Abstract
Som enkeltstoffer, ABT-263 og ABT-737 (ABT), molekylære antagonister av BCL-2 familie, bindes fast til bcl-2, Bcl-xL og Bcl-w, men ikke til Mcl-1 og indusere apoptose bare i begrensede celletyper. Forbindelsen 2-deoksyglukose (2DG), i motsetning, delvis blokkerer glykolyse, bremse cellevekst, men sjelden forårsaker celledød. Injiseres i et dyr, akkumuleres 2DG hovedsakelig i tumorer, men ikke skade andre vev. Imidlertid, når celler som var meget motstandsdyktig mot ABT ble forbehandlet med 2DG i 3 timer, ble ABT en potent induser av apoptose, hurtig frigjøring cytokrom c fra mitochondria og aktivering av kaspaser ved submicromolar konsentrasjoner i et Bak /Bax-avhengig måte. Bak er normalt sequestered i komplekser med Mcl-en og BCL-XL. 2DG primtall celler ved å forstyrre Bak-Mcl-en forening, noe som gjør det lettere for ABT å distansere Bak fra BCL-XL, frigjør Bak å indusere apoptose. En meget aktiv glukosetransportør og By, som en agent for det mitokondrielle apoptotiske signal forsterkning sløyfe, er nødvendig for effektiv induksjon av apoptose i dette systemet. Denne kombinasjonen behandling av kreftbærende mus var meget effektiv mot tumor xenograft fra hormonuavhengig høyt metastasized chemo-resistente humane prostatacancerceller, tyder på at kombinasjonsbehandling kan gi et sikkert og effektivt alternativ til genotoxin baserte kreftbehandlingen.
Citation: Yamaguchi R, Janssen E, Perkins G, Ellisman M, Kitada S, Reed JC (2011) effektiv fjerning av kreftceller ved deoxyglucose-ABT-263/737 kombinasjonsbehandling. PLoS ONE 6 (9): e24102. doi: 10,1371 /journal.pone.0024102
Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 16 april 2011; Godkjent: 31 juli 2011; Publisert: 19.09.2011
Copyright: © 2011 Yamaguchi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. EJ mottatt National Institutes of Health (NIH) /National Cancer Institute Grant CA138617, fikk ME NIH gi P41RR004050, og JCR mottatt CA113318, CA055164, og CA081534. Noe av arbeidet er beskrevet her ble utført ved bruk av fasilitetene på Nasjonalt Senter for mikroskopi og Imaging Research ved University of California i San Diego, som støttes av NIH NCRR gjennom stipend nummer P41RR004050 til ME. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
2-deoksy-D-glukose er et glukosemolekyl som har 2-hydroksylgruppen erstattes med hydrogen. 2DG transporteres over plasmamembranen ved en glukosetransportør [1]. En gang i cytosol er 2DG fosforylert av heksokinase II og dets produkt, 2-deoksyglukose 6-fosfat, blir fanget i cytosol og blir en inhibitor av hexokinases, slik som glukose blir glukose-6-fosfat og blir en inhibitor av hexokinases. Imidlertid, som glukose-6-fosfat hydrolyseres ved glukose-6-fosfatase meget hurtig, produserer NADPH og generering av energi, dens motstykke, 2-deoksyglukose 6-fosfat, er en dårligere substrat av glukose-6-fosfatase. Følgelig 2-deoksyglukose 6-fosfat akkumuleres i cytosol, hemmer hexokinases og senking cellulære energinivå. Det er anslått at intracellulær halveringstid av 2-deoksyglukose 6-phsophate er omtrent 50 min i kreftceller [2]. Således 2DG virker som en inhibitor av glykolysen.
langsommere hydrolysehastigheter av 2-deoksyglukose 6-phsophate tillate glukoseopptak som skal bli målt i levende dyr ved
18F-fluor-2-deoksyglukose basert positron Emission Tomography (FDG-PET). Nylige fremskritt innen FDG-PET har tydelig vist mye høyere forekomst av glukosetransportør aktiviteter in vivo, for nesten alle solide svulster sammenlignet med normale, friske vev, bekrefter Warburg Effect [1]. FDG-PET har også blitt en svært følsom måte å oppdage svulster på et veldig tidlig stadium, for eksempel tidlig stadium asymptomatisk bukspyttkjertelkreft. Siden 2DG akkumulerer hovedsakelig hos kreftceller og delvis hemmer mye benyttet glykolyse i disse cellene, er administrasjon av 2DG en sikker og effektiv måte å bremse kreft vekst [1]. Imidlertid er cytostatisk aktivitet 2DG vanligvis kortvarig, som varer bare en uke [3]. Således 2DG har vært forsøkt i kombinasjon med andre kjemoterapeutiske midler, men igjen med blandede resultater. I noen tilfeller kan det redusere effekten av andre behandlinger [4]. En årsak til redusert effekt i slike kombinasjonsterapier kan være at i noen celler, aktiverer 2DG en insulinlignende vekstfaktor-reseptor (IGFR), som kan aktivere PI3K-mTOR-AKT pro-overlevelsesreaksjonsveien [5], [6].
Forskjellige medikamenter som mål Bcl-2 og Mcl-en har blitt testet for sine evner til å indusere apoptose i kreftceller [7]. Den mest fremtredende blant dem er de BCL-2 antagonister ABT-737 og ABT-263 [8], [9]. ABT-737 binder seg spesifikt og med høy affinitet til Bcl-2-familien av proteiner, inkludert Bcl-2, Bcl-xL og Bcl-w, men ikke til Mcl-1. ABT-737 ble modifisert på tre steder for å skape ABT-263 for forbedret oral biotilgjengelighet uten tap av affinitet til Bcl-2-familien av proteiner [9]. Som et enkelt middel, imidlertid, ABT-263/737 (ABT) induserer apoptose bare i begrensede tumortyper, for eksempel lymfomer og noen små celle lungekarsinom [8], [9], [10]. Grunnen til varierende følsomhet for ABT er ikke helt klart.
Apoptose forløper vanligvis ved enten den intrinsiske vei, hvor cytokrom c blir frigjort fra mitokondrier i et Bax /Bak-avhengig måte, aktivere apoptosomes i cytosol, eller den ytre vei, der caspases aktiveres direkte nedstrøms av døds reseptorer (gjennomgått av Salvesen Riedl [11]). Ofte er det krysstale mellom disse to banene. Fordi ABT binder mitokondrielle proteiner, er ABT-indusert apoptose tenkt å skje gjennom indre vei, men vi vet ikke nøyaktig hvordan dette gjøres.
Den kritiske trinn i indre vei av apoptose er når cytokrom c er løslatt fra mitokondrier fordi når cytokrom c er sluppet inn cytosol, det stimulerer dannelsen av apoptosomes, døden bøddel. Av denne grunn er cytokrom c utgivelsen ofte kalt point of no return [12]. Inntil for noen år siden, ble det antatt at kalsiumaktiverte mitokondrier permeabilitet overgangs porer (MPTP) kan være nødvendig for cytokrom c frigjøring under den indre vei av apoptose. Imidlertid ble det vist at tBid-indusert cytokrom c frigjøring og etterfølgende apoptose kunne finne sted i fravær av VDAC [13] og cyklofilin D [14], [15], to vesentlige komponenter i MPTP (oversikt i Yamaguchi Perkins [16]). I stedet er den rådende dogmet at cytokrom c utgivelsen skjer gjennom mitokondrie outermembrane porene (MOMPs). Selv MOMP er et veletablert konsept, forblir dens eksistens hypotetisk fordi i motsetning til kjernefysiske porer eller MPTP, er det ingen EM bilder av MOMPs. Likeledes MOMPs har ikke blitt isolert som en biologisk enhet. Dermed er det ikke kjent om Bak eller Bax bor i MOMPs. Den mest detaljerte analyse av MOMP formasjon under apoptose, kom fra studier lipidvesikler montert med mitokondrielle outermembrane proteiner. I disse studiene, ble tBid-aktivert Bax brukes til å stimulere MOMP montering på vesiklene [17], stimulere frigjøring av proteiner så store som 2000 kDa [18] via porer med en diameter på 25-100 nm [19]. Hvis MOMPs på mitokondriene er omtrent samme størrelse, vil man forvente å se dem ved hjelp av elektronmikroskopi (EM), men de har ikke blitt avbildet. Dermed eksistensen av MOMPs fortsatt hypotetisk. Likevel, fra et mekanistisk syn, eksistensen av MOMPs består helt eller delvis av Bax og Bak er fornuftig.
BH3-bare proteiner som tBid, BIM’ene kalles «aktivatorer» fordi de direkte kontakt med Bax eller Bak, endre deres konformasjon og indusering av oligomerisering, med andre ord «aktivere» dem, fører til cytokrom c frigivelse og apoptose. Nyere funn foreslår imidlertid et annet scenario hvor apoptose finner sted i fravær av aktivator-proteiner. Først Huang og kolleger viste at Bak normalt sequestered av Mcl-en og BCL-XL, og Bak må frigjøres fra både før den kan danne oligomerer [20]. Ideen om at inaktivere noen anti-apoptotiske proteiner uten hjelp fra noen aktivator kan indusere apoptose, er ikke uten kontroverser [21], [22]. Vi favorisere idé fordi Huang og hans kolleger fant at inaktivere både BCL-XL og Mcl-en var nok til å indusere apoptose i Bud og Bim knockout MEFs [23], og Hayashi og kolleger fant det samme i Bud og Bim mangelfull blodplateceller [24 ].
Forutsatt at Bim og bud ikke er involvert i ABT-indusert apoptose, vi kan spekulere grunner for varierte overfølsomhet for ABT-737. Siden ABT-737 binder seg til BCL-XL, inaktivere det, men det binder seg ikke til Mcl-en, hvis det er mindre Mcl-1-proteiner til stede, da effekten av ABT-737 må øke. Faktisk Huang og kolleger fant at ved å tappe Mcl-en fra HeLa celler med siRNA, ble de følsomme for ABT-737 [25]. Mange grupper også rapportert invers korrelasjon mellom kreftcelle følsomhet for ABT-737 og Mcl-1 uttrykk nivåer i mange krefttyper (se Informasjon S1). Men det finnes unntak; HL-60 humane leukemiceller uttrykker promyerlocytic rimelig store mengder av Mcl-1, men de er ikke desto mindre, følsom til ABT-737 [26]. Dermed hvordan ABT-737 induserer apoptose i enkelte kreftceller og ikke i andre, forblir dårlig forstått.
Vi initiert dette prosjektet for å søke etter midler som kan øke effekten av ABT. Når vi samtidig behandlet humane tumorcellelinjer med ABT og narkotika som forstyrrer kreft bestemt cellenes stoffskifte, fant vi at 2DG forbehandling kraftig forbedret effektiviteten av ABT uten å skade friske celler. Vi viser at 2DG-ABT induserer apoptose uten å endre Mcl-1-nivåer i ABT-resistente celler. Når kreftceller resistente mot ABT er forbehandlet med 2DG, protein nivåer av Mcl-en forblir den samme, men Bak-Mcl-en forening er tapt, allergifremkallende celler for ABT-indusert apoptose. Hvor 2DG behandling av kreftceller forstyrrer Bak-Mcl-1 er ikke kjent. Dermed virker kreftcelle følsomhet for ABT som skal bestemmes ikke bare av protein nivåer av Mcl-en, men også av hvor mye Bak er sequestered av sin tilknytning til Mcl-en.
Resultater
2DG-ABT induserer effektivt apoptose av kreftceller
brukes som monoterapi, 30 nM av ABT-737 drepte 90% av RS (4, 11) non-Hodgkins B-celle lymfom celler i 9 timer ( fig. 1a). Imidlertid, en 1-times preinkubasjon av RS (4; 11) cellene med 5 til 10 mM 2DG i medium inneholdende 10 mM glukose effektivisert ABT dramatisk, og dreper 90% av celler med bare 3 nM ABT-737. 2DG alene ikke føre til celledød i løpet av 10-timers inkubasjon. Når vi testet for caspase-aktivering, ble det funnet at så lite som 1 nM av ABT-737 kunne aktivere kaspaser i 3 timer, så lenge cellene ble pre-inkubert med 2DG i 3 timer. Ingen caspaseaktivering utover bakgrunnen ble observert i celler som ble inkubert med 2DG alene. Således kan det konkluderes med at 2DG sensitizes RS (4; 11) cellene til ABT-indusert apoptose. Vi gjentok eksperimentet ved hjelp av ulike konsentrasjoner av ABT-263 og telles celler ved trypan-blått fargestoff å score for døde celler 24 timer etter ABT tillegg (fig. S1 A). Resultatet viste også en synergistisk effekt av 2DG og ABT
a, RS (4; 11). Celler forbehandlet med 20 mM fruktose eller 0-10 mM 2-deoksy-D-glukose i vanlig medium RPMI inneholdende 12 mM glukose, i 1 time før tilsetning av ABT-737 ved indikerte konsentrasjoner. 9 timer senere ble cellene analysert ved hjelp av FACS for Annexin V-positivitet. Khikvadrattest av uavhengighet for to variabler, 2DG og ABT, var P (x ~
1
2 193,35) = 0,000000. Siden kombinasjonen var klart bedre enn forventede verdier, tyder statistikken synergistisk interaksjon mellom 2DG og ABT-737. b, HeLa-celler ble forhåndsbehandlet i 1 time enten med eller uten 10 mM deoksyglukose i DMEM inneholdende 12 mM glukose, før tilsetning av ABT-737. Seks timer senere ble cellene analysert ved hjelp av FACS for Annexin V-farging. c, HeLa-celler ble forbehandlet i 3 timer med 2DG før tilsetningen av ABT-737. Celler ble analysert for caspase-aktivitet på 3 timer etter ABT-737 tilsetningen. d, HeLa, PPC-1 og MCF-7 celler ble behandlet med 10 mM 2DG i 3 timer før tilsetning av 1 mM ABT-263 for inkubering over natten. Trypanblått-negative (levedyktige) ble cellene tellet og fremstilles grafisk (gjennomsnitt ± standard avvik, n = 3). e, reduserer Kombinasjonsbehandling klonogene overlevelse av PPC-1 celler. PPC-1 celler ble behandlet bare en gang i 24 timer med 5 mM 2DG, 1fiM ABT-263, begge, eller ble ubehandlet. 250-1000 celler ble sådd per 30 mm tallerken, og 12 dager senere, overlevende cellekolonier ble farget.
Deretter testet vi om 2DG kunne bevisst ABT-resistente kreftceller til ABT-737 eller ABT -263. Innledende eksperimenter ble utført ved anvendelse av HeLa-livmorhalskreftceller. HeLa-celler ble forhåndsbehandlet i 1 time med 2DG før tilsetningen av ABT-737. Ni timer etter tilsetning av 1 uM av ABT-737, ca. 35% av HeLa-celler som var forbehandlet med 2DG, ble Annexin V-positive (fig. 1b). Denne frekvensen av celledød var sammenlignbart med det man ser etter behandling av HeLa-celler med 1 pM staurosporin (STS), en kjent induser av apoptose i HeLa-celler I et annet sett av eksperimenter, når HeLa-celler ble forbehandlet i 3 timer med 10 mM 2DG i et medium inneholdende 25 mM glukose, ble robust caspaseaktivering observert i løpet av 3 timer ved konsentrasjoner på ABT-737 er så lave som 0,1 mM (fig. 1c). Uten 2DG forbehandling, selv 10 mm ABT-737 ikke kunne aktivere caspases i samme periode. Dette eksperimentet ble også gjentatt ved bruk av ABT-263 og scoret døde celler med trypan-blått fargestoff innlemmelse (fig. S1b). Igjen viste det en synergistisk effekt av ABT-263 og 2DG. ABT-737 og ABT-263 ble sammenlignet side-ved-side ved hjelp av tre-timers 2DG-forbehandling av HeLa-celler. ABT-263 var litt bedre enn ABT-737 i indusere apoptose (Fig. S2A).
Vilkår for 2DG-ABT indusert apoptose
Kinetic og dose-respons studier med HeLa-celler viste følgende : (i) nærværet av glukose i mediet er nødvendig for 2DG-ABT indusert apoptose (fig S2B.), og det optimale molare forhold for apoptose-induksjon med 2DG: glukose er om lag 0,4 til 1,0 (Ii) 2DG bør tilsettes 3 til 4 timer før tilsetningen av ABT (fig S2C og (iii) caspaseaktivering er observert innen 3 timer ABT tillegg. Disse forholdene kan reflektere stabiliteten av ABT-263/737 i oppløsning (ca. 4 timer [9]), så vel som arten av intercellulære signaler som genereres av 2DG; det må ta 3 til 4 timer for 2DG for å generere et signal som er sterkt nok til å være effektive. Under disse betingelser, er reduksjonen av cellulære ATP-konsentrasjonen er meget liten (fig. 5a), hvilket antyder at ATP insuffisiens ikke gir en forklaring på den forbedrede følsomhet til ABT-737 og ABT-263.
Alle etterfølgende eksperimenter ble utført ved hjelp av følgende betingelser: Legg 5-10 mm 2DG til cellekultur. Tre timer senere, legger 1-3 mikrometer ABT. Analyse for caspase aktivitet og cytokrom c utgivelse fra mitokondrier tre timer etter at ABT-behandling. Seks timer etter ABT-behandling, analyse for Annexin V-farging. 24 timer senere, telle levedyktige celler ved hjelp av trypanblått-eksklusjon fargestoff assay. Responsen til den protokoll varierte fra cellelinje til cellelinje. Blant kreftceller som responderte bra var brystkreftcellelinje MCF-7 og hormon motstandsdyktig prostatakreft-cellelinje PPC-1. I begge tilfeller ble mer enn 95% av cellene elimineres i 24 timer ved kombinasjonsbehandling (Fig. 1d). Et enkelt middel anvendelse av 2DG forårsaket noen død (31,3% for HeLa, ingen observert i MCF-7, og 21,5% for PPC-1). Ettersom alle celler har varierte mengder av glykogen som lagres kilde til glukose, satsene for celledød ved 2DG var i stor grad avhengig av tidligere historie av kulturforhold. Dyrkede celler normalt vinne 2DG-indusert vekst-arrest og begynner å vokse i 24-48 timer (data ikke vist). Videre, når 2DG ble injisert i kreftbærende mus, det gjorde ikke føre tumor regresjon, men forsinket tumorvekst av 5-6 dager. Etter denne korte forsinkelse, begynte tumorer til å vokse. Andre grupper hadde gjort lignende observasjoner [4]. Bakgrunnen for ervervet resistens mot 2DG er ikke kjent. Som et enkelt middel, effekten av ABT-263 ble også marginal (13,7% for HeLa, 3,1% for MCF-7 og 36,7% for PPC-1). Virkningene av 2DG-ABT kombinasjon langt overskredet de additive effekter av 2DG og ABT i alle tre cellelinjer (HeLa forventet levedyktige celler 59%, observert 25%, MCF7- forventet levedyktige celler 115%, observert 3,8%, og PPC1 forventet levedyktige celler 49.7 %, observert 3,9%). Den klonogene celleoverlevelse analysen viste også at over 95% av PPC-1-celler ble eliminert ved bare en behandling, mens monoterapi anvendelser av ABT eller 2DG var stort sett ineffektive (fig. 1E). Gitt at p53 er inaktive i noen av de svært følsomme tumorlinjer inkludert PPC-1 [27], [28], [29], konkluderer vi med at kombinasjonen-indusert apoptose er p53-uavhengig. Mulige årsaker til varierte reaksjoner vil bli diskutert senere.
For å forstå nøyaktig hva molekylære arrangementer finner sted når ABT er lagt til 2DG behandlede celler, bestemte vi oss først for å undersøke hva slags apoptose blir indusert av kombinasjonen av 2DG og ABT.
kombinasjons~~POS=TRUNC behandling~~POS=HEADCOMP med 2DG og ABT induserer apoptose gjennom indre vei
det har blitt rapportert at anvendelsen av 10 nM ABT-737 for bare 2 timer gjør at mitokondrie ytre membran til å briste i kronisk lymfatisk leukemi (KLL) celler [30]. Dette er ikke et vanlig fenomen i apoptose. Cytokrom c er vanligvis sluppet gjennom mitokondrie outermembrane porene i ryddig måte [31]. Ødeleggelsen av mitokondrier foregår lenge etter cytokrom c utgivelsen av aktivitetene til fullt aktivert celledød machineries. Når vi undersøkte HeLa celler behandlet med 2DG-ABT kombinasjon hjelp EM, ble ruptur av mitokondrielle ytre membranene ikke påvist (Fig. 2a). I ABT-behandlede celler er imidlertid liten forkorting av mitokondrier ble observert (figur 2b fra 0,717 +/- 0,05 mikrometer for ubehandlet til 0,530 +/- 0,05 mikrometer for ABT bare, 0,553 +/- 0,06 mikrometer for 2DG + ABT, og liten forlengelse av mitokondriene i 2DG-behandlede celler på 0,844 +/- 0,05 mikrometer. Vi spekulerer i at siden BCL-XL og BCL-w er kjent for å være involvert i mitokondriell fusjon /fisjon [32], kan ABT har hemmet deres aktiviteter. Som for forlengelse av mitokondriene i henhold 2DG, det kan ha skapt økt etterspørsel etter mitokondrie respirasjon, og for å møte denne byrden, mitokondrier kan ha blitt lenger. Selv om 2DG og ABT hadde motsatt effekt på lengden av mitokondriene, de begge påvirket physiologies av mitokondrier. Selv om noen spekulerer at mitokondriene fusjon /fisjon maskiner kan også spille en rolle i apoptose, forblir ideen kontroversiell [33].
HeLa celler behandlet med enten 10 mM 2DG i 6 timer, 1fiM ABT-263 for 3 timer, eller 2DG i 3 timer før du legger ABT-263 i ytterligere 3 timer, eller ubehandlet. en, Celler ble fiksert for elektronmikroskopi (se metode). Tre celler fra hver behandlingsgruppe ble undersøkt nøye for lengden på mitokondriene. Vi observerte ikke en enkelt forekomst av ødelagte mitokondrielle outermembranes. b, Fra hver celle, minimum 12 mitokondrier ble tilfeldig valgt for måling. c, Gjennomsnittlig lengder av mitokondrier ble kortere med behandlinger som inneholder ABT-263 (gjennomsnitt +/- std dev). Siden ABT-263/737 binder seg til BCL-2 familiemedlemmer, som er kjent for å være involvert i mitokondriell fusjon /fisjon, kan ABT har endret balansen i mitokondrie fusjon /fisjon til fisjons side (p = 0,0001, 95% konfidensintervall av denne forskjellen. 14,5407 til 37,2513, uparet t-test)
for å finne ut om 2DG-ABT-indusert apoptose er gjennom indre vei, vi brukte villtype (wt) mus embryo fibroblaster (MEFs) og Bax /Bak dobbel knockout (DKO) MEFs. Disse DKO cellene mangler den indre vei. I villtype MEFs forbehandlet med 2DG, ble caspaseaktivering indusert i løpet av 3 timer etter tilsetning ABT (fig. 3a). Imidlertid var det ingen rask caspaseaktivering i Bak /Bax DKO MEFs. Derfor konkluderte vi med at 2DG-ABT-indusert apoptose skjer ved Bak /Bax avhengig indre vei (se også fig. S5a).
a, Wt, og Bax /Bak DKO MEFs ble behandlet med 10 mM 2DG i 3 timer før tilsetningen av 3 uM ABT-263 i 3 timer. 3 timer senere ble cellene høstet for caspase aktivitetsanalyser. (Se også fig. S5a). b, HT1080-celler ble behandlet med eller uten 2DG i 3 timer. Da celler ble behandlet med enten 1 uM STS eller anti-Fas (CD95) antistoffer ved indikerte konsentrasjoner (ug /ml). Cellene ble høstet 3 timer etter, og analysert for caspase-aktivitet. Interessant, synes 2DG å ha forstyrret Fas-indusert apoptose. I gjentatte eksperimenter, observerte vi konsekvent lavere forekomst av caspaseaktivering i 2DG forbehandlede celler, men de grader av hemmende aktivitet varierte fra eksperiment for å eksperimentere. Vi er ikke sikker i sin sak. C, i de første 3 timer, HeLa-celler ble enten behandlet med 10 mM 2DG eller ubehandlet, og deretter behandlet med 10 pM Z-VAD, 1 uM ABT-737, begge eller ingen i ytterligere 3 timer. Cellene ble fiksert og farget for DNA (rød) og cytokrom c (grønn) og undersøkt for tap av cytokrom c flekker, som beskrevet i Metoder. Bar indikerer 100 mikrometer. De representative bilder er vist i fig. S3. Dette diagrammet viser prosentandelen av celler med tap av cytokrom c farging. Kombinasjonen behandling hadde høyere forekomst av celler med utgitt cytokrom c (p = 0,008 ved uparet t-test). d, Celler behandlet som i c var fraksjonert og cytosoliske fraksjoner ble analysert ved western blot.
For å teste om 2DG sensitizes også kreftceller til ytre vei av apoptose, brukte vi HT1080 celler, der det er ingen krysstale mellom de indre og ytre trasé [34]. Forbehandling av celler med HT1080 2DG i 3 timer ikke forbedre Fas-indusert apoptose, men senkes caspaseaktivering (fig. 3b). Dermed 2DG ikke forbedre den ytre vei.
2DG-ABT induserer cytokrom c frigjøring gjennom en caspase avhengig mekanisme
Et kritisk punkt i indre vei er utgivelsen av cytokrom c fra mitokondriene . Når en uM av ABT-737 ble påført på HeLa-celler som hadde blitt forbehandlet med 2DG i 3 timer, observerte vi frigjøring av cytokrom c i over 30% av cellene i løpet av de neste 3 timer, men ikke i ubehandlede celler eller celler behandlet med enten 2DG eller ABT alene (fig. 3c og S3 fig.).
i kanoniske mitokondrier avhengige former for apoptose som staurosporine-, etoposide- eller UV-indusert celledød, frigjøring av cytokrom c fra mitokondriene forekommer oppstrøms av kaspase-aktivering og kan foregå i nærvær av kaspaseinhibitorer [35], [36]. I motsetning til dette i løpet av død-reseptor-fremkalt apoptose, caspaser aktiveres ved disse reseptorene kan også spalte Bud-proteinet, som produserer avkortet Bud (tBid), med tBid deretter induserende Bak /Bax oligomerisering og dannelse av porer ved mitokondrie ytre membraner gjennom hvilke cytokrom c rømming. Dermed vil en pan-caspase inhibitor som z-VAD blokker død reseptor-indusert cytokrom c utgivelse fra mitokondriene. Vi fant ut at 2DG-ABT indusert cytokrom c meldingen ble også blokkert av z-VAD da lagt synkront med ABT (fig 3c . D., Fig S2), men vi viste at 2DG-ABT indusert apoptose er Bax /Bak- avhengig. Dette conundrum kunne forklares ved en Bud-avhengig forsterkning sløyfe hvori en liten mengde av cytokrom c utgitt av ABT kunne aktivere en kaskade av caspaser (slik som kaspaser 9,3,6 og 8) i cytosol, spaltende Bid til å generere tBid med tBid i sin tur aktiverer Bak /Bax og forårsaker ytterligere frigjøring av cytokrom c fra mitokondriene [37], [38].
effekten av Bud uttømming på 2DG-ABT-indusert apoptose
Vi utforsket om hypotesen Bud-basert forsterkning sløyfe spiller en rolle i 2DG-ABT-indusert apoptose. Først fant vi ut om Bud blir spaltet i løpet 2DG-ABT indusert apoptose. I både HeLa og PPC-1-celler, 2DG forbehandling etterfulgt av tilsetning av 1 uM ABT-263/737-indusert cytokrom c frigjøring fra mitochondria i 3 timer. I begge celletyper, ble frigjøring av cytokrom c blokkert av Z-VAD-FMK. Med PPC-en linje, nesten 100% av cellene utgitt cytokrom c, forårsaker nesten 100% apoptose. Med HeLa-celler, den andel av celler som viser cytokrom c frigivelse i løpet av de første tre timer var omtrent 30% (Fig. 3c). Avkortet tBid ble observert i 3 timer etter tilsetningen av ABT i PPC-1 og HeLa-celler (Fig. 4a, data ikke vist). tBid var fraværende i celler behandlet med 2DG alene. Når z-VAD-FMK ble lagt med ABT ble spalting av Bud blokkert.
a, Bud aktiveres under 2DG-ABT indusert apoptose. Western blot av PPC-en cellelysater behandlet med 10 mM 2DG for 0-6 timer (venstre panel), med enten en mikrometer ABT-263 alene eller ABT-263 + 10 mm z-VAD for de siste 3 timene (høyre panel) , undersøkt med anti-tBid antistoff (øvre panel), anti-Opa1 antistoff (midterste paneler), og anti-alfa-tubulins (lavere paneler). Merk: tapet av Opa-en-L ble brukt som en markør for ombygd mitokondrielle cristae under cytokrom c utgivelse fra mitokondriene [34]. b, Effektene av Bud uttømming på 2DG-AB-indusert apoptose. Sett inn: western blot av PPC-1 cellelysater, mock transfekterte (venstre kjørefelt) eller transfektert med Bud siRNA (høyre felt). Bud (+) og Bud (-) PPC-1 celler ble behandlet med enten 2DG, ABT-263 (1 mm), begge deler, 10 mm ABT-263, eller ubehandlet i 24 timer. De levedyktige celler ble talt opp og økningen /reduksjonen over inngangs tallene ble fremstilt grafisk. c, I PPC-1 celler enten forbehandlet med 2DG i 3 timer eller uten forbehandling, deretter 1 um ABT-263 eller 1 mikrometer STS ble lagt inn i tre timer, og cytosoliske fraksjoner ble analysert ved western blot. I parallelle eksperimenter, Bud-utarmet PPC-1 celler ble behandlet med en kombinasjon av 2DG og ABT-263 eller med STS og analysert (utpekt som bud kd, siste 2 baner). Cellene ble høstet 3 time etter ABT /STS behandling, og cytosoliske fraksjoner ble analysert med vestlige blotter.
For å finne ut hvilken effekt, om noen, Bud har på 2DG-ABT-indusert apoptose, vi oppbrukt bud protein av siRNA. 2DG-ABT-indusert apoptose i stor grad ble blokkert i Bud-utarmet PPC-1 celler. Bud uttømming økte prosentandelen av levedyktige celler ved ~8 ganger (p 0,0077, uparet t-test) (figur 4b.). Mengden av frigitt cytokrom c korrelert med apoptotiske priser (Fig. 4C). Dermed er Bud avhengige forsterkning løkke som kreves for effektiv 2DG-ABT indusert apoptose. Bid uttømming hadde en lignende virkning på apoptose indusert ved 10 uM ABT-263, men virkningen var mindre på STS-indusert apoptose (data ikke vist, og figur 4b & Co., c.). Til slutt, Bud KO MEFs vises også redusert følsomhet for 2DG-ABT behandlinger (Fig. S5a). Vi konkluderte med at Bud spiller en betydelig rolle i 2DG-ABT-indusert apoptose.
Søk etter 2DG effektorer
Siden 2DG-ABT kombinasjon-indusert apoptose er Bax /Bak-avhengige, vi undersøkte effekter av 2DG på Bax og Bak i løpet av tre-timers pre-inkubasjon. Noen celler dyrket under hypoksiske forhold eller i glukose-utarmet media for lengre perioder, blir sensibilisert for apoptose [39], [40], [41]. Selv om ingen universell markør som finnes for cellulær følsomhet for apoptose, er kjent for å Bax translocate til mitokondriene før apoptose og nekrose i noen tilfeller [41]. Bax trans synes også å være et distinkt trinn, og ikke nødvendigvis sammenfallende med dens aktivering [42]. Imidlertid, i HeLa-celler behandlet med 2DG alene, Bax trans ble ikke indusert i minst 16 timer (fig. S4A). Således, i motsetning til i celler dyrket i glukose-utarmet medium, Bax trans finner ikke sted under 2DG før inkubasjonsperioden. Videre Bax knockout MEFs reagert på 2DG-ABT-kombinasjonsbehandling (fig. S5a), hvilket antyder at Bax ikke kan spille en kritisk rolle i priming av kreftceller ved 2DG. Of course, i fravær av Bak, Bax allerede være på mitokondriene, spiller rollen Bak, og Bax kan aktiveres av en annen mekanisme når det er på mitokondriene [43].
Fordi 2DG kan påvirke glykosylering kan 2DG-behandling indusere ER stress. Faktisk ekspresjon av ER stress markør, Grp74, ble observert i HeLa-celler behandlet med 2DG i 2 til 4 timer (fig. 5b og S4B fig.). Vi antok at dersom 2DG opptrer gjennom ER stress, kan vi være i stand til å bevisstgjøre HeLa celler for ABT-indusert apoptose av pre-behandle dem med andre ER stress indusere som thapsigargin. Men dette var ikke tilfelle (Fig. S4C). Således synes 2DG for å sensibilisere tumorceller for å BCL-2 antagonister gjennom mekanismer som ikke er avhengig av glukose-uttømming eller ER stress.
a, Virkningen av 2DG på cellulære ATP-nivåer. Mengdene av ATP ble målt i løpet av HeLa cellekultur med 10 mM 2DG i nærvær av 25 mM glukose i DMEM supplert med 10% serum. b, Protein profil ved 2DG inkubasjon av HeLa-celler. Prøver ble tatt fra HeLa-celler behandlet som i et, og forskjellige proteininnholdet av pro- og anti-apoptotiske proteiner ble analysert ved Western blot. I dette eksperimentet, ser vi at en økning i Bcl-xL den første timen. Når vi gjentok eksperimentet to ganger, forble BCL-XL nivåer samme. c, Mcl-1-nivåer forble uendret under 2DG-ABT-indusert apoptose. PPC-1-cellene ble behandlet med 10 mM 2DG i 6 timer, 1 uM ABT-263 i 3 timer, eller 10 mM 2DG i 6 timer, hvorav de siste 3 timer ble inkubert med 1 pM ABT-263. d, Bak og Mcl-en ikke samtidig bunnfall i 2DG behandlede celler. PPC-1 celler ble behandlet som i c. Bak og Mcl-1 ble immunopresipitert ved spesifikke antistoffer konjugert til protein G-Sepharose og ko-utfelte proteiner ble analysert ved hjelp av Western blot. Venstre øvre paneler, Bak co-utfellinger, i øvre høyre paneler, Mcl-1 co-utfellinger og venstre nedre paneler, utfellinger Protein G-Sepharose. Av tekniske grunner kan vi ikke immunpresipitere BCL-xL og analysere innholdet.
2DG forstyrrer Bak-Mcl-en forening, grunning celler for ABT-indusert apoptose
Det har vært
