilnærminger var så frisk som en generalisert lineær modell (logistisk regresjon) ved hjelp av R-pakke » GLM «, for å beregne arealet under (AUC) mottakeren opererer karakteristikk (ROC) kurve for hver modell. Modellene ble montert i begge testsettet (fase I), og valideringssettet (fase II) separat med AUC rapportert for hver modell. Basert på hver montert modell, ble sannsynligheten for at hver enkelt være en sak (kontroll) beregnet. Dersom sannsynligheten for å være en sak var større enn 0,50 individet ville ha blitt klassifisert som en sak. Følsomheten er definert som den prosent av tilfellene korrekt klassifisert som tilfeller ved hjelp av modellen. Spesifisiteten er prosent av kontroller korrekt klassifisert som kontroller ved hjelp av modellen.
I tillegg til den ujusterte modellen (bare CPGs), ble to mer modeller utstyrt, en som regnes som alder, kjønn og første grad slektshistorie som kovariater og en annen som også anses ABO blodtype ( «O» vs «non-O») som en ekstra kovariat. ABO blodtyper ble utledet for en undergruppe av pasienter som hadde GWAS genotype informasjon [21] tilgjengelig. Fase II-modellene var passe to måter. Først koeffisienter fra fase I ble holdt fast og diskriminering vurdert. For det andre, siden analysen plattformen endret fra fase I til fase II, ble modellene passer slik at koeffisientene til å bli re-estimeres.
Resultater
Identifikasjon av ulikt denaturert CpG områder i fase I
For fase jeg vi undersøkte 132 aldri-røyker pasienter med PAC og 60 aldri-røyker friske kontroller. På grunn av kjemo- eller strålebehandling før blodet ble trukket, ble 13 pasienter ekskludert fra denne analysen. Vi evaluerte metylering status (p-verdier) fra 1,505 CpG nettsteder fra leukocytter DNA i de resterende 119 tilfeller og 60 kontroller (tabell 1). Fordi betydelige metylering forskjeller på X-kromosomet finnes mellom menn og kvinner, analyserte vi CpG steder på autosomer og sex kromosom separat. Disse analysene identifisert betydelige forskjeller mellom PAC-pasienter og kontroller 110 CpG sider i 92 uavhengige gener (FDR ≤ 0,05). 109 av de 110 viktigste CpG steder ble plassert på autosomer. Tabell 2 viser de 10 mest betydningsfulle CpG steder i fase I-studie.
For å evaluere for potensielle kjønnsforskjeller, sammenlignet vi 1421 autosomal CpG områder mellom menn og kvinner. Vi observerte signifikante forskjeller på 71 CpG nettsider ved kombinasjon av saker og kontroller. Når analysert disse CpG steder i saker og kontroller separat, observerte vi forskjeller i 44 CpG nettsteder for PAC-pasienter og 6 CpG områder for kontroller (Tabell S1). For å vurdere mulige metylering endringer i løpet av tumorprogresjon, undersøkte vi de metylering forskjeller mellom tre stadier av Pac innenfor denne pasientgruppen, inkludert 31 resektable, 45 lokalt avansert, og 43 metastatisk tilfeller. Selv om ni CpG nettsider viste en trend i forbindelse med klinisk stadium (p 0,01) (Tabell 3), gjorde dataanalyse ikke avsløre signifikant forskjell mellom de tre stadier (alle CpG områder med FDR 0,05).
Validering av utvalgte CpG steder i fase II
for å validere differensielt denaturert CpG områder identifisert i fase i løpet av et større antall pasienter og et bredere spekter av demografiske kjennetegn, vi utviklet en tilpasset VeraCode metylering analyse (Illumina, Inc.) og undersøkt 96 av de 110 viktigste CpG steder i 240 Pac tilfeller og 240 matchede kontroller. De 96 CpG områder ble valgt i henhold til medianbeta forskjeller mellom saker og kontroller. For CpG nettsteder med lignende median beta forskjeller, ble CPG områder med mindre FDR valgt. Blant de 480 forsøkspersoner, ble 40 fase I fag (20 tilfeller og 20 kontroller) tatt med for å sammenligne graden av enighet mellom de to metylering analyser. Bland Altman plott [20] viste lite, mener skift og konstant variasjon av forskjeller over verdiområdet (figur 1), viser rimelig avtale mellom de to analysene. De to analysene ble signifikant korrelert som forventet blant alle 96 CpG nettsteder. Median Spearman korrelasjonskoeffisient r var 0,94 (område 0,84 til 0,96).
Representant Bland-Altman grafen i ett fag viser god overensstemmelse mellom fase I og fase II-data i de fleste 96 CpG nettsteder. Hver prikk representerer en CpG nettstedet. Bety metylering nivået for hver CpG område (fra 0 til 100%) er vist på x-aksen. Metylering nivåforskjell for hver CpG området mellom fase I og fase II er vist i y-aksen. De stiplede linjene indikerer 95% konfidensintervall for forskjellen mellom de to analysene og den heltrukne linjen angir den gjennomsnittlige forskjellen mellom de to analysene.
Blant de 220 Pac pasienter som var unike for fase II, 47 pasienter hadde blitt behandlet før blodet ble trukket. Vi sammenlignet metylering nivåer mellom de 47 behandlede tilfeller og 173 ikke-behandlede tilfeller for å evaluere effekten av behandlingen på metylering status for disse utvalgte CpG områdene. To CpG steder (TAL1_P817_F og CSF3_E242_R) viste nominelle forskjeller (p = 0,001 og 0,025, respektivt), selv om disse resultatene kan skyldes tilfeldigheter, gitt det store antallet sammenligninger. Samlet vi ikke observere en betydelig behandlingseffekt på metylering av disse utvalgte CpG nettsteder. Tilsvarende ingen effekt skyldtes røyking historie (data ikke vist). Av de resterende 220 kontroller, ble fem ytterligere kontroller ekskludert på grunn av utilstrekkelig kvalitet og etterlot 215 kontroller, som var unike for fase II (tabell 1). Totalt 173 ikke-behandlede tilfeller og 215 kontroller ble analysert i fase II. Den Wilcoxon Rank Sum Test identifisert en signifikant forskjell (p≤0.05) i 88 av de 96 utvalgte CPGs. Viktigere, alle 88 av disse validerte CpG områdene i fase II viste også samme retning av metylering endring som fase I (figur 2). Av disse 23 og 65 CpG nettsider demonstrert hypermethylation og hypometylering i Pac pasienter. Tabell 2 viser de 10 mest betydningsfulle CpG steder i fase II-studien (tabell S2 inneholder statistikk over de 96 CpG områdene i begge faser I og II).
Scatter plott viser reproduserbare metylering forskjeller mellom fase I og fase II . Wilcoxon Rank Sum z-verdier ble plottet på x-aksen (fase I) og y-aksen (fase II). 88 av de 96 CpG steder ble validert ved p-verdi ( 0,05) og retning (hyper /hypo-metylering). Selv om 8 CpG områder som ikke var statistisk signifikant, trender i begge faser er alle like.
Genetisk effekt på DNA metylering
For å undersøke om det var noen genetisk innflytelse på CpG metylering , tilbakegang vi metylering nivå (β verdi) for hver av 96 fase II CpG sider på tilsvar SNP genotyper innen 1 MB målet CpG området. Det var 16,217 genotypet SNPs rundt de 96 CpG områder med en mindre allel frekvens ≥0.1. 135 kontroller og 194 pasienter hadde SNP genotype data. Ved hjelp av en additiv modell og justert for alder og kjønn, identifiserte vi 33 CpG-SNP par (methQTLs) i kontroller og 99 methQTLs i Pac tilfeller med en FDR ≤0.05 (Figur 3 og Tabell S3). Av disse ble 24 methQTLs delt mellom begge tilfeller og kontroller. Disse delte methQTLs involvert tre uavhengige CpG nettsteder. De methQTLs med de sterkeste assosiasjoner for de tre CpG områder var ALOX12_E85_R og rs434473 (FDR = 1,66 × 10
-25 kontroller og 3,01 × 10
-14 hos pasienter), AGXT_P180_F og rs4675872 (FDR = 1,83 × 10
-9 kontroller og 3,73 × 10
-15 hos pasienter), og JAK3_P1075_R og rs7245564 (FDR = 1,89 × 10
-4 kontroller og 3,48 × 10
-4 hos pasienter), (Tabell 4). Avstandene mellom SNPs og målet CPGs var mindre enn 15,5 Kb for alle tre parene som rapporteres her. Vi utførte også methQTL analyse justert for faser av studien og /eller røyking historie i tillegg til alder og kjønn. Disse resultatene var konsistente med de justert for alder og kjønn alene (tabell S3).
metylering nivåer for hver av 96 CpG steder ble tilbakegang på kopi rekke mindre alleler i nærheten (+/- 1 Mb) SNPs . CPG områder ble plassert på x-aksen på grunnlag av deres rekkefølge av kromosomal plassering. Y-aksen var -log10 av methQTL p-verdi etter justering for alder og kjønn. Størrelsen på hver prikk var proporsjonal med betydningen av hver p-verdi. A. kontroll-bare methQTLs og B. case-bare methQTLs.
Bilder
Bygg og validering av prognosemodellen
Å bygge prediksjonsmodeller basert på fase I-data, vi først ekskludert 43 av de 96 CpG nettsteder som viste mindre enn 5% median beta forskjeller mellom saker og kontroller eller p-verdi ≥0.001 (FDR 0,007) i fase I. Disse avgrensninger ble satt for følgende tekniske hensyn. Først CpG områder med mindre metylering forskjellene er utsatt for laboratoriefeil på grunn av tekniske begrensninger. For det andre, CpG områder med mindre signifikante p-verdier er mindre sannsynlig å bli kopiert i en fremtidig studie. Basert på 53 de resterende CpG-områder, vi først bygget modeller ved hjelp av L1 og L2 straffer som beskrevet i fremgangsmåtene ved hjelp av fase I-dataene. Den beste modellen ble valgt basert på kriterier om ROC AUC og parsimoni. Denne modellen ble så testet ved hjelp av fase II data uten de 40 fagene analysert i begge faser for avtalen studien. Når du vurderer alle saker og alle kontroller, identifiserte vi et panel på fem CpG nettsteder (Modell I: IL10_P348, LCN2_P86, ZAP70_P220, AIM2_P624, TAL1_P817) som var de første fem CPGs å gå inn og forbli i Lasso modell og også de fem største koeffisienter fra Ridge modell. Denne fem CpG-only modell viste god diskriminering mellom pasienter og kontroller (c-statistikken = 0,85 i fase I og 0,76 i fase II) basert på logistisk regresjonsmodell. Når spesifisitet ble satt til 0,90, er den maksimale følsomhet var 0,65 i fase I og 0,51 i fase II. Når spesifisitet ble satt til 0,70, er den maksimale følsomhet var 0,83 i fase I og 0,72 i fase II (se tabell S4 for hele spekteret av spesifisitet og følsomhet). Når inkludert kovariater i den logistiske regresjonsmodellen (alder, kjønn, en
st grad av familiehistorie med Pac, ABO blodtype), ble diskriminering forbedret i fase I (c-statistikken = 0,89), men redusert i fase II (c-statistikken = 0,72). Når re-estimere koeffisientene til disse kovariatene i fase II (re-fitting), ble diskriminering forbedret som forventet, men (bare c-statistikk = 0,77 for fem CPGs, 0,77 etter inkludering av kovariater) ikke dramatisk (Tabell 5). Når inkludert resektable pasienter bare og alle kontroller, identifiserte vi en CpG nettsted (Modell II: LCN2_P86) som syntes å diskriminere for resectable sykdom (c-statistikken = 0,78 i fase I og 0,74 i fase II)
diskusjon
i denne to fase (testing-validering) studie, undersøkte vi perifert blod DNA for å finne ut om forskjeller i metylering på ulike CpG områder kan skille mellom fag med og uten Pac. Vi begrenset vår studie til de pasientene som aldri hadde blitt behandlet for kreft (både fase I og II), og i fase I til de som aldri hadde røykt. Vi demonstrerte meget signifikant hypo- eller hypermethylation loci i leukocytt-DNA av pasientene med pac. Dette gjaldt i begge faser av studien og så ut til å være betydelig med justering for røykestatus og kreftbehandling. Viktigere, fant vi at metylering forskjellene var ikke signifikante på tvers av de ulike stadier av sykdommen, men signifikant mellom resektable pasienter og kontroller, noe som tyder på at de differensielt denaturert CpG signaturer kan være nyttig for tidlig diagnose.
Det er verdt å understreke at minst fire (
LCN2
,
IL10
,
PECAM1 Hotell og
MMP14
) av de ti mest betydelig metylert gener i denne studien har tidligere blitt rapportert å ha diagnostisk og /eller prognostisk verdi for pac. For eksempel har studier vist at serum
IL-10
signifikant forhøyet i PAC pasienter [24], [25]. Pasienter som hadde høyere nivåer av
IL-10
viste signifikant lavere overlevelse sammenlignet med pasienter som viste lavere
IL-10
nivåer. Den forhøyet nivå av
IL-10
i serum av Pac pasienter er i tråd med vår nåværende finne at leukocytter DNA hadde lavere arrangøren CpG metylering av genet i pac pasienter enn hos kontrollgruppen (p = 2,50 × 10
-9 for fase i og p 1 x 10
-10 for fase II). Interessant, et annet gen,
LCN2
, er foreslått som en tidlig diagnose biomarkør for Pac [26] – [28]. Et uttrykk basert studie viste at nivåene av fem proteiner, inkludert
LCN2
, diskriminert mellom PAC pasienter og matchet kontroller inntil 13 måneder før kreftdiagnose [26]. I denne studien bruker leukocytter DNA, fant vi at to CpG nettsteder (LCN2_P86_R og LCN_P141_R) i
LCN2
promoter-regionen viste signifikant lavere metylering nivåer i Pac pasienter enn hos kontrollene (p = 2,00 × 10
– 10 og 1,16 × 10
-7 i fase i, p 1 x 10
-10 og 1 x 10
-10 i fase II, henholdsvis). Basert på en fersk tvilling studie, ser det ut til at hypometylering er assosiert med økt
LCN2
uttrykk i leukocytter [29]. Videre rangert vår modell algoritme IL10_P348 og LCN2_P86 som de to øverste CpG nettsider valgt i Modell I og LCN2_P86 som eneste CpG stedet valgt i Modell II. Disse resultatene derfor sterkt støtte at DNA metylering status på leukocytter kan tjene som biomarkører for å bistå i pac diagnose.
Selv sekvens avhengig allel-spesifikk metylering er en unik funksjon i trykt gener i det menneskelige genom, DNA modifikasjon har også blitt observert i ikke-trykt loci. Flere nyere studier har vist at genetiske varianter kan ha en betydelig effekt på DNA metylering på ulike loci [30] – [33]. Ved hjelp av arraybaserte analyser, har to studier identifisert flere genotype-epigenotype interaksjoner ved å vise signifikant sammenheng mellom CpG metylering nivåer og SNP genotyper [30], [33]. Boks et al. analysert leukocytt DNA metylering i tvillinger og friske kontroller, og identifisert et betydelig genetisk påvirkning på metylering av flere CpG nettsteder [30]. Gibbs et al. kartlagt 27,578 CpG områder for samarbeid med 1,63 millioner SNPs i fire typer hjernen vev [33]. For hver vevstype, 4-5% av disse CPGs viste signifikant sammenheng med minst én SNP etter korreksjon for genom-wide multippel testing. Overall, 3,619 unike CpG steder ble rapportert å være methQTLs. Av disse 887 var cis-methQTL. Overraskende, peak berikelse for methQTL var bare 45 bp til CpG aktuelle området [33]. I denne studien, har vi funnet at minst tre (3,13%) av de 96 valgte CpG seter ble signifikant påvirket av cis-virkende SNP’er. Vi fant også at methQTL SNPs var generelt nær målet CpG området ( 15,5 Kb). Disse resultatene viser at CpG metylering nivåer på noen ikke-imprinting loci er også sterkt regulert av nærliggende genetiske varianter. Metylering status i perifert blod DNA kan også tjene som biomarkører for risikovurdering av Pac.
Mens resultatene av denne studien er lovende, er mer arbeid for å finne årsakene til disse metylering forskjeller og om differensial metylering kunne bli ytterligere validert som en screening eller diagnostisk verktøy i en uselektert befolkning. På dette punktet, er det ikke kjent hva som forårsaker metylering forskjellene mellom disse pasienter og kontroller. I tillegg til mulig genetisk effekt som er beskrevet ovenfor, er immunresponsen av lymfocytter til kreftceller en plausibel forklaring. Det er også ukjent om komorbide forhold kan påvirke sensitiviteten til denne testen, og om forstadier til kreft eller benign sykdom, slik som pankreatitt, ville vise lignende metylering mønstre på følgende CpG områdene. Likevel kan disse resultatene har fremtiden klinisk betydning. Først de svært reproduserbare resultater i studien tyder på at metylering forskjeller eksisterer mellom PAC saker og kontroller, som gir støtte i begrunnelsen for å designe metylering-basert test for tidlig diagnose av kreft og til og med risikovurdering. For det andre, utnytte lett tilgjengelige leukocytter DNA, snarere enn bukspyttkjertelen vevs- eller juice-baserte substrat, er mottagelig for storskala epigenetiske epidemiologi applikasjoner som epigenome omfattende forening studien. Tredje, studien identifisert en betydelig rolle om genetikk på DNA metylering ved noen sykdomsrelaterte CpG nettsteder. Det er viktig å skille mellom genetiske og ikke-genetiske effekter på DNA-metylering. Mens endringer i metylering som et resultat av en sykdom, kan være en nyttig markør for tidlig diagnose, kan metylering variasjoner på grunn av genetiske påvirkninger være en mulig markør for risikovurdering på tvers av individer i større populasjoner. Derfor vil karakterisering av en genetisk rolle på DNA metylering lette biomarkører og videre stratify kliniske applikasjoner for disse molekylære signaturer.
I sammendraget har vi bekreftet reproduserbar metylering forskjeller mellom PAC-pasienter og kontroller, og har identifisert et sett av ulikt denaturert CpG nettsteder som ser ut til å være svært indikasjon på tilstedeværelsen av PAH. Hvis ytterligere validert og forbedret i fremtidige studier, kan disse resultatene brukes til en mulig screening diett, enten i høy-risiko befolkning eller i den generelle befolkningen, for å oppdage denne kreften på potensielt kurativ stadier.
Støtte Informasjon
