Abstract
Bakgrunn
lungesvulster er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis og paklitaxel har vist seg å være nyttig for pasienter med lungekreft, men er ervervet resistens et stort problem. For å overvinne dette problemet, er en lovende alternativ ved bruk av Constitutive Androstane reseptor (CAR) ligander i kombinasjon med kjemoterapeutiske midler mot kreftceller. Derfor ønsker vi å belyse virkningene av CAR ligander på antineoplastiske effekt av paclitaxel i lungekreftceller.
metodikk /hovedfunnene
Våre resultater fra celle levedyktighet analyser avslørte CAR agonist eller inverse- agonist til mus og humane lungekreftceller modulert den antineoplastiske effekt av paklitaxel. Bilen agonister økt effekt av paklitaxel i 6 av 7 lungecancercellelinjer, mens det inverse-agonisten hadde ingen effekt på paclitaxel cytotoksisitet. Interessant, mCAR agonist TCPOBOP forbedret ekspresjon av to tumorsuppressorgener, nemlig WT1 og MGMT, som ble additivt forbedret i celler behandlet med CAR agonist i kombinasjon med paklitaxel. Også,
i silico
analyse viste at både paclitaxel og CAR agonist TCPOBOP dokket inn i mCAR struktur, men ikke den inverse agonist androstenol. Paclitaxel i seg selv øker uttrykket av CAR i kreftceller. Endelig, analyserte vi uttrykk for CAR i to offentlige uavhengige studier fra Kreft Genome Atlas (TCGA) av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). CAR er uttrykt i variable nivåer i NSCLC prøvene og ingen forbindelse med total overlevelse ble observert.
Konklusjon /Betydning
Til sammen våre resultater viste at bilen agonister modulere antineoplastiske effekt av paclitaxel i mus og menneskelige kreftcellelinjer. Denne effekten er sannsynligvis relatert av ekspresjon av to tumorsuppressorgener, nemlig. WT1 og MGMT. Mesteparten av NSCLC tilfeller stede CAR genuttrykk snu det mulig å spekulere i bruk av CAR modulering av ligander sammen med paclitaxel i NSCLC behandling
Citation. Fukumasu H, Rochetti AL, Pires PRL, Silva ER, Mesquita LG, Strefezzi RF, et al. (2014) Constitutive Androstane reseptorligander modulere anti-tumor effekt av Paclitaxel i ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 9 (6): e99484. doi: 10,1371 /journal.pone.0099484
Redaktør: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Senter for Bioteknologi, India
mottatt: 6 august 2013; Godkjent: 15 mai 2014; Publisert: 24 juni 2014
Copyright: © 2014 Fukumasu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne takk Fundação de Apoio en Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) for økonomisk støtte (prosess tall:. 2008 /56584-2, 2009 /11081-6; 2010 /00535-3; 2010 /05650-5, 2011 /05690- 0. funders hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lungesvulster er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis, og de er ansvarlige for anslagsvis 1,2 millioner dødsfall per år [1]. i de siste 30 årene har flere fremskritt i lungekreft behandling har dukket opp med forbedring av immunterapi, strålebehandling og kjemoterapi, men gevinsten i overlevelsestiden av lungekreftpasienter fortsette å være beskjedne [2]. Behandlingen for lungekreft, avhenger av den histologiske typen, tilstedeværelse av metastase og pasientens funksjonstilstand. De mest vanlige behandlingsmetoder omfatter en kombinasjon av kirurgi (når svulster er resectable), strålebehandling og kjemoterapi. Når det gjelder sistnevnte, er anvendelse av en eller flere cytotoksiske medikamenter på samme tid, for eksempel taxaner, platinaforbindelser og /eller nukleosidanaloger mest vanlig. Vanligvis førstelinje kjemoterapi for avansert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) benytter en protokoll med et taxan (paclitaxel eller docetaxel) i forbindelse med cisplatin eller gemcitabin [3].
Kreft vanligvis til stede som en heterogen befolkning av ondartede celler, med noen som er narkotika-sensitive og noen som er resistent. Cytotoksisk kjemoterapi dreper medikamentsensitive celler, men påvirker ikke medikamentresistente celler som er generelt i en sovende tilstand [4]. Som svulsten begynner å vokse igjen, mislykkes kjemoterapi ofte fordi de gjenværende tumorceller er hovedsakelig resistent [5]. Paclitaxel, en mye brukt antineoplastisk medikament for lungekreft, er et tubulin-bindende middel som blokkerer progresjonen av mitose slutt fører til celledød ved apoptose [3]. Denne taksanet har vist seg å være et nyttig legemiddel for pasienter med lungecancer; imidlertid, i likhet med andre kjemoterapeutiske medikamenter, ervervet resistens av kreftceller blir ofte observert.
Derfor øker effektiviteten av paclitaxel er meget ønskelig. Chen
et al
. [6] ansett som en lovende alternativ som involverer bruk av CAR (Constitutive Androstane Receptor, NR1I3) og PXR (pregnan-X reseptor, NR1I2) ligander i kombinasjon med kjemoterapeutika som aktiverer PXR og CAR å overvinne, eller i det minste demper multiresistens (MDR) i kreftceller. Interessant, er paclitaxel en potent PXR aktivator og induser av P-gp-mediert clearance av legemidlet [7]. I tillegg er flere cellegifter modulert eller metaboliseres av cytokrom P450-enzymet CYP3A4 [8], en kjent transcriptional mål av aktivert PXR og CAR [9], [10].
CAR og PXR er steroidkjernereseptorer kjent som stam xenosensors [11] som er i stand til å gjenkjenne strukturelt forskjellige forbindelser [12]. Begge reseptorer, når den aktiveres av ligander, translocate til kjernen og indusere transkripsjon av en rekke gener involvert i legemiddel metabolisme og utskillelse, glukose og lipidmetabolisme og hormonell regulering [13], [14]. Nylig, har betydningen av PXR i kreft patogenesen og MDR av svulster vært en del debatt, men ingen enighet om sin spesielle rolle er oppnådd så langt [15], [16]. I likhet med PXR, rollen CAR i kreft er også kontroversielt. På i den ene hånden, ble CAR fast bestemt på å være avgjørende for levertumorvekst av Phenobarbital [17], [18], og på den annen side CAR ble vist å være en roman terapeutisk mål for hjernen og blodkreft svulster [19], [20 ]. Derfor vårt mål var å belyse viktigheten av CAR modulering av selektivt ligander og å bestemme nedstrøms effekter på antineoplastiske effekt av en av de mest vanlige brukte cellegifter for lungekreft.
Materiale og metode
Reagenser og cellelinjer
Paclitaxel, CITCO, TCPOBOP, androstenol og MTT ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Medier og reagenser for cellekultur ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Trizol, oligoDT primere, Hevet II enzym og strøm SYBR Grønn Mastermix var fra Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Andre reagenser var av analytisk kvalitet. Cellelinjene anvendt i dette forsøk var musecellelinjen E9 [21], og den humane cellelinjer A549, H2023, H460, H2030, H1792 og H23 [22]. Alle disse cellelinjene var en gave fra Dr. Lucy M. Anderson fra Laboratory of Comparative Karsinogenese på Frederick National Laboratory for Cancer Research (USA).
Cell eksperimenter med mus og kreftcelle human lunge linjer
mus lungekreft cellelinje E9 var stammer fra spontan transformasjon av udødelig ikke-neoplastiske lunge epitelceller isolert fra BALB /c mus [23]. Disse cellene ble dyrket i CMRL 1066-medium (Invitrogen, New York, NY), supplert med 10% føtalt kalveserum (Invitrogen), 200 mM L-glutamin (Invitrogen) og antibiotikum cocktail (100 enheter /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin; Invitrogen) i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 7% CO
2. Humane lungecancercellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, New York, NY), med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen) pluss 2% L-glutamin (Invitrogen) og 1% Pen-strep (Invitrogen) i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2.
Bestemmelse av mCAR ligander virkning på cellelevedyktighet.
E9-celler ble sådd ut ved 2 000 /brønn i 96-brønners plater (Corning, USA ) inneholdende 100 ul media supplert som beskrevet. Etter 24 timer ble mediet utladet og endret med nye medier lagt med ulike konsentrasjoner av CAR agonist (TCPOBOP) eller CAR invers agonist (androstenol) fra 10
-4 mikrometer til 10 mikrometer. Førti-åtte timer senere ble 11 ul av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT – 5 mg /ml) ble tilsatt til hver brønn og formazankrystaller ble produsert i løpet av en 2 timers inkubasjonstid. Mediet ble fjernet fra hver brønn og 100 ul av 0,4N HCl i isopropilic alkohol ble tilsatt for å oppløse krystallene. Optisk tetthet ved 540 nm ble målt i en Fluorstar Optima (BMG Labtech, Tyskland).
Bestemmelse av halvparten av maksimal inhiberende konsentrasjon av Paclitaxel (IC50).
E9-celler ble anvendt med den samme protokollen beskrevet ovenfor i konsentrasjoner fra 1 nM til 1600 nM av paclitaxel.
Evaluering av effektene av mCAR ligander på paclitaxel cytotoksisitet.
E9-celler ble anvendt med den samme protokoll som er beskrevet ovenfor, hvor ligandene var lagt samtidig med IC50 av Paclitaxel og celle levedyktighet ble evaluert som beskrevet.
Fastsettelse av HCAR ligander virkning på celle levedyktighet, beregning av IC50 av Paclitaxel og co-eksponering eksperimenter.
Alle disse eksperimenter med humane cancercellelinjer ble utført som beskrevet for mus E9 kreftceller med spesifikke forhold for cellekulturer som beskrevet.
Genekspresjon analyse av mCAR
E9-celler ble sådd ut ved 3,10
5 celler /plate i T25-plater (Corning, USA) under de samme betingelser som beskrevet ovenfor med tilsetning av TCPOBOP (10 uM), androstenol (10 uM), TCPOBOP (10 pM) pluss Paclitaxel (IC50), androstenol (10 pM) pluss Paclitaxel (IC50) eller DMSO-bare for kontroll. Total RNA ble ekstrahert fra fem replikater av hver behandling og kontroller med Trizol følgende produsentens instruksjoner. RNA-prøvene ble deretter kvantifisert (Biophotometer, Eppendorf, Tyskland) og 260/280-forholdet ble observert. Bare prøver som presenteres 1,7-2,0 og viste god kvalitet (ikke degradert) etter elektroforese analyse i en agarosegel (1,5% Tris-bufret saltvann) ble anvendt. Således, 1 ug total RNA ble revers transkribert med oligoDT primere og superscript II i cDNA. Alle primere ble utformet med Primer-3 programvare [24] og ble kjørt i BLAST [25] for å bekrefte fravær av lokale justeringer med DNA og andre mus RNA transkripsjon sekvenser. Strøm SYBR Green ble anvendt for real-time PCR med primere for mCAR (NM_009803.5; F: 5′-GGGCCTCTTTGCTACAAGAT-3 «, R: 5′-AGGTTTTTATGGAAGTGGAGGA-3′). Husholdningsgenet som ble anvendt var den 18 s ribosomalt RNA (NR_003278.3; F: 5»-CCTGCGGCTTAATTTGACTC-3 «, R: 5′-CTGTCAATCCTGTCCGTGTC-3»). Reaksjonene ble utført i en ABI Prism 7500 thermocycler (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) med strøm SYBR grønn Master Mix reagens og analyse av relative genekspresjon data ble utført i henhold til Delta-Delta-CT-metoden [26 ].
PCR rekke RT
2 profiler analyse
RT
2 Profiler Mouse onkogener og tumorsuppressorgener PCR Array (PAMM-502Z, SABiosciences, USA), som inneholder 84 gener som fremmer Oncogenesis, pluss housekeeping gener og kontroller, ble brukt til å analysere effekten av TCPOBOP pluss paclitaxel-relaterte genuttrykk i E9 celler. Celler ble sådd ut og behandlet som beskrevet ovenfor, ble total RNA ekstrahert med RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA) og tre replikater per behandlings hvor ble samlet for analyse (eksperiment utført i duplikat). Pooled RNA ble revers-transkribert med First Strand kit (SABiosciences), kombinert med SYBR grønn /ROX PCR masterblanding (SABiosciences), og tilsatt til hver brønn på RT2 Profiler PCR-platen, inneholdende den pre-dispensert genspesifikke primer settene. Reaksjonen ble kjørt på en ABI Prism 7500 termosykler. Analyse av data var basert på Ct metoden, med normalisering til fire forskjellige husholdningsgener. Brett endringer av 2X (opp eller ned-regulering) ble tatt med i analysene.
I silico
analyse for dokking av mCAR ligander og paclitaxel inn i mCAR struktur
Computational analyse ble utført ved anvendelse av krystallstrukturen av CAR-reseptoren ko-krystallisert med androstenol (PDB 1XNX) [27] og TCPOBOP (PDB 1XLS) [28]. Receptor mål- og tilkoblings ligander ble fremstilt ved bruk Chimera [29]. Den molekylære overflaten av målet ble generert basert på algoritmeutvikling [30]. Sphere generasjon ble utført ved hjelp av sphgen algoritmen; kulene ble distribuert med dock6 og valgt å bruke «spheres_selector». Grid generasjon ble oppnådd ved hjelp av Grid, som er distribuert som tilbehør til dock [31]. Fleksibel Dock ble brukt til å verifisere interaksjoner mellom målet CAR reseptoren og kjemikalier [32]. Resultatene som oppnås ved dokking ble visualisert og analysert på Chimera versjon 1.4.1 (bygge 30 365).
cBioPortal analyse av kreft Genome Atlas datasett
cBioPortal, et verktøy utviklet av beregninger Biology Senter ved Sloan Kettering, ble åpnet på https://www.cbioportal.org/public-portal/[33], [34]. To datasett ble brukt i dette arbeidet: «Lung Adenocarcinoma (TCGA, in press)» med 230 tilfeller og «Lung plateepitelkreft (TCGA, Provisional)» med 489 saker på tidspunktet for analyse, mars 2014. Begge studiene var brukt til å vurdere tilstedeværelse av genmutasjoner og kopitall endringer (CNA) illustrert med «oncoprints», forandret mRNA-ekspresjon og /eller DNA-metylering og total overlevelse kurver innenfor disse endringer. For å finne ut hvilken prøven presenteres endret genuttrykk i Z-score ble satt til 1,96.
Statistisk analyse
Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik mindre annet er angitt. GraphPad Prism 5 for vinduer (GraphPad Software, USA) ble brukt for alle statistiske analyser utført med ikke-parametriske tester som Mann-Whitney og Spearman. To-veis ANOVA ble anvendt for sammenligninger mellom forskjellige ligander virkning på cellenes levedyktighet. Total overlevelse fra TCGA data ble estimert med Kaplan-Meier-kurver og logrank p-verdier ved cBioPortal for Cancer Genomics [33], [34]. Signifikante forskjeller ble vurdert når p. 0,05
Resultater
Bilen ligander er ikke cytotoksisk til mus eller humane lungekreftceller
I utgangspunktet vi evaluert de cytotoksiske effektene av mCAR ligander, inkludert agonisten TCPOBOP og den inverse agonist androstenol, på E9 muselungecancerceller. Eksponering for TCPOBOP i 48 timer hadde ingen virkning på cellelevedyktighet E9 selv ved en høy konsentrasjon (Fig.1). På den annen side, det inverse agonist-androstenol induserte en doseavhengig økning i celleproliferasjon, med mer enn 60% celler enn kontrollgruppen i høy konsentrasjon (p 0,0001, Fig. 1). Disse resultatene tyder på at bruk av mCAR agonister i musecancerceller, kan føre til ulike effekter på celle-levedyktighet, og med økende celleformering som observeres for androstenol.
(A) Cellenes levedyktighet etter 48 timer med forskjellige konsentrasjoner av mCAR agonist TCPOBOP eller mCAR inverse-agonist androstenol. TCPOBOP har ingen virkning på cellelevedyktighet, selv ved den høyeste konsentrasjon. På den annen side, androstenol øker antall E9 kreftceller doseavhengig (* p 0,05 – Toveis ANOVA etterfulgt av Tukey multiple sammenligningstest for behandlingseffekt). (B) Effekten av mCAR ligander på den anti-tumor effekt av paklitaxel (IC50). TCPOBOP øker anti-tumor effekten av paclitaxel ved betydelig reduksjon cellelevedyktighet på 1-10 uM sammenlignet med kun paclitaxel-behandlede celler (p 0,05 – Toveis ANOVA etterfulgt av Tukey multiple sammenligningstest for behandlingseffekt). Androstenol delvis opphever den anti-tumor effekt av paklitaxel (p 0,05 – Toveis ANOVA etterfulgt av Tukey multiple sammenligningstest for behandlingseffekt). (C) Gene ekspresjon av mCAR i celler behandlet med ligander alene, paclitaxel alene, eller i kombinasjon. Ligander endret ikke mCAR genuttrykk. Merk at alle paclitaxel behandlede-gruppene present økt mCAR genuttrykk i forhold til kontrollgruppen (* p 0,05 – En måte ANOVA).
Deretter utførte vi tilsvarende forsøk i seks human lunge kreft cellelinjer. Vi testet hvis den spesifikke humane CAR-agonist, CITCO, og den inverse agonist androstenol, presentert noen cytotoksiske effekter i disse cellelinjene. Ingen effekt ble kjent for CITCO eller Androstenol selv ved den høyeste konsentrasjonen testet (p . 0,05 for alle cellelinjer, Fig S1).
Bilen agonister TCPOBOP og CITCO forbedre antineoplastiske effekt av paclitaxel i mus og menneske lungecancerceller
hypotese var at CAR modulering av dens ligander kunne forandre den anti-tumor effekten av paclitaxel, et antineoplastisk middel som vanligvis brukes for lungecancer kjemoterapi hos mennesker. Først bestemmes vi konsentrasjonen av paclitaxel som inhiberte 50% av cellelevedyktighet for hver cellelinje (IC50, tabell 1). Ved hjelp av denne konsentrasjonen, evaluert vi neste effektene av CAR agonister på anti-tumor effekt av paclitaxel ved å utsette kreftceller for å paclitaxel pluss ulike konsentrasjoner av en bil agonist eller invers-agonist.
Når vi co -exposed muselungecancerceller for forskjellige konsentrasjoner av TCPOBOP pluss paclitaxel på den inhibitoriske konsentrasjon (IC50), CAR-agonisten forbedrede paclitaxel anti-tumor effekt på doseavhengig måte, redusere cellenes levedyktighet med nesten 40% sammenlignet med den i celler behandlet med paklitaxel alene (p 0,05, fig. 1). På den annen side, invers agonist androstenol redusert den cytotoksiske effekten av paclitaxel i E9-celler (p 0,05, Fig. 1). Disse resultater indikerer at spesifikk modulering av CAR av agonisten TCPOBOP forbedrer anti-tumor effekt av paklitaxel i E9 kreftceller.
Vi utførte dette eksperimentet i seks humane lungekreft-cellelinjer, hvor det ko-eksponering av humant CAR ligander ble evaluert for sin effekt på citotoxicity av paclitaxel. CAR agonist CITCO betydelig forbedret paclitaxel effekt i fem av de seks humane lungekreftceller testet (p 0,05; fig 2).. På den annen side, CAR invers-agonist androstenol gav ingen signifikant forskjell i noen cellelinjer (p 0,05, Fig. 2). Disse resultatene viser at bilen agonister forsterke antineoplastiske effekt av paclitaxel i de fleste lungekreftcellelinjer (mus og mennesker), noe som gjør dem til et interessant fokus for videre karakterisering.
Celleviabilitet etter 48-agonist Androstenol i kombinasjon med Paclitaxel. CITCO forbedrer paclitaxel cytotoksisitet betydelig i fem av seks cellelinjer (* p 0,05 – Toveis ANOVA etterfulgt av Tukey multiple sammenligningstest for behandlingseffekt). På den annen side, androstenol i kombinasjon med paclitaxel har ingen effekt i forhold til paclitaxel-behandlede celler.
Paclitaxel forbedrer mCAR uttrykk
Vi neste evaluert enten de paclitaxel endret mCAR genuttrykk. For dette formål utsettes vi E9-celler på følgende forskjellige behandlinger: 10 uM av TCPOBOP, 10 uM av androstenol, er IC50 av paclitaxel, eller en kombinasjon av disse. Våre resultater viste at en enkelt behandling med TCPOBOP eller androstenol hadde ingen effekt på mCAR mRNA-ekspresjon (Fig. 1). Imidlertid, når cellene ble behandlet med paclitaxel alene eller i kombinasjon med TCPOBOP eller androstenol, ble en økning i ekspresjon mCAR sett uavhengig av liganden (p = 0,0102, Fig. 1).
TCPOBOP og paclitaxel endre tumor suppressor og onkogene ekspresjonsnivåene
Ytterligere eksperimenter ble utført bare med muselungecancercellelinje E9. Vi evaluerte effektene av TCPOBOP og paclitaxel på genekspresjon profilen 84 onkogener og tumorsuppressorgener. Til å begynne med ble fem gener som kuttes fra analysen fordi de presenterte CT-verdier større enn 35, og /eller tilstedeværelse av mer enn en PCR-produkt ble påvist. Fra de 79 gjenværende gener, paclitaxel behandling endret ekspresjon av 10 gener, med bretteendringer på mer enn 2 (tabell 2). I henhold til de funksjonelle gruppene genet fra RT2 Profiler PCR matrise har de fleste av gener oppregulert paclitaxel var tumorsuppressorgener gener relatert til apoptose, onkogener eller gener som er tilstede egenskaper av onkogener og tumorsuppressorgener (tabell 2).
eksponering av E9-celler til muse CAR liganden TCPOBOP øket ekspresjon av to tumorsuppressorgener: MGMT og WT1 (tabell 2). Interessant, da vi har evaluert genekspresjonen i celler behandlet med TCPOBOP plus paclitaxel (med den samme konsentrasjon som øker paclitaxel cytotoksisitet), ekspresjonen av disse to genene var forbedret lenger enn når bare paklitaxel eller TCPOBOP ble administrert, noe som tyder på en additiv effekt på gen ekspresjon av disse genene. I tillegg vil kombinasjonen av TCPOBOP pluss paclitaxel resulterte i nedregulering av to oncogener, ZHX2 og ESR1 (tabell 2). Videre ser det ut til at den samlede eksponeringen av E9 celler til TCPOBOP og paclitaxel forbedret paclitaxel-indusert genekspresjon signatur (tabell 2). Samlet utgjør disse resultatene er i samsvar med de ovenfor beskrevne og forklare modulerende egenskapene til mCAR agonist TCPOBOP på anti-tumor effekt av paclitaxel i mus lunge kreftceller.
I silico analyse viser at Paclitaxel og TCPOBOP passer inn i mCAR struktur
justering av 1XLS og 1XNX struktur viste at posisjoneringen av agonisten TCPOBOP og invers-agonist androstenol inn i mCAR struktur er forskjellige (fig. 3). Dokking av TCPOBOP ble utført som en kontroll, og det viste en god overlagring av TCPOBOP i krystallstrukturen av 1XLS (fig. 3). Dokking bruke 1XLS struktur avslørte at den inverse agonist-androstenol ikke kunne binde ved posisjonen av agonisten TCPOBOP; androstenol viste en positiv energi gitter (51,82) som er ugunstig for å binde inne reseptoren. Energien rutenett av TCPOBOP og paclitaxel er henholdsvis -49,34 og -125,53. På den annen side til forankrings ved hjelp av 1XNX struktur lede den beste energi til reseptor-ligand interaksjonen pekte på en mulig andre sete i CAR-reseptoren for TCPOBOP binding (fig. 3) med en gunstig energi gitter (-32,01), som ligner til den som ble oppnådd for de androstenol (-40,44). Paclitaxel viste også den mest gunstig energi og lukket forpliktende verdier av bind i begge strukturer hvor TCPOBOP eller androstenol ble brukt som en docking guide ligand (tabell 3), noe som indikerer at paclitaxel kan også være en mCAR ligand.
En , D-androstenol; B, E-Paclitaxel, C, F-TCPOBOP; G og H * androstenol og TCPOBOP superposisjon: G- overflaten utsikt og H- ledning visning av ligander. Merk at paclitaxel forankret i begge mCAR strukturer.
Menneskelig CAR karakterisering i ikke-småcellet lungekreft prøver fra to uavhengige studier
Vi preget status HCAR i NLSLC fra to studier med offentlig tilgjengelige data gjennom TCGA. I adenokarsinom studien, fra 230 prøver, 17,8% av tilfellene (41/230) presenterte genetiske endringer av HCAR, inkludert Kopier nummer Endringer (CNA), mutasjoner eller endret genuttrykk (Fig. 4). Disse endringer ble ikke forbundet med total overlevelse (OS, p = 0,40, fig. S2). De fleste av prøvene fra dette studiet presenteres med øket HCAR metylering i henhold til den HM450 analyse (Fig. 4). Bekreftende disse dataene, bare 8% av tilfellene (19/230) er presentert med oppregulering av HCAR mRNA.
(A) genetiske endringer og hyppigheten av HCAR i Lung Adenocarcinoma studien tilgjengelig fra TCGA. (B) Samme data fra Lung Plateepitelkarsinom studien tilgjengelig fra TCGA. (C) DNA metylering vs genekspresjon av HCAR fra Lung adenokarsinom prøver fra TCGA. (D) DNA metylering vs genekspresjon av HCAR fra Lung plateepitelkarsinom prøver fra TCGA. Begge datasett presenteres svært DNA metylering og variable nivåer av mRNA uttrykk for NR1I3
Deretter brukte vi informasjon fra en annen studie fra TCGA på lunge plateepitelkarsinom (LSCC, TCGA, foreløpig data -. 04/26 /2014). Hyppigheten av HCAR endringer slik som mutasjoner, CNAs eller forandret genekspresjon (fig. 4), var 8,2% (40/489) som ikke var assosiert med OS (p = 0.81, fig. S1). I likhet med adenokarsinom undersøkelsen, de fleste av prøvene presentert med økt DNA-metylering av HCAR (fig. 4). Dette kan forklare hvorfor bare 7,4% av alle tilfeller presentert med oppregulering av HCAR mRNA (36/489).
Basert på resultatene fra begge undersøkelsene, er det mulig at flertallet av prøvene fra lunge adenokarsinom og LSCC pasienter presentere ingen endringer i HCAR uttrykk i forhold til paret, ikke-kreft vev, noe som kan forklares med den høye nivåer av metylering funnet i begge studiene.
Diskusjoner
Lungekreft fortsetter å være et stort problem for helsesystemer over hele verden, som de fleste sakene gjelder pasienter med sammensatt lungefunksjon, metastaser, multi-legemiddelresistens og dårlige resultater. Overlevelsen av lungekreftpasienter etter tumordeteksjon er typisk mindre enn 5% etter fem år [35]. Nylig har bevis begynt å vise at CAR kan ha en rolle i kreftterapi [19], [20]. Her viser vi at spesifikk CAR modulering av agonister, men ikke ved invers-agonister, økte anti-tumor effekt av paklitaxel i både murine og humane lungekreftceller. Denne effekten ble fulgt ved potensering av en paclitaxel-indusert genekspresjon signaturen ved bruk av en kombinasjon av paclitaxel og TCPOBOP. I tillegg er en enkelt eksponering av kreftceller til TCPOBOP øket ekspresjonen av to tumorsuppressorgener (WT1 og MGMT), som kan underbygge den forbedrede effekt av paklitaxel i kreftcellelinjer. Paclitaxel behandling økt CAR genekspresjon og forankret i den molekylære strukturen av CAR
i silico
. Til slutt, vi analyserte profilen til HCAR i to TCGA studier og bemerket at bilen kunne være et interessant mål for NSCLC pasienter som fikk paklitaksel behandling siden HCAR er uttrykt i tumorprøver og har ingen tilknytning til OS.
Chen
et al.
nylig muligens CAR ligander for å være et lovende alternativ for kombinert kjemoterapi, med sikte på å overvinne MDR i kreftceller [6]. Våre resultater støtter dette forslaget siden bilen ligander ikke føre til cytotoksiske effekter per se i kreftceller; imidlertid, når CAR agonister ble anvendt i kombinasjon med paclitaxel, fremkom en interessant modulerende effekt. Denne forbedrede cytotoksiske virkning ble også sett i fem av seks forskjellige humane kreftcellelinjer siden CITCO, den HCAR agonist, viser en lignende effekt på paclitaxel effekt. Derfor støtter vi hypotesen om Chen
et al.
At CAR modulasjon kan faktisk være viktig for kreft kjemoterapi [6].
Den eksakte rolle CAR i kreftutvikling og kreftbehandling er fortsatt en omdiskutert. På den ene siden, er bilen viktig for leveren tumorvekst av fenobarbital hos mus [18] og det regulerer tumorigenesis svar på xenobiotisk stresset [36]. På den andre siden, Wang et al. beskrevet bilen som en roman terapeutisk mål som forenkler cyklofosfamid (CPA) -basert behandling av blodkreft maligniteter [20], og hvor de konkluderte med at CAR aktivering forenkler CPA-basert kjemoterapi ved selektivt å fremme sitt bioaktive. I en annen studie ble CITCO vist seg å målrette hjernesvulst stamceller, hemmer deres vekst og ekspansjon [19]. Begge avisene foreslå bruk av CAR agonister for behandling av blod malignitet og hjernen kreft, henholdsvis.
Som tidligere nevnt, induserer paclitaxel apoptose i voksende celler. Her, paclitaxel-indusert celledød i alle mus og humane kreftcellelinjer, med unike IC50-verdier for hver enkelt av dem. Selv etter med tanke på at disse cellene nåværende forskjeller i deres motstand mot Paclitaxel (≈3600x), bilen agonister forbedret effektiviteten av paclitaxel i nesten alle kreftcellelinjer (6/7). På den annen side, det inverse-agonist Androstenol ikke resultere i noen effekt på cytotoksisiteten av paclitaxel i de fleste av cellene, og det svekkede den cytotoksiske av paclitaxel i en cellelinje. Disse resultatene lede til den konklusjon at eneste bilen agonister bør vurderes for å forbedre NSCLC kreftbehandling.
Effektene av CAR agonister på anti-tumor effekt av paclitaxel var lik i begge mus og humane celler. Derfor fokuserte vi våre eksperimenter på mus modell av to grunner: vi har mer erfaring med denne modellen [37], [38] og alle de teknikkene som brukes i musemodellen var rutine i vårt laboratorium. Videre er det etablert bruk av mus lunge epiteliale kreftcellelinjer i mer enn 30 år nå, og har presentert tilsvarende resultater som de oppnådd med humane cellelinjer [23]. Dermed har vi også demonstrert i dette
in vitro
musemodell som paclitaxel øker CAR genekspresjon ved IC50, uavhengig av sin tilknytning til CAR ligander. Man kunne forvente at mCAR ligander bør modulere mCAR genekspresjon, men våre resultater viste ikke denne effekten. CAR aktivering av spesifikke ligander ikke alltid forandre CAR genuttrykk eller protein nivåer, men det kan likevel føre til en økning i transkripsjonen aktivitet.
CAR uttrykk analyse i mus kreftceller behandlet med CAR ligander alene, paclitaxel alene eller en kombinasjon av begge, viste at Paclitaxel økt genekspresjon av CAR uavhengig av sin tilknytning til TCPOBOP eller androstenol. Følgelig Enige med dette resultatet,
i silico
docking analyse av TCPOBOP, Androstenol og paclitaxel i CAR proteinstruktur vist at paclitaxel passer inn i ligand-bindende lommen mCAR reseptoren, noe som kan øke CAR uttrykk av positive tilbakemeldinger. Ingen effekt på CAR genekspresjon ble bemerket etter CAR binder til eksponering, noe som bekrefter med fravær av cytotoksisitet av disse ligandene.
Et annet interessant resultat som støtter den modulerende effekt av CAR-agonister på paclitaxel ble effekten deres forsterkning av paclitaxel sin genekspresjon signatur, noe som øker ekspresjonen av enkelte tumorsuppressorgener og redusere ekspresjonen av to oncogener. Interessant, behandling med TCPOBOP alene også indusert uttrykk for to tumorsuppressorgener MGMT og WT1. MGMT promoter metylering er en sterkere prognostisk faktor enn alder, stadium, og svulst klasse for hjernesvulst [39].
