Abstract
Behandling av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) med legemidler rettet mot epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), f.eks gefitinib og erlotinib, vil til slutt mislykkes på grunn av utviklingen av sekundære mutasjoner som T790M i EGFR. Strategier for å overvinne denne motstanden er derfor et presserende behov. I denne studien ble syntetisert vi et dusin av nye analoger gefitinib og evaluert deres virkninger på L858R /T790M-EGFR husing NSCLC-celler, og rapporterte at en av disse gefitinib mimetika, N- (2-brom-5- (trifluormetyl) fenyl) – 6-metoksy-7- (3- (piperidin-1-yl) propoksy) kinazolin-4-amin (heretter, V1801), utløst apoptose av NSCLC-celler og overvant gefitinib-resistens hos mus inokulert med NCI-H1975-celler. Selv om V1801 bare moderat hemmende EGFR-kinase-aktivitet, er det markert indusert ekspresjon av BH3-eneste protein Noxa, og Noxa tie betydelig redusert V1801-indusert apoptose av NCI-H1975-celler. Det er vist at V1801 forstyrret ekspresjonen av transkripsjonsfaktoren c-Myc, og det ekstracellulære signal reguleres kinase (Erk) pathway. V1801 i kombinasjon med proteasominhibitor bortezomib utøves forbedret cytotoksisitet i NCI-H1975-celler som mulig på grunn av poten induksjon av Noxa uttrykk. Disse data indikerer at gefinitib analoger med svak EGFR-inhiberende aktivitet kan overvinne legemiddelresistens via aktivering av BH-3 bare pro-apoptotiske proteiner, og V1801 kan ha terapeutiske potensialer for NSCLC
relasjon:. Zhang B, Jiao J Liu Y, Guo LX, Zhou B, Li GQ, et al. (2012) Gefitinib Analog V1801 induserer apoptose av T790M EGFR-husing Lung kreftceller ved oppregulering av BH-3 Bare Protein Noxa. PLoS ONE 7 (11): e48748. doi: 10,1371 /journal.pone.0048748
Redaktør: Giuseppe Viglietto, Universitetet Magna Graecia, Italia
mottatt: 27 februar 2012; Godkjent: 01.10.2012; Publisert: 21.11.2012
Copyright: © 2012 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Key Program for Basic forskning (2012CB910800, 2010CB833200, 2010CB529201), National Natural Science Foundation (No. 81071930, 81171925, 20972160 og 21172220), Spesial Foundation av presidenten og Key Prosjekt of Knowledge Innovation Program for Chinese Academy of Sciences (KSCX1-YW-R-26 og KSCX2-YW-R-235), og National store vitenskapelige og tekniske Program for Drug Discovery (2009ZX09103-101). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de hyppigste svulst i verden, bestående av 17% av den totale nye krefttilfeller og 23% av de totale kreftdødsfall hos menn [1]. Behandling av lungekreft bestemmes av histologisk type og stadium ved diagnose, og omfatter hovedsakelig kirurgi, platina dublett terapi, stråleterapi og målrettet terapi, med en bare 15% av fem års total overlevelse for alle faser kombineres [2]. Epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) for målretting for midler som omfatter EGFR-spesifikke antistoffer og tyrosinkinaseinhibitorer (TKI) for eksempel gefitinib og erlotinib, benytte en andel av pasienter, spesielt de som aldri-røk og av asiatisk opprinnelse [3] – [5] . Imidlertid vil behandling med gefitinib og erlotinib til slutt svikte på grunn av utviklingen av ervervet resistens som følge av forsterkningen av MET proto-onkogen eller treonin-til-metionin aminosyresubstitusjon i posisjon 790 (T790M) av EGFR, som detekteres i 50% av klinisk resistente pasienter [6], [7]. Den T790M mutasjon i EGFR påvirker gatekeeper resten i det katalytiske domenet av den kinase som svekker interaksjonen av inhibitorene med målet [6]. Nyere studier viser at T790M mutasjon er en «generisk» motstand mutasjon som vil redusere styrken av en hvilken som helst ATP-konkurrerende kinase inhibitor [8]. I T790M EGFR-husing celler, er hemming av EGFR av tiden tilgjengelig andregenerasjons EGFR-TKI ikke tilstrekkelig til fysiologisk hindre fremveksten av celler som er fortsatt avhengig av EGFR signaliserer [9]. Derfor, strategier for å overvinne EGFR TKI motstand forbli praktiske behov for å kunne forlenge overlevelsestiden for pasienter med lungekreft.
Evading apoptose er et av kjennetegnene til kreft, og rettet mot apoptose er blitt en kreft terapeutisk strategi [10 ]. De kritiske apoptose regulatorer, B-celle CLL /lymfom-2 (BCL-2) og dens familie proteiner, kan deles inn i pro- og anti-apoptotiske medlemmer, og de pro-apoptotiske proteiner kan deles inn i proapoptotiske proteiner og BH3-bare underfamilier, basert på deres strukturelle likhet mellom forskjellige Bcl-2-homologi (BH) domener [11], [12]. Noxa er et BH3-eneste protein som er involvert i apoptose i forbindelse med DNA-skade, hypoksi eller eksponering for proteasomhemmere [13] – [15]. Uttrykk av Noxa i Hela celler fremmer sterkt celle apoptose, samtidig som blokkerer den endogene Noxa undertrykker programmert celledød [16]. Opphopning av Noxa sensitizes apoptose ved å binde seg til og nøytralisere antiapoptotic protein Mcl-en, som fører til utslipp og påfølgende aktivering av Bax (BCL2-assosiert X protein) eller BAK (BCL2-antagonist /morder) fra Bax /Bak-Mcl-en kompleks [13], [17], [18]. I tillegg til sin rolle i apoptose, Noxa også regulerer diverse cellulære funksjoner i autophagic celledød og metabolisme [19], [20]. Apoptose-assosiert Noxa aktivering oppnås først og fremst gjennom transkripsjonen oppregulering av p53, E2F1, HIF1α, c-myc, ATF3, og ekstracellulære signalregulert kinase (Erk) pathway [14] – [16], [21] – [23]. Men identiteten til de kritiske BH3-bare proteiner og mekanismen for sine handlinger etter behandling av ulike apoptotiske stimuli gjenstår å bli løst.
For å screene for agentene å overvinne gefitinib-motstand, vi her syntetisert en antall nye gefitinib strukturelle analoger og testet sine hemmende effekt på EGFR kinase aktivitet og spredning av NCI-H1975 celler [24] som havn L858R /T790M-EGFR [6], [7], [25] og villtype MET uten genomisk forsterkning [26] som er resistente mot gefitinib og erlotinib. Vi har funnet en gefitinib mimetisk, N- (2-brom-5- (trifluormetyl) fenyl) -6-metoksy-7- (3- (piperidin-1-yl) propoksy) kinazolin-4-amin (heretter, V1801), moderat inhiberte EGFR-kinase-aktivitet, men i betydelig grad undertrykkes celleproliferasjon og apoptose i T790M EGFR-husing ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler in vitro og in vivo. Vi viste videre at oppregulering av Noxa underlain V1801 aktivitet på NSCLC celler.
Materialer og metoder
Agenter
De gefitinib analoger (tabell 1) ble syntetisert av vår kjemi gruppe, og de
N
– (3-klor-4-fluor-fenyl) -7-metoksy-6- (3-morfolin-4-ylpropoxy) kinazolin-4-amin (gefitinib) ble kjøpt fra J K Chemical Ltd. Alle forbindelsene ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) for å gjøre lager-konsentrasjon på 10 mM og holdt ved -20 ° C. 3- (4,5-dimethylthiahiazozy1) -3,5-di-phenytetrazoliumromide (MTT) ble innkjøpt fra Sigma. Bortezomib ble oppnådd fra Millennium Pharmaceuticals Inc. Annexin V /propidiumjodid (PI) Apoptose Detection kit ble hentet fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA).
Antistoffer
antistoffene anvendt i dette studiet var som følger: anti-β-Actin (Sigma); anti-Casp-9 (C9), anti-Casp-8 (1C12), anti-Casp-3 (3G2), anti-PARP, anti-fosfo-P44 /42 MAPK, anti-EGFR (L858R), anti-STAT3 , anti-fosfor-STAT3 (Cell signalering); anti-c-myc, anti-Noxa, anti-fosfor-EGFR (Y1173), anti-Pakt og AKT (Santa Cruz Biotechnology); anti-ERK2 (Abcam); anti-kanin eller anti-muse HRP-konjugert sekundært antistoff (Pierce). Deteksjon ble utført ved hjelp av en Chemiluminescent Western deteksjon kit (Cell Signaling).
Cell kultur
lungekreft cellelinjer NCI-H1975, A549 og HCC827 ble oppnådd fra American Tissue Culture Collection. A549-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, New York), 100 U /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin. NCI-H1975 og HCC827 celler ble dyrket i RPMI 1640 supplementert med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin.
RNA-fremstilling og RT-PCR
total RNA av cellene ble isolert ved anvendelse av TRIZOL-reagens (Invitrogen) og fenol-kloroform-ekstraksjon fremgangsmåten i henhold til produsentens instruksjon. Total RNA (2 pg) ble hybridisert med tilfeldig primere ved 65 ° C i 5 minutter. CDNA ble syntetisert ved hjelp av en første-STRAND cDNA Synthesis Kit (Fermentas). For PCR-amplifisering, primere er som følger: Actin, forover-primer: 5′-CTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC»-3 «, revers primer: 5′-TCCTGCTTGCTGATCCACATC»-3′; Puma, forover primer: 5′-GTCCTCAGCCCTCGCTCT-3 «; revers primer: 5»-CTAATTGGGCTCCATCTCG-3 «; Bim, forover primer: 5»-GCCCCTACCTCCCTACAGAC-3 «; revers primer: 5»-ATGGTGGTGGCCATACAAAT-3 «; BCL-XL, forover primer: 5»-GGTGGGAGGGTAGAGTGGATGGT-3 «; revers primer: 5»-GGAAAGCGTAGACAAGGAGATGC-3 «; MCL-1, forover-primer: 5»-CACGAGACGGTCTTCCAAGGCATGCT-3 «; revers primer: 5»-CTAGGTTGCTAGGGTGCAACTCTAGGA-3 «; Noxa, forover primer: 5»-AAGAAGGCGCGCAAGAAC-3 «; revers primer.: 5»-CGTGCACCTCCTGAGAAAAC-3 «
Western blot-assay
Celler ble suspendert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% triton X-100, 1% natriumdeoksykolat, 0,1% SDS, 1 mM Na
3VO
4, 1 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, fullstendig protease-inhibitor cocktail), og klarert ved sentrifugering for å oppnå hel- cellelysater. Like mengder av prøvene ble separert ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulose og immunoblottet med antistoff indikerte [27].
Fremstilling av cytoplasmiske fraksjoner
For deteksjon av cytokrom c frigjøres fra mitochondria, cytoplasmatiske fraksjoner ble samlet opp fra NCI-H1975-celler etter inkubasjon med 0,1 mg /ml digitonin i 3 minutter ved 37 ° C i cytosol Lysis Buffer (0,01% digitonin, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, proteasehemmere cocktailer i ett × PBS ved pH 7,4). Etter sentrifugering ble prøver av supernatanten (cytoplasmafraksjonen) og pelleten inneholder mitokondrier analysert ved Western blotting.
Vurdering av celleproliferasjon og apoptose
Celler ble behandlet med V1801 eller gefitinib for angitt konsentrasjoner og tidspunkter. Celleformering ble bestemt ved å anvende MTT-assay. Cellelevedyktigheten ble bedømt ved trypan blått fargestoff utelukkelse [27]. Eksternalisering av fosfatidylserin ble testet ved hjelp av en Annexin V /PI apoptose Detection kit (BD Biosciences, San Jose, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter farging med Hoechst 33258 ved 10 ug /ml i 10 minutter, ble celledød bestemt ved et fluorescens mikroskop (Leica).
In vitro-EGFR-kinase-analyser
In vitro-kinase-hemmende egenskaper ble fastslått ved hjelp av ADP-Glo ™ kinase Assay Kit og EGFR kinase enzym System (Promega), etter produsentens anvisninger.
siRNA analyser
Ved hjelp HiPerFect Transfeksjon Reagens (Qiagen, Crawley, UK) i henhold til produsentens protokoll,-celler ble transfektert med 100 nM dobbelt-trådet siRNA oligonukleotider. SiRNA-sekvensene var 5′-GGUGCACGUUUCAUCAAUU-3 «(Noxa siRNA1), 5′-AACUUCCGGCAGAAACUUC-3′ (Noxa siRNA2), og 5»-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «(negativ kontroll (NC) siRNA), 5»-CAGAAATGTCCTGAGCAAT- 3 «(c-myc siRNA1), 5′-AAGGTCAGAGTCTGGATCACC-3» (c-myc siRNA2).
klonogene analysen
Etter inkubasjon med V1801 (3 mm) eller gefitinib (3 mikrometer ) i 12 timer ble en soft-agar-kolonianalysen ble utført. For dette formål, ble trypsinert celler suspendert i RPMI 1640-medium inneholdende 10% FBS og lavt smeltepunkt, 0,3% agarose (Amresco, Solon, Ohio) og deretter lagt over et størknet lag av RPMI 1640 medium inneholdende 10% FBS og 0,6% agarose i 35 mm plate (5.000 celler /skål) i tre eksemplarer. Etter 2 uker ble kolonier fiksert i 90% etanol og farget med krystallfiolett 0,005% (Sigma). Den kolonidannende enheter med mer enn 100 celler ble tellet ved hjelp av et lysmikroskop [28].
Kombinasjonsindeks
interaksjonen mellom forbindelsene ble kvantifisert ved å bestemme kombinasjonsindeksen (CI) beregnes av Chou-Talalay ligning [29], [30]. Den generelle ligning for det klassiske isobologram er gitt ved: CI = (D) 1 /(Dx) 1+ (D) 2 /(Dx) 2. Hvor Dx angir den dose av en forbindelse alene som kreves for å produsere en effekt, (D) 1 og (D) 2 er de doser av forbindelsene 1 og 2, henholdsvis, som er nødvendige for å oppnå den samme effekten i kombinasjon. Fra denne analysen, kan den kombinerte effekten av de to forbindelsene kan oppsummeres som følger: CI mindre enn 1 indikerer synergisme; CI = 1 indikerer additiv effekt; og CI 1 indikerer antagonisme
Murine modeller
Alle dyrestudier ble utført i henhold til protokoller godkjent av dyreetikk komité for Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, med godkjenning ID. av AEC2011030205. Alle mus brukt i denne studien ble avlet og opprettholdes i et bestemt patogen-fri omgivelser. NCI-H1975-celler (2,5 x 10
6) ble injisert subkutant inn i høyre flanke av nakne mus. Når tumoren nådde en følbar størrelse ble dyrene randomisert i 3 grupper (n = 11 for hver gruppe) og behandlet med V1801 (30 mg /kg /dag), gefitinib (30 mg /kg /dag) eller bærerkontroll i 3 uker. Dyrene ble avlivet når tumorene nådde 2 cm, eller hvis mus opptrådte døende for å hindre unødvendig sykelighet til musene. På tidspunktet for dyrenes død ble tumorene skåret ut; Cellene ble separert og lysert for Western blotting ved anvendelse av anti-Noxa-antistoff og anti-Actin-antistoffer. Noxa ekspresjon ble deretter kvantifisert ved densitometri analyse og normalisert mot aktin uttrykk.
Statistisk analyse
Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger, og resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD, med mindre annet er angitt.
P
verdier mindre enn 0,05 indikerer statistisk signifikans.
Resultater
Effekter av gefitinib etterligninger på lungekreftceller og EGFR kinase aktivitet
I dette arbeidet, fjorten gefitinib analoger ble syntetisert ved å bytte om posisjonene til C5 og C6 substituenter og varierende C4-amino-funksjonaliteten av kinazolin kjernen i gefitinib, og deres virkninger på NCI-H1975-celler ble evaluert ved hjelp av gefitinib som en kontroll (tabell 1). Blant disse forbindelser, ble V1801, V1802 og V1807 funnet å oppvise mye mer potent cytotoksisitet mot NCI-H1975 celler enn gefitinib, og V1801 er den mest potente en, hvis IC50-verdi på 3 um er mer enn tre folder lavere enn den for gefitinib ( tabell 1). Vanligvis, innføring av en gruppe trifluormetylanilin til C4 stilling av kinazolin-kjernen er en effektiv måte til å forbedre cytotoksisitet. En brom-substituent i C2-posisjonen ble funnet å være en egnet modifikasjon for høyere aktivitet (V1801 V1802 vs, V1805 og V1808). I tillegg piperidinenheten ved terminalen til C6-substituenten i disse forbindelser er også overlegen sammenliknet med det tilsvarende morfolin, cykloheksan, azido, triazol og tetrazol funksjonalitet.
Bruk av 3- (4,5-dimetyltiazol -2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse viste vi at V1801 viste betydelige inhiberende virkninger mot spredning av NCI-H1975 (fig. 1a) og villtype EGFR-uttrykkende A549 (fig. 1b) -celler i en doseavhengig måte. Ved trypan blå eksklusjon analyse, har vi funnet at V1801 raskt redusert levedyktig NCI-H1975 (Fig. 1c) og A549 (fig. 1d) celler i en dose- og tidsavhengig måte. Vi vurderte V1801 største virkning på kolonidannelse aktivitet av cellene, og rapporterte at i forhold til gefitinib eller bærerkontroll, V1801 drastisk hemmet klonogene aktiviteten av NCI-H1975-celler (fig. 1e og 1f).
(a , b) cellene ble behandlet med gefitinib eller V1801 i 48 timer og analysert ved MTT-analyse. (C, D) Cellene ble behandlet med gefitinib eller V1801 for angitte tidspunkter og vurdert ved trypan blå eksklusjon analyse. (E) Myk-agar-kolonidannelse assay for NCI-H1975 celler behandlet med eller uten V1801 eller gefitinib. (F) Kvantitering av foci telling. Middelverdien + standardavvik for tre uavhengige eksperimenter er vist. (G, h) NCI-H1975 (g) og (h) HCC827 celler ble behandlet med V1801 eller gefitinib i 12 timer, lysert, og Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av angitte antistoffer.
Vi testet effektene av disse gefitinib analoger på EGFR og viste at V1801, V1802 og V1805 utøvde moderat hemmende aktivitet på EGFR kinase aktivitet (tabell 1). V1801 hadde en IC
50 på EGFR mye høyere enn den til gefitinib (701,9 nM vs 11,2 nM; tabell 1), noe som indikerer at de nye modifikasjoner som gjøres i analog V1801 er gjennomførbar, men mindre overlegen for inhibering av EGFR-kinase-aktivitet. Ved Western blot-analyse i NCI-H1975-celler, både gefitinib og V1801 mislyktes i å ned-regulere fosforylert EGFR (p-EGFR) (Fig. 1 g), mens i gefitinib-sensitive HCC827 celler, gefitinib men ikke V1801 indusert de-fosforylering av p -EGFR (fig. 1 H). Disse resultatene indikerer V1801 kan indusere celle apoptose via en mekanisme uavhengig av EGFR signalveien hemming.
V1801 induserer apoptose av NSCLC-celler i en caspases avhengig måte
Vi neste testet hvorvidt V1801 induserer apoptose av cellene. Ved Hoechst 33258 flekker, ble det viste i NCI-H1975 celler V1801 forårsaket kromatin kondens og fragmentering som er typiske apoptotiske atom morfologiske endringer (Fig. 2a). Et annexin V /propidiumjodid (PI) -staining og flowcytometri-analyser bekreftet at behandling med V1801 i 24 timer indusert apoptose i NCI-H1975 og A549-celler (fig. 2b). Ved Western blot analyse ble V1801 behandling funnet å resultere i en markert økning i den aktive formen av caspase-9, caspase-8 og caspase-3 og spaltning av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) i NCI-H1975-celler i en dose- og tidsavhengig måte (fig. 2c) og i A549-celler (fig. 2d). Når NCI-H1975-celler ble forbehandlet med et pan-kaspaseinhibitor benzyloksykarbonyl-Val-Ala-Asp fluoromethylketone (z-VAD.fmk; 20 pM) i 1 time, etterfulgt av behandling med V1801 på 3 uM i 12 timer, V1801- apoptose ble undertrykket (fig. 2e), noe som indikerer at aktiveringen av caspase kaskade er avgjørende for V1801-indusert apoptose i gefitinib-motstandslegemer.
(a) NCI-H1975-celler ble behandlet med gefitinib eller V1801 for 24 timer, og evalueres av Heochst33258 assay. (B) Cellene ble behandlet med gefitinib eller V1801 i 24 timer, og apoptotisk celledød ble analysert ved hjelp av Annexin V /PI farging og flowcytometri. (C) NCI-H1975-celler ble behandlet med V1801 eller gefitinib (3 uM), lyseres, og Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av angitte antistoffer. (D) A549-celler ble behandlet med V1801 eller gefitinib (3 uM) i 24 timer, lysert, og Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av angitte antistoffer. (E) NCI-H1975-celler ble forbehandlet med Z-VAD-FMK (20 pM) i 1 time, etterfulgt av behandling med V1801 på 3 uM i 12 timer, og de apoptotiske celler ble bestemt ved Annexin V /PI farging og strømnings cytometri analyse. Middelverdien + standardavvik for tre uavhengige eksperimenter er vist. **
P
. 0,01
V1801 opp-regulerer Noxa hos NSCLC celler
Å belyse virkningsmekanismen til V1801, dens virkninger på uttrykk for antiapoptotic proteiner (BCL-XL og MCL-1) og proapoptotiske proteiner (Noxa, Puma og BIM) av Bcl-2 familien ble testet i NSCLC celler med RT-PCR-analyse. Interessant nok har vi funnet at V1801 sterkt øket ekspresjon av Noxa i en tidsavhengig måte (fig. 3a). Vi evaluerte deretter effekten av V1801 på proteinnivå Noxa, og funnet at behandling med V1801 på 3 til 4 uM i 24 timer markert oppregulert Noxa i NCI-H1975-celler (fig. 3b). I NCI-H1975 celler behandlet med V1801 ved 3 pM i 3 til 6 timer ble Noxa drastisk øket (fig. 3c). I A549, HCT116, BGC823 og SGC7901 celler, behandling med V1801 på 3 til 6 mikrometer i 24 timer også oppregulert Noxa (Fig. 3d). Imidlertid gefitinib ikke klarte å oppregulerer Noxa i disse cellelinjer (fig. 3a til 3d), som indikerer at disse to forbindelser har helt forskjellige mekanismer i indusering av apoptose av lungekreftceller.
(a) RT-PCR analyse av uttrykk for
Noxa
,
Puma
,
Bim
,
BCL-XL
, og
Mcl-en
mRNA nivået i NCI-H1975 celler behandlet med gefitinib (3 uM) eller V1801 (3 uM) for angitte tidspunkter. (B) NCI-H1975-celler ble behandlet med V1801 ved angitte konsentrasjon i 24 timer, lysert, og analysert ved hjelp av Western blot-analyse ved anvendelse av et anti-Noxa antistoff. (C) NCI-H1975-celler ble behandlet med V1801 på 3 uM for angitte tidspunkter, lysert, og analysert ved hjelp av Western blot-analyse ved anvendelse av et anti-Noxa antistoff. (D) Indikerte celler ble behandlet med V1801 eller gefitinib i 24 timer, lysert, og analysert ved hjelp av Western blot-analyse. (E) NCI-H1975-celler transfektert med kontroll eller Noxa bestemte siRNA ble behandlet med eller uten V1801 (3 uM) i 24 timer, lysert, og Western blot-analyse ble utført. (F) celler ble transfektert med siRNA og behandlet med V1801 som beskrevet under (e), og deretter analysert ved hjelp av Annexin V /PI farging og flowcytometri. (G) NCI-H1975-celler ble behandlet med gefitinib eller V1801, lysert, og immunoutfellingsstudier /Western blot analyser ble utført ved hjelp av angitte antistoffer. (H, I) NCI-H1975-celler ble behandlet med V1801 eller gefitinib i 24 timer, lysert, cytosol og mitokondrielle fraksjoner ble isolert ved sentrifugering, og Western blotting ble utført ved anvendelse av angitte antistoffer (h). Ekspresjon av cytokrom C ble kvantifisert ved densitometri analyse og normalisert mot GAPDH eller Hsp75 (i).
oppregulering av Noxa er nødvendig for V1801-indusert apoptose av NSCLC-celler
For å evaluere dens rolle i V1801-indusert apoptose, ble Noxa stilnet av spesifikk siRNA (fig. 3e), og cellene ved V1801 ble analysert ved hjelp av Annexin V /PI farging og flowcytometri. Vi fant at knockdown av Noxa vesentlig attenuert V1801-indusert apoptose av NCI-H1975-celler (fig. 3f), noe som indikerer at oppregulering av Noxa er essensiell for V1801-indusert apoptose. Men Noxa stanse kunne ikke helt avskaffet V1801-indusert celle apoptose (Fig. 3f), noe som tyder på at andre faktorer kan være involvert i programmert celledød utløst av denne gefitinib analog.
Noxa kan direkte binde Mcl-en og kompetitivt frigi Bim eller Bak fra denne apoptose antagonist, fører til mitokondriell dysfunksjon og initiering av programmert celledød [18], [31]. Vi utførte co-immunoutfelling og Western blot-analyser i V1801-behandlede NCI-H1975-celler, og fant at V1801 men ikke gefitinib forbedret Mcl-1-Noxa bindingsaffinitet (fig. 3g). Vi undersøkte den subcellulære lokalisering av cytokrom c ved Western blot, mens ekspresjon av cytokrom C ble kvantifisert ved densitometri analyse og normalisert mot GAPDH eller Hsp75. Vi har funnet at i NCI-H1975 celler behandlet med V1801 (3 uM), men ikke gefitinib (3 uM) i 24 timer ble cytokrom c delvis translokert fra mitokondrier til cytosol (fig. 3h og i). Disse resultater illustrerer at økt ekspresjon av Noxa medierer apoptose indusert ved V1801 gjennom mitokondrier svei.
undersøke mekanismene bak V1801-indusert Noxa oppregulering
Studier har vist at p53, c-Myc og E2F1 kan transcriptionally øke Noxa uttrykk via direkte binding til Noxa promoter [32]. Vi testet ekspresjonen av disse transkripsjonsfaktorer, og rapporterte at bare c-Myc ble oppregulert i NCI-H1975 celler behandlet med V1801 ved 3 pM i 3 timer (fig. 4a). For å bestemme sin rolle i V1801-indusert Noxa oppregulering og NCI-H1975 celle apoptose, c-myc ble brakt til taushet av spesifikke siRNA (Fig. 4b). Vi fant ut at c-myc stanse litt undertrykt V1801-forårsaket Noxa uttrykk (Fig. 4c) og programmert celledød i NCI-H1975-celler (fig. 4d). For å bekrefte disse resultater ble det c-myc-inhibitor 5- (4-etyl-benzyliden) -2-thioxothiazolidin-4-on (10 058-F4) [33] anvendes for å inhibere c-Myc transkripsjon funksjon. Resultatene viste at 10 058-F4 delvis fortrengt V1801-indusert Noxa oppregulering (fig. 4e) og cytotoksisitet i NCI-H1975-celler (fig. 4f).
(a) NCI-H1975-celler ble behandlet med gefitinib (3 mm) eller V1801 (3 mm) for angitte tidspunkter, lysert, og Western blot analyse ble utført med angitt antistoffer. (B) Western blot analyse ved anvendelse av lysater fra NCI-H1975-celler transfektert med kontroll eller c-Myc spesifikk siRNA og anti-c-myc-antistoff. (c) NCI-H1975-celler transfektert med c-myc spesifikke siRNA ble behandlet med eller uten V1801, lysert, og Western blotting ble utført ved bruk av angitte antistoffer. (D) NCI-H1975-celler transfektert med c-myc spesifikke siRNA ble behandlet med eller uten V1801, og evaluert ved Anexin V /PI farging og flowcytometri. (E) NCI-H1975-celler ble behandlet med den angitte protokoller for 24 timer, lysert, og Western blot-analyse ble utført. (F) NCI-H1975-celler ble behandlet med den angitte protokoller i 24 timer og bestemt ved MTT-analyse. *,
p
0,05; **,
p
. 0,01
Tidligere studier har vist at cisplatin kan opp-regulere Noxa i Erk avhengig måte, og hemming av Erk av siRNA eller liten sammensatt hemmer U0126 markert dempede cisplatin-indusert celledød, så vel som Noxa uttrykk [15]. Vi har testet effekten av V1801 på Erk, og fant at i NCI-H1975 celler behandlet med V1801 på 3 uM i 12 timer, det fosfo-Erk (p-Erk) ble øket (fig. 5a). Behandlet med V1801 i 24 timer også nedregulert på fosfo-signal transdusere og aktivatorer av transkripsjon 3 (p-STAT3), men ikke fosfo-Rac-serin /treonin-proteinkinase (p-Akt) (fig. 5a). Det ble vist at U0126 kunne dempe V1801-indusert Noxa ekspresjon (Fig. 5b) og litt (p = 0,06) redusert V1801-indusert apoptose av NCI-H1975-celler (fig. 5c).
(a) NCI -H1975 celler ble behandlet med gefitinib (3 mm) eller V1801 (3 mm) for angitte tidspunkter, lysert, og Western blot analyse ble utført. (B) NCI-H1975-celler ble behandlet med den angitte protokoller for 12 eller 24 timer, lysert, og Western blot-analyse ble utført. (C) NCI-H1975-celler ble behandlet med den angitte protokoller i 24 timer, og apoptotisk celledød ble evaluert av Annexin V /PI farging og flowcytometri. (D) NCI-H1975-celler ble behandlet i 24 timer med BOR og /eller V1801, og deretter bedømt ved MTT-analyse. (E) NCI-H1975-celler ble behandlet med V1801 (2 uM), gefitinib (2 uM), BOR (10 nM), eller deres kombinasjoner for angitte tidspunkter. Cellene ble deretter lysert og underkastet Western blotting ved å bruke angitte antistoffer.
mantel-celle lymfom, er Noxa aktivering nødvendig for proteasominhibitor bortezomib apoptose [13]. Vi testet den kombinerte effekten av V1801 og bortezomib på NCI-H1975 celler og funnet ut at bortezomib på 10-15 Nm betydelig forbedret V1801 (2 mm) -caused hemming av celleproliferasjon (Fig. 5d). En analyse av kombinasjonsindeksen (CI) [29], [30] indikerte at CI verdiene var mindre enn 1, hvilket indikerer at disse to stoffer kan utøve synergistiske effekter på NSCLC-celler. På molekylnivå, viste vi at behandling av NCI-H1975 celler med V1801 og bortezomib resulterte i forbedret opp-regulering av Noxa og aktivering av Casp-3 og spaltning av PARP (fig. 5e). Imidlertid oppregulering av p-Erk indusert ved V1801 ble svakt dempet ved bortezomib (fig. 5e).
In vivo
anti-tumor effekt av V1801 på xenograft musemodell
Vi testet
in vivo
anti-tumor effekt av V1801. For å gjøre dette, var naken mus subkutant inokulert i høyre flanke med 2,5 × 10
6 NCI-H1975 celler i 0,1 ml PBS. Når tumorene nådde en følbar størrelse, ble musene tilfeldig delt inn i 3 grupper (n = 11 for hver gruppe) og oral administrering med V1801 (30 mg /kg /dag), gefitinib (30 mg /kg /dag) eller bærerkontroll for 3 uker. Forbløffende nok fant vi at V1801 betydelig hemmet tumorvekst sammenlignet med kjøretøy kontroll eller gefitinib (P 0,05) (figur 6a til 6c.). Dyrene ble avlivet da de ble behandlet i 3 uker, og tumorprøver ble isolert og fotografert (Fig. 6c). Proteiner ble ekstrahert fra tumorprøver og Western blot-analyse ble utført. Vi fant at i prøver fra mus behandlet med V1801, ekspresjonen av Noxa var oppregulert i forhold til den i prøvene separert fra kjøretøyet eller gefitinib kontrollmusene (fig. 6d og e). Disse resultater viser at administrering av V1801 oppviser store terapeutiske potensialer.
(a) nakne mus inokulert subkutant med NCI-H1975-celler ble behandlet med gefitinib eller V1801 i 3 uker, og kalibermålinger av de lengste perpendikulære diametre var tumor utføres hver to dager for å estimere tumorvolumet. (B) Bilder av mus to uker etter oppstart av behandlingen. (c) Bilder av xenografttumorer hentet fra mus. Åtte representative svulster for hver behandlingsgruppe vises. (D, e) Western blot-analyse av lysater av tumorprøver ved bruk av angitte antistoffer (d). Noxa uttrykk ble kvantifisert ved densitometri analyse og normalisert mot Actin uttrykk (e).
Diskusjoner
EGFR er en celle-overflate reseptorer aktiveres i mer enn halvparten av pasienter med NSCLC, og denne aktivering kan være et resultat av protein overekspresjon, økt genkopitallet, eller genetiske mutasjoner [2]. Gefitinib anti-lunge-kreft effekt attributt til sin binding til adenosin-trifosfat bindingssetet i tyrosin kinase domene av EGFR, for derved å inhibere EGFR-kinase-aktivitet [3], [5], [34], [35]. Selv om mange pasienter i utgangspunktet svare på gefitinib, motstand og tumorresidiv eventuelt utvikle. For å overvinne en slik medikamentresistens, ble nye mutante-selektiv EGFR-kinase-hemmere mot EGFR T790M rapportert [36], og 4-pyrrylamino kinazoliner som nye gefitinib analoger ble syntetisert [37]. I denne studien, design vi, syntetisere og vurdert en rekke nye kinazolinderivater ved å bytte om posisjonene til C5 og C6 substituenter og varierende C4-aminofunksjonaliteten av gefitinib, og rapporterer at forbindelse V1801 som har en trifluormetylgruppe på C5′- posisjon og en brom ved den C2′-stillingen i anilin gruppe substituert i C4 stilling av kinazolin-kjernen overvinner gefitinib motstand via oppregulering av Noxa, noe som tyder på en ny strategi for å kjempe mot NSCLC med EGFR T790M mutasjon.
