Abstract
Aerobic glykolyse i kreftceller er regulert av flere effektorer som inkluderer Akt og pyruvat kinase M2 (PKM2). Mucin 1 (MUC1) er en heterodimert glykoprotein som er abnormt overexpressed av menneskelig brystkreft og andre karsinomer. Her viser vi at transformasjon av rottefibroblaster ved den oncogene MUC1-C underenhet er forbundet med Akt-mediert økning i glukoseopptak og laktatproduksjon, i samsvar med stimulering av glykolyse. Resultatene viser også at MUC1-C cytoplasmatiske domene bindes direkte til PKM2 på B- og C-domener. Interaksjon mellom MUC1-C cytoplasmaområde Cys-3 og PKM2 C-domene Cys-474 ble funnet å stimulere PKM2 aktivitet. Omvendt, epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) -mediert fosforylering av MUC1-C cytoplasmatisk domene på Tyr-46 dratt binding til PKM2 Lys-433 og hemmet PKM2 aktivitet. I humane brystcancerceller, ble tie MUC1-C forbundet med en reduksjon i glukoseopptak og laktatproduksjon, noe som bekrefter involvering av MUC1-C i reguleringen av glykolyse. I tillegg ble EGFR-mediert fosforylering av MUC1-C i brystkreftceller assosiert med reduksjon i PKM2 aktivitet. Disse funnene tyder på at MUC1-C subenhet regulerer glykolyse og at dette svaret er gitt delvis av PKM2. Dermed kunne overekspresjon av MUC1-C oncoprotein i ulike menneskelige karsinomer være av betydning for Warburg effekten av aerob glykolyse
Citation. Kosugi M, Ahmad R, Alam M, Uchida Y, Kufe D (2011) MUC1-C oncoprotein Regulerer glykolyse og pyruvatkinasepåviser m2 aktivitet i kreftceller. PLoS ONE 6 (11): e28234. doi: 10,1371 /journal.pone.0028234
Redaktør: Rebecca BERDEAUX, University of Texas Health Science Center i Houston, USA
mottatt: 1 juli 2011; Godkjent: 04.11.2011; Publisert: 28.11.2011
Copyright: © 2011 Kosugi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grants CA97098, CA42802 og CA100707 tildelt av National Cancer Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: DK har eierandeler i genus Oncology og er konsulent for selskapet. Genus Oncology har patentsøknader for celle-gjennomtrengende peptider, for eksempel GO-203, som blokk MUC1-C-funksjon, og selskapet har en relatert peptid under klinisk utvikling. Det er ingen markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreftceller skiller seg fra sine vanlige kolleger av metabolske forskjeller som inkluderer økt utnyttelse av glukose ved aerob glykolyse. Denne karakteristikken av maligne celler, kjent som Warburg virkning, knytter en høy grad av glukoseforbruk med forbedret laktatproduksjon i nærvær av oksygen [1]. Aerobic glykolyse i kreftceller har vært knyttet til økt uttrykk av glykolytiske gener [2], [3]. Pyruvat-kinase (PK) er en av de oppregulert glykolytiske genprodukter som katalyserer fremstillingen av pyruvat og ATP fra fosfoenolpyruvat (PEP) og ADP. Det er fire PK isoenzymer, M1, M2, L og R. Den M1 isoform er uttrykt i de fleste voksne celler. M2 isoform (PKM2), en spleisevariant av M1, er funnet i embryonale celler, visse normale prolifererende celler og kreftceller [4]. Heterogene atom ribonucleoproteins binde til PKM1 mRNA og inhiberer dens skjøting [5]. Konvertering PKM2 uttrykk for PKM1 i kreftceller reverserer Warburg effekt og er forbundet med tap av tumorgenisitet, etablere betydningen av PKM2 for aerob glykolyse og proliferasjon av maligne celler [6]. Den distinkte området av PKM2, sammenlignet med PKM1, funksjoner i allosterisk aktivering av enzymet ved fruktose-1,6-bisfosfat (FBP) [7] og dens inaktivering av fosfotyrosin-proteiner [8], [9]. Under disse forhold regulering av PKM2 aktivitet dikterer metabolismen av glukose til pyruvat, som omdannes ved hjelp av laktatdehydrogenase (LDH) til laktat eller benyttes av den mitokondrielle trikarboksylsyre (TCA) syklus [10]. Disse funnene har derfor støttet behovet for å mer fullt ut forstå de signalene som regulerer aerob glykolyse og PKM2 aktivitet i ondartede celler.
mucin 1 (MUC1) protein er overuttrykt i de fleste menneskelige karsinomer og visse hematologisk kreftsykdom, noe som gjør det en av de mer vanlige forandringer i humane cancere [11]. MUC1 er uttrykt som to subenheter som danner en heterodimer på cellemembranen. Den store MUC1 N-terminal subenhet (MUC1-N) er plassert ekstracellulært og inneholder glykosylert tandem repetisjoner som er karakteristisk for mucin familien. Den MUC1 C-terminal-subenhet (MUC1-C) spenner over cellemembranen og inneholder en 58 aminosyre ekstracellulære domene og en 72 aminosyre cytoplamic domene [11]. Den MUC1-C ekstracellulære domene reagerer med galectin-3 og derved danner komplekser på celleoverflaten med den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) [12]. Aktivering av EGFR er i sin tur forbundet med fosforylering av MUC1-C cytoplasmatiske domene [11]. Betydelig, overekspresjon av MUC1-C-subenhet, og spesielt det cytoplasmatiske domene, er tilstrekkelig for å indusere forankrings-uavhengig vekst og tumorigenisitet [13], [14]. Med overekspresjon av MUC1 i kreftceller, akkumulerer MUC1-C subenheten i cytoplasma og er rettet mot kjernen, hvor det bidrar til regulering av genekspresjon [11]. I denne forbindelse, er MUC1-C-indusert transformasjon assosiert med aktiveringen av gener involvert i proliferasjon og tumorigenesis [15], [16]. MUC1-C induserer også en signatur i forbindelse med lipid metabolisme og oppregulering av gener som regulerer kolesterol og fettsyrer [17]. Andre studier har vist at MUC1-C aktiverer PI3K- Akt pathway [18], [19], som i sin tur stimulerer aktiviteten av glykolytiske enzymer, heksokinase og phosphofructose kinase. Det er imidlertid ingen kjente kobling mellom MUC1-C og glykolysen.
De foreliggende studier viser at MUC1-C er involvert i regulering av glukoseopptak og laktatproduksjon i MUC1-C-indusert transformasjon av rottefibroblaster og i humane brystcancerceller. Resultatene viser også at MUC1-C cytoplasmatiske domene vekselvirker direkte med PKM2 og regulerer PKM2 aktivitet. Den MUC1-C cytoplasmatiske domene inneholder en Cys-rest som binder seg til PKM2 C-domene Cys-474 og stimulerer PKM2 aktivitet. I motsetning til den EGFR-fosforylert MUC1-C cytoplasmatisk domene samvirker med PKM2 C-domene ved Lys-433 og hemmer PKM2. Disse funnene tyder på at overekspresjon av MUC1-C i kreftceller bidrar til regulering av aerob glykolyse.
Resultater
MUC1-C-indusert transformasjon er forbundet med induksjon av aerob glykolyse
MUC1-C-subenhet består av en 58 aminosyre (aa) ekstracellulære domene, et 28 aa transmembrandomene og et 72 aa cytoplasmatisk domene (fig. 1A). Ekspresjon av MUC1-C cytoplasmatisk domene (MUC1-CD) i 3Y1 fibroblaster er assosiert med induksjon av kolonidannelse i myk agar og tumordannelse i nakne mus [13], [14]. I de foreliggende studier, har vi funnet at MUC1-CD-indusert transformasjon av 3Y1-celler er assosiert med en økning i glukoseopptak (fig. 1B) og laktatproduksjon (fig. 1C), i samsvar med stimulering av glykolyse. For å bedømme, i det minste delvis, er utgangspunktet for denne reaksjon, ble studier utført for å bestemme virkningene på PKM2. Spesielt, var det en betydelig økning i PKM2 aktivitet i MUC1-CD transformert 3Y1 fibroblaster (Fig. 1D). 3Y1 /vektor celler uttrykker PKM2, men ikke PKM1, og MUC1-CD-indusert transformasjon hadde tilsynelatende ingen effekt på PKM2 nivåer (Fig. 1E). Andre studier har vist at PKM2 aktivitet hemmes ved fosforylering på Tyr-105 i visse kreftceller [9]. MUC1-CD-indusert transformasjon ble ikke forbundet med en endring i Tyr-105 fosforylering (Fig. 1F). I tillegg var det ingen åpenbar celle omfordeling av PKM2 som bestemt ved konfokal mikroskopi (fig. S1). Tidligere studier har vist at Akt aktivering som bestemt ved fosforylering ved Ser-473 er økt i 3Y1 /MUC1-CD-celler sammenlignet med det som finnes i 3Y1 /vektor-celler [18]. For å vurdere om økningen i p-Akt er ansvarlig for aktivering av PKM2, forstummet vi Akt i 3Y1 /vektor og 3Y1 /MUC1-CD-celler (fig. 1G) og målte glukoseopptak, laktat produksjon og PKM2 aktivitet. Resultatene viser at stanse Akt reduserer glukoseopptak i både 3Y1 /vektor og 3Y1 /MUC1-CD-celler (fig. 1 H, venstre). Videre stanse Akt i 3Y1 /vektor og 3Y1 /MUC1-CD-celler var assosiert med delvis reduksjon i laktat produksjon (Fig. 1 H, høyre). I motsetning til dette hadde tie Akt liten eller ingen virkning på PKM2 aktivitet i 3Y1 /MUC1-cd-celler (fig. 1i), som indikerer at MUC1-CD-mediert induksjon av PKM2 er ikke avhengig av Akt-aktivering.
EN. Oppbygging av MUC1-C underenhet med det ekstracellulære domene (ED), transmembrandomene (TM) og aminosyresekvensen av det cytoplasmatiske domene (MUC1-CD). CQC motivet og EGFR fosforylering nettstedet er uthevet. B og C. 3Y1 /vektor og 3Y1 /MUC1-cd-celler ble analysert for glukose opptak (B) og laktatproduksjon (C). Resultatene (gjennomsnitt ± SD av fem separate eksperimenter som hver utført in triplo) er uttrykt som nmol /10
6 celler. D. Lysates fra rat 3Y1 /vektor og 3Y1 /MUC1-CD celler ble analysert for PKM2 aktivitet. Resultatene (gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter som hver utført in triplo) er uttrykt som relativ PKM2 aktivitet sammenlignet med det som ble oppnådd i 3Y1 /vektor-celler (gitt en verdi av 1). Studentens t-test ble anvendt for å bestemme p-verdiene. E og F. Lysates fra 3Y1 /vektor og 3Y1 /MUC1-CD celler ble immunoblottet med de angitte antistoffer. G-I. 3Y1 /vektor og 3Y1 /MUC1-CD-celler ble transfektert med kontroll siRNA eller Akt siRNA bassenger for 72 timer. Lysater fra de angitte celler ble immunoblottet med anti-Akt og anti-β-aktin (G). De angitte celler ble analysert for glukoseopptak (H, venstre) og laktat produksjon (H, høyre). Resultatene (gjennomsnitt ± SD fra tre replikater) er uttrykt som nmol /10
6 celler. Lysater fra de angitte celler ble også analysert for PKM2 aktivitet (I). Resultatene (gjennomsnitt ± SD fra tre replikater) er uttrykt som relativ PKM2 aktivitet sammenlignet med det som ble oppnådd i 3Y1 /vektor-celler (gitt en verdi av 1).
MUC1-C-cytoplasmatiske domene Cys-3- resten samhandler med PKM2
For å finne ut om MUC1-CD samhandler med PKM2 og dermed påvirker dens aktivitet, ble coimmunoprecipitation studier utført med 3Y1 /MUC1-CD cellelysater. Analyse av anti-PKM2 utfellinger av immunblotting med anti-MUC1-C støttet foreningen av disse proteinene (Fig. 2A). I GST rullegardin eksperimenter, inkubasjon av 3Y1 /vektor cellelysater med GST og GST-MUC1-CD gitt ytterligere støtte til et samspill mellom PKM2 og MUC1-CD (Fig. 2B). For å utvide disse observasjonene til celler som uttrykker endogen MUC1, ble coimmunoprecipitation studier utført på lysatene fra humane ZR-75-1 brystkreftceller. Her PKM2 påvises i komplekser med 25-20 kDa MUC1-C subenheten (Fig. 2C). Trekk ned eksperimenter med ZR-75-1 cellelysater også demonstrert binding av MUC1-CD til PKM2 (Fig. 2D). Studier med MUC1-CD delesjonsmutanter viste videre at foreningen med PKM2 er gitt av MUC1-CD (1-45) og ikke MUC1-CD (46-72) (Fig. 2D). Inkubasjon av GST-MUC1-CD med renset rekombinant His-tagget PKM2 bekreftet direkte binding av MUC1-CD og PKM2 (Fig. 2E). Resultatene viste også at MUC1-CD (1-45) og ikke MUC1-CD (46-72) er ansvarlig for direkte interaksjon (Fig. 2E). MUC1-CD inneholder en CQC motiv (aa 1-3) som bidrar til dannelsen av MUC1-C homodimerer (fig. 1A) [20]. Mutasjon av CQC motiv til AQA (C1A /C3A) blokkerte binding av MUC1-CD til PKM2 (Fig. 2F). Binding av MUC1-CD til PKM2 ble også opphevet med den C3A, og ikke den C1A, mutant, noe som indikerer at Cys-3 er ansvarlig for interaksjon (fig. 2F). Disse funnene tyder på at MUC1-C forbinder med PKM2 i cellene gjennom en direkte interaksjon mediert av MUC1-C cytoplasmaområde Cys-tre rest.
A. Lysater fra 3Y1 /MUC1-cd-celler ble underkastet immunoutfelling med en kontroll IgG eller anti-PKM2. Bunnfallet ble immunoblottet med de angitte antistoffer. B. Lysates fra 3Y1 /vektor celler ble inkubert med GST eller GST-MUC1-CD. De adsorbater til glutation perler ble immunoblottet med anti-PKM2. Input av GST-proteiner ble bestemt ved Coomassie blå farging. C. Lysater fra humane ZR-75-1 brystcancer-celler ble immunopresipitert med en kontroll IgG eller anti-PKM2. Utfellinger ble immunoblottet med de angitte antistoffer. D. ZR-75-1 cellelysatene ble inkubert med GST, GST-MUC1-CD og de angitte GST-MUC1-CD sletting mutanter. De adsorbater ble immunoblottet med anti-PKM2. Input av GST-proteiner ble bestemt ved Coomassie blå farging. E. PKM2 ble inkubert med GST, GST-MUC1-CD og de angitte GST-MUC1-CD sletting mutanter. De adsorbater ble immunoblottet med anti-PKM2. F. PKM2 ble inkubert med GST, GST-MUC1-CD og de indikerte GST-MUC1-CD mutanter hvori Cys-1 og /eller Cys-3 ble erstattet med Ala. De adsorbater ble immunoblottet med anti-PKM2.
MUC1-CD bindes direkte til PKM2 B-domene Cys-165 og C-domenet Cys-474
PKM2 består av en N-terminal (aa 1-43), A1-domene (aa 44-116), B-domene (aa 117-218), A2-domene (aa 219-389) og C-domene (aa 390-531) [7] (fig. 3A). Binding av MUC1-CD påvises med PKM2 (1-218) og PKM2 (390-531), men ikke med PKM2 (219-389) (Fig. 3B). Videre analyse med PKM2 (1-218) delesjonsmutanter viste at MUC1-CD bindes direkte til B-domenet (aa 117-218) og ikke den N-terminale ende (aa 1-43) eller A1-domene (aa 44-116 ) (fig. 3C). Den PKM2 B-domenet inneholder to cysteiner i posisjonene 152 og 165. Mutasjon av PKM2 (117-218) Cys-152 til Ala (C152A) hadde ingen effekt på samspillet med MUC1-CD (Fig. 3D, venstre). I motsetning til binding av MUC1-CD og PKM2 (117-218) ble opphevet ved å mutere Cys-165 til Ala (C165A) (Fig. 3D, til høyre). Med hensyn til den PKM2 C-domenet (aa 390-531), Cys-rester er plassert i posisjonene 423, 424 og 474. Binding av MUC1-CD til PKM2 (390-531) ble ikke påvirket av mutere Cys-423 til Ala ( C423A) (fig. 3E, venstre) eller Cys-424 til Ala (C424A) (fig. 3E, midten). Imidlertid interaksjonen med MUC1-CD ble dempet ved mutasjon av PKM2 (390-531) Cys-rest 474 til Ala (C474A) (Fig. 3E, til høyre). Disse funnene indikerer at MUC1-CD Cys-tre rester bindes direkte til (i) PKM2 B-domene Cys-165, og (ii) PKM2 C-domene Cys-474.
A. Skjematisk fremstilling av PKM2 protein med den N-terminale (N) og den A1-, B-, A2- og C-domener. Uthevet er Cys-165 og Cys-474 rester. B og C. MUC1-CD ble inkubert med GST og de indikerte GST-PKM2 sletting mutanter. De adsorbater ble immunoblottet med anti-MUC1-C. Input av GST-proteiner ble bestemt ved Coomassie blå farging. D. MUC1-CD ble inkubert med GST, GST-PKM2 (117-218) og GST-PKM2 (117-218) med de angitte C152A og C165A mutasjoner. De adsorbater ble immunoblottet med anti-MUC1-C. E. MUC1-CD ble inkubert med GST, GST-PKM2 (390-531) og GST-PKM2 (390-531) med den angitte C423A, C424A og C474A mutasjoner. De adsorbater ble immunoblottet med anti-MUC1-C.
Fosforylert MUC1-CD binder seg til PKM2 C-domene Lys-433
MUC1-C cytoplasmaområde er fosforylert på Tyr -46 av EGFR (fig. 1A) [21]. Andre studier har vist at visse peptider fosfotyrosin interagere med PKM2 C-domenet og inhibere dets aktivitet [8]. For å avgjøre om tyrosin fosforylert MUC1-C cytoplasmaområde binder seg til PKM2, vi først inkubert MUC1-CD og MUC1-CD (Y46F) med EGFR og ATP. Analyse av reaksjonsproduktene ved immunoblotting med anti-P-Tyr bekreftet fosforylering på Tyr-46 (fig. 4A, til venstre). Som finnes med MUC1-CD, inkubering av p-MUC1-CD med PKM2 delesjonsmutanter demonstrert binding til PKM2 (1-218) og PKM2 (390-531) (fig. 4A, til høyre). Binding av p-MUC1-CD var også påvisbar med PKM2 (390-531 /C474A) (Fig. 4B), som støtter en interaksjon som ikke er formidlet av PKM2 Cys-474 rester. For å utvide disse observasjoner, MUC1-CD (C3A) mutant, som er fri for binding til PKM2, ble utsatt for EGFR fosforylering. Sammenligning av MUC1-CD (C3A) og p-MUC1-CD (C3A) bekreftet at EGFR fosforylering induserer binding til PKM2 (390-531) (fig. 4C). Disse resultater ble også bekreftet i eksperimenter hvor bindingen av full-lengde PKM2 var påvisbart med p-MUC1-CD (C3A) og ikke MUC1-CD (C3A) (fig. 4D). Den PKM2 C-domene inneholder en Lys-433 rest som er avgjørende for fosfotyrosin peptid binding [8]. Faktisk mutasjon av PKM2 (390-531) Lys-433 til glutamat (K433E) delvis redusert binding av p-MUC1-CD (fig. 4E). Inkubasjon av ZR-75-1 cellelysater med GST-PKM2 (390-531) og GST-PKM2 (390-531 /K433E) viste videre at binding til endogene MUC1-C er delvis redusert med den K433E mutasjon (Fig. 4F) . Disse funnene viser at fosforylering av MUC1-C cytoplasmatiske domene Tyr-rest 46 overfører binding til PKM2 C-domene ved Lys-433.
A. His-tagget MUC1-CD og MUC1-CD (Y46F) ble inkubert med EGFR i fravær og nærvær av ATP. Reaksjonsproduktene ble analysert ved immunblotting med anti-p-Tyr og anti-MUC1-C (til venstre). GST og de angitte GST-PKM2 delesjonsmutanter ble inkubert med EGFR-fosforylert MUC1-CD (p-MUC1-CD) (til høyre). De adsorbater ble immunoblottet med anti-MUC1-C. Input av GST-proteiner ble bestemt ved Coomassie blå farging. B. GST og GST-PKM2 (390-531 /C474A) ble inkubert med MUC1-CD eller p-MUC1-CD. De adsorbater ble immunoblottet med anti-MUC1-C. C. GST og GST-PKM2 (390-531) ble inkubert med MUC1-CD (C3A) eller EGFR-fosforylert p-MUC1-CD (C3A). De adsorbater ble immunoblottet med anti-MUC1-C. D. PKM2 ble inkubert med GST, GST-MUC1-CD (C3A) og EGFR-fosforylert GST-p-MUC1-CD (C3A). De adsorbater ble immunoblottet med anti-MUC1-C og anti-p-Tyr. E og F. GST, GST-PKM2 (390-531) og GST-PKM2 (390-531 /K433E) ble inkubert med p-MUC1-CD (E) eller ZR-75-1 cellelysat (F). De adsorbater ble immunoblottet med anti-MUC1-C.
Stimulering av PKM2 aktivitet ved MUC1-CD Cys-3
PKM2 er allosterisk aktiveres ved binding av FBP til C-domene [7]. Av mulig funksjonell betydning for samspillet mellom MUC1-CD og PKM2, inkubasjon av MUC1-CD med PKM2 var assosiert med en beskjeden stimulering av PKM2 aktivitet (Fig. 5A, venstre). MUC1-CD-indusert stimulering av PKM2 var avhengig av MUC1-CD Cys-tre motiv i at MUC1-CD (C3A) hadde tilsynelatende ingen effekt på PKM2 aktivitet (Fig. 5A, høyre). Som vist tidligere [7], FBP var effektive i å stimulere PKM2 aktivitet (Fig. 5B). Videre, tilsetningen av både FBP og MUC1-CD førte til minst et additiv økning (fig. 5B), som indikerer at MUC1-CD kan fremme FBP-indusert PKM2 aktivering. For å utvide disse observasjonene, inkuberes vi PKM2 med GO-203, et peptid som inneholder poly-Arg ([R]
9) og MUC1-CD sekvens CQCRRKN inneholder Cys-tre rest som ble vist ovenfor for å binde PKM2 ( fig. 5C). GO-203 var meget effektive i å stimulere PKM2 aktivitet, mens en kontroll peptid, betegnet CP-2, karakterisert ved at Cys-3 Residuet ble erstattet med Ala (AQARRKN) hadde liten virkning (fig. 5C). Videre mutasjon av PKM2 Cys-474, men ikke Cys-165, til Ala resulterte i oppheving av GO-203-indusert økning i PKM2 aktivitet (Fig. 5D). Inkubasjon av PKM2 med både FBP og GO-203 videre vist at GO-203 er additiv med FBP i indusere PKM2 aktivitet (Fig. 5E). Disse funnene tyder på at samspillet mellom de MUC1-CD Cys-tre rester og PKM2 Cys-474 stimulerer PKM2 aktivitet.
A. Rekombinant PKM2 ble inkubert i fravær og nærvær av de angitte konsentrasjoner av MUC1-CD (venstre) eller MUC1-CD (C3A) (til høyre) i 30 minutter ved romtemperatur. Resultatene (gjennomsnitt + SD av fem separate eksperimenter) er uttrykt som relativ PKM2 aktivitet sammenlignet med det som ble oppnådd med kontroll. B. PKM2 ble inkubert med de angitte konsentrasjoner av FBP alene, MUC1-CD alene, eller FBP og MUC1-CD. Resultatene (gjennomsnitt + standardavvik for tre separate eksperimenter) er uttrykt som relativ PKM2 aktivitet sammenlignet med det som ble oppnådd med kontroll. C. aminosyre sekvenser av GO-203 og CP-2 peptider. PKM2 ble inkubert med 100 mikrometer GO-203 eller CP-2. Resultatene (gjennomsnitt + SD av fem separate eksperimenter) er uttrykt som relativ PKM2 aktivitet sammenlignet med det som ble oppnådd med kontroll. D. PKM2 og de angitte PKM2 mutantene ble inkubert i fravær (åpne søyler) og nærvær av 100 pM GO-203 (skraverte stolper). Resultatene (gjennomsnitt + standardavvik for tre separate eksperimenter) er uttrykt som relativ PKM2 aktivitet sammenlignet med det som oppnås i fravær av GO-203. E. PKM2 ble inkubert med de angitte konsentrasjoner av FBP alene, GO-203 alene, eller FBP og GO-203. Resultatene (gjennomsnitt + standardavvik for tre separate eksperimenter) er uttrykt som relativ PKM2 aktivitet sammenlignet med det som ble oppnådd med kontroll.
tyrosin-fosforylert MUC1-CD inhiberer PKM2 aktivitet
binding av tyrosin-fosforylert peptider til PKM2 C-domenet er assosiert med inhibering av PKM2 [8]. Derfor sammenlignet vi effekten av MUC1-CD og EGFR-fosforylert p-MUC1-CD på PKM2 aktivitet. Som vist ovenfor, ble FBP-indusert stimulering av PKM2 økte med MUC1-CD (fig. 6A). Til sammenligning fosforylert p-MUC1-CD var ineffektiv i å øke PKM2 aktivitet (Fig. 6A). Disse studier med p-MUC1-CD er imidlertid komplisert med mulighet for både stimulerende virkninger av Cys-3 og hemmende virkninger av p-Tyr-46. Følgelig eksperimenter ble utført med den MUC1-CD (C3A) mutant, som er ineffektive i å stimulere PKM2. Her MUC1-CD (C3A) hadde ingen åpenbar stimulerende effekt og EGFR-fosforylert MUC1-CD (C3A) trykt PKM2 aktivitet (Fig. 6A). Som en kontroll ble den MUC1-CD (Y46F) mutant som var blitt inkubert med EGFR og ATP hadde liten eller ingen effekt (Fig. 6A). For å bekrefte disse observasjonene, syntetiserte vi peptider tilsvarende styre og EGFR-fosforylert MUC1-CD Tyr-46 (YEKV) motiv (fig. 6B). Fosfo-Tyr-46 peptidet, men ikke den ufosforylerte form, hemmet PKM2 aktivitet (Fig. 6C). Eksperimenter ble også utført med GO-203 alene og i kombinasjon med fosfor-Tyr-46 peptid. Under disse forsøksbetingelser, GO-203-indusert stimulering av PKM2 aktivitet var upåvirket av fosfo-Tyr-46 peptidet (fig. 6D). Disse funnene tyder på at EGFR-mediert fosforylering av MUC1-CD på YEKV motivet hemmer PKM2 aktivitet og at GO-203-indusert stimulering av PKM2 ikke er blokkert av denne mekanismen.
A. PKM2 ble inkubert med 10 pM FBP i fravær (kontroll) og nærvær av 10 pM ufosforylert og EGFR-fosforylert MUC1-CD, MUC1-CD (C3A) og MUC1-CD (Y46F). Resultatene (gjennomsnitt + standardavvik for tre separate eksperimenter) er uttrykt som relativ PKM2 aktivitet sammenlignet med det som ble oppnådd med kontroll. B. sekvensene til Tyr-46 og fosfor-Tyr-46 peptider. C. PKM2 ble inkubert med 10 pM FBP i fravær (kontroll) og nærvær av 100 pM fosfo-Tyr-46 peptid eller Tyr-46 peptid. Resultatene (gjennomsnitt + standardavvik for tre separate eksperimenter) er uttrykt som relativ PKM2 aktivitet sammenlignet med det som ble oppnådd med kontroll. D. PKM2 ble inkubert i fravær (kontroll) og nærvær av 20 mM GO-203 alene, 100 mikrometer fosfor-Tyr-46 peptid alene eller GO-203 med fosfor-Tyr-46 peptid. Resultatene (gjennomsnitt + standardavvik for tre separate eksperimenter) er uttrykt som relativ PKM2 aktivitet sammenlignet med det som ble oppnådd med kontroll.
MUC1-C fremmer aerob glykolyse i brystkreftceller
for å finne ut om endogen MUC1-C påvirker glykolyse, studerte vi ZR-75-1 og MCF-7 brystkreftceller med stabil stanse av MUC1-C uttrykk (fig. 7A). Nedregulering av MUC1-C hadde ingen effekt på PKM2 nivåer eller fosforylering på Tyr-105 (fig. 7A). Betydelig, analyse av begge ZR-75-1 og MCF-7-celler viste at forbindes tie MUC1-C med nedsatt glukoseopptak (fig. 7B) og redusert laktatproduksjon (fig. 7C), som indikerer at MUC1-C fremmer glykolyse i brystkreft celler. I tillegg til undertrykkelse av glykolyse, tie MUC1-C dratt reduksjoner i ZR-75-1 og MCF-7 kolonidannelse (Fig. 7D).
A. Lysater fra ZR-75-1 og MCF-7-celler som stabilt uttrykker en tom vektor eller en MUC1siRNA ble immunoblottet med de angitte antistoffer. B. De angitte celler ble analysert for glukose-opptak. Resultatene (gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter som hver utført in triplo) er uttrykt som nmol /10
6 celler. C. De angitte celler ble analysert for laktatproduksjon. Resultatene (gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter som hver utført in triplo) er uttrykt som relativ laktatproduksjon sammenlignet med den i celler som uttrykker den tomme vektoren (gitt en verdi av 1). D. De angitte celler ble platet i bløt agar og kolonier ble tellet etter inkubering i 14 dager. Resultatene (gjennomsnitt ± SD av to separate forsøk hver utført i triplikat) er uttrykt som kolonien tall i forhold til det som oppnås med ZR-75-1 eller MCF-7-celler som uttrykker en tom vektor (som hver er tilordnet verdien 1).
Effekter av MUC1-C på PKM2 aktivitet i brystkreftceller
Studiene ble utført for å bestemme hvorvidt effekten av MUC1-C på aerob glykolyse i brystkreftceller er knyttet til endringer i PKM2 aktivitet. Ved 24 timer etter passering av ZR-75-1-celler, ble PKM2 aktivitet redusert med nedregulering av MUC1-C-ekspresjon (Fig. 8A, venstre). I motsetning til dette, ved 72 timer av kulturen, ble tie MUC1-C forbundet med en økning i PKM2 aktivitet (Fig. 8A, venstre). Disse observasjonene stemmer overens med en økning i omfanget av MUC1-C tyrosinfosforylering fra 24 til 72 timer i kultur (fig. 8A, til høyre). Lignende resultater ble oppnådd med MCF-7-celler (Fig. 8B, venstre og høyre), som indikerer at den MUC1-C tyrosinfosforylering status bidrar til regulering av PKM2. I dette resonnementet, ble studier utført for å vurdere effekten av EGF stimulering. Behandling av MCF-7 /vektor-celler med EGF var assosiert med en økning i fosforylering av MUC1-C på tyrosin (fig. 8C, venstre). Videre EGF stimulering av MCF-7 /vektor, men ikke MCF-7 /MUC1siRNA,-celler resulterte i nedregulering av PKM2 aktivitet (Fig. 8C, til høyre). Disse funnene tyder på at tyrosin fosforylert MUC1-C undertrykker PKM2 aktivitet i brystkreftceller og at denne effekten er mer uttalt i respons på EGF stimulering.
A og B. Lysates fra den indikerte ZR-75-1 ( A) og MCF-7 (B) celler høstet ved de indikerte tidspunkter etter passasje ble analysert for PKM2 aktivitet (til venstre). Resultatene (gjennomsnitt + standardavvik for tre separate eksperimenter som hver utført in triplo) er uttrykt som relativ PKM2 aktivitet sammenlignet med det som ble oppnådd i celler som uttrykker den tomme vektoren (gitt en verdi av 1). ZR-75-1 /vektor (A) og MCF-7 /vektor (b) cellelysater ble også inkubert med anti-MUC1-C og bunnfallet ble immunoblottet med de angitte antistoffer (til høyre). C. MCF-7 /vektor og MCF-7 /MUC1siRNA celler forble ubehandlet og stimulert med EGF i 5 minutter. Lysater fra MCF-7 /vektor-celler ble inkubert med anti-MUC1-C og bunnfallet ble immunoblottet med de angitte antistoffer (til venstre). Lysatene ble analysert for PKM2 aktivitet (høyre). Resultatene (gjennomsnitt + standardavvik for tre separate eksperimenter) er uttrykt som relativ PKM2 aktivitet sammenlignet med den i ikke-stimulerte MCF-7 /vektor-celler.
Virkninger av å uttrykke et MUC1 (C3A) mutant videre PKM2 aktivitet
for å finne ut om effekten av å kneble MUC1-C kunne tilskrives samspillet mellom MUC1-C cytoplasmaområde og PKM2, ble studier utført med HCT116-celler, som er null for MUC1 uttrykk og var stabilt transfektert for å uttrykke en tom vektor, vill-type MUC1 eller MUC1 med C3A mutasjon (fig. 9A). MUC1 og MUC1 (C3A) ekspresjon hadde ingen effekt på PKM2 eller p-PKM2 (Tyr-105) nivåer (Fig. 9A). Glukoseopptak ble økt i HCT116 /MUC1, men ikke HCT116 /MUC1 (C3A), celler (Fig. 9B). Lignende resultater ble oppnådd ved måling av laktatproduksjon (fig. 9C). MUC1, men ikke MUC1 (C3A), uttrykk var også assosiert med økt PKM2 aktivitet (Fig. 9D). Dessuten, som vist tidligere [20], MUC1 ekspresjon var forbundet med økninger i HCT116 kolonidannelse, og denne effekten ble opphevet ved den MUC1 (C3A) mutant (fig. 9E). Disse funnene tyder på at blokkering av interaksjonen mellom MUC1-CD og PKM2 demper de MUC1-CD-medierte effekter på glykolyse, PKM2 aktivitet og kolonidannelse.
A. Lysater fra HCT116-celler som stabilt uttrykker en tom vektor, ble vill-type MUC1 eller MUC1 (C3A) immunoblottet med de angitte antistoffer. B. De angitte celler ble analysert for glukose-opptak. Resultatene (gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter som hver utført in triplo) er uttrykt som nmol /106 celler. C. De angitte celler ble analysert for laktatproduksjon. Resultatene (gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter som hver utført in triplo) er uttrykt som relativ laktatproduksjon sammenlignet med den i celler som uttrykker den tomme vektoren (gitt en verdi av 1). D. Lysater fra de angitte celler ble analysert for PKM2 aktivitet. Resultatene (gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter som hver utført in triplo) er uttrykt som relativ PKM2 aktivitet sammenlignet med det som ble oppnådd i celler som uttrykker den tomme vektoren (gitt en verdi av 1). E. De angitte celler ble platet i bløt agar og kolonier ble tellet etter inkubering i 14 dager. Resultatene (gjennomsnitt ± SD av to separate forsøk hver utført i triplikat) er uttrykt som kolonien tall i forhold til det som oppnås med HCT116 /vektor-celler (gitt en verdi av 1).
diskusjon
MUC1-C oncoprotein fremmer glykolyse
de fleste kreftceller er avhengig av aerob glykolyse for generering av energi som er nødvendig for cellulære prosesser. Denne endrede metabolisme, kjent som Warburg effekt, medfører økt opptak av glukose med redusert utnyttelse av TCA-syklus, slik at pyruvat som utvikles under glykolyse omdannes til laktat [22].
