Abstract
Molekylær diagnostikk av kreft hos mennesker kan øke nøyaktigheten i prognosen, forenkle valg av optimal terapeutisk regime, forbedre pasientens utfall, redusere kostnadene ved behandling og tjeneste utvikling av tilpassede tilnærminger til pasientbehandling. Videre sensitivitet og spesifisitet er fundamentale egenskapene til en hvilken som helst diagnostisk metode. Vi utviklet en svært følsom microarray for påvisning av felles KRAS og BRAF onkogene mutasjoner. I tykktarmskreft, har KRAS og BRAF-mutasjoner vist seg å identifisere en klynge av pasienter som ikke responderer på anti-EGFR terapi; identifisering av disse mutasjoner er derfor ekstremt viktig klinisk. Hvis du vil kontrollere de tekniske egenskapene til microarray system for korrekt identifisering av KRAS mutasjonsstatus på to hotspot kodon 12 og 13 og i BRAF
V600E mutasjon i kolorektal svulst, valgte vi 75 prøver som tidligere preget av konvensjonell og CO- forsterkning ved Nedre Denaturering temperatur-PCR (KOLS-PCR) etterfulgt av høy oppløsning Smelte analyse og direkte sekvensering. Blant disse prøvene, 60 ble samlet under operasjonen og umiddelbart preges RNAlater mens de 15 restene ble formalinfiksert og parafininnstøpte (FFPE) vev. Påvisningsgrensen for den foreslåtte metode var forskjellig for de 7 KRAS-mutasjoner som ble testet og for V600E BRAF mutasjoner. Spesielt har den microarray systemet har vært i stand til å detektere et minimum på omtrent 0,01% av muterte alleler i en bakgrunn av villtype-DNA. En blind validering vises fullstendig samstemmighet av resultater. Den utmerkede avtalen av resultatene viste at den nye microarray underlaget er svært spesifikk tildele riktig genotype uten berikelse strategi
Citation. Galbiati S, Damin F, Pinzani P, Mancini jeg, Vinci S, Chiari M , et al. (2013) En ny Microarray Underlag for Ultra-Sensitive Genotyping av KRAS og BRAF genvarianter i tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (3): e59939. doi: 10,1371 /journal.pone.0059939
Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, USA
mottatt: 6 juli 2012; Godkjent: 21 februar 2013; Publisert: 25 mars 2013
Copyright: © 2013 Galbiati et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Definere molekylær signatur av kreft hos mennesker kan være sentral til utviklingen av en personlig tilnærming til pasientbehandlingen. Faktisk identifisering av egnede biomarkører kan øke nøyaktigheten i prognosen, forenkle valg av optimal terapeutisk regime, forbedre pasientens utfall, og redusere kostnadene ved behandling [1]. Dermed er lagdeling av enkeltpasienter basert på molekylære og genetiske egenskaper den forventede utviklingen av moderne klinisk onkologi.
Nylig terapeutiske midler rettet mot bestemte genetiske varianter og godt karakteriserte molekylære stier har blitt utviklet. Dette er tilfellet med onkogen KRAS som er en del av signalveien av flere forskjellige molekyler. Gain-av-funksjon missense mutasjoner er ofte somatisk ervervet i kolorektal cancer, fremherskende ved tre hot spots representert ved kodon 12, 13 og 61. Dessverre, på disse nivåene antall substitusjoner er høy, noe som gjør deres deteksjon mer kompleks med allel-spesifikk teknikker. Konstitutivt, aktive mutasjoner på disse hot spot nettstedene kan bestemme motstand mot EGFR-målrettet behandling som bør ellers betydelig bedre overlevelse og livskvalitet for pasienter [2], [3], [4], [5]. Potensialet i KRAS kodon 12/13 mutasjoner som effektive molekylære markører for medikamentseleksjon har fått betydelig oppmerksomhet som fører til deres bruk i rutine behandling av pasienter med kolorektal cancer, [6]. Den europeiske helseforetaket (https://www.emea.europa.eu/pdfs/human/press/pr/27923508en.pdf.) Samt American Society for Clinical Oncology [7] og National Comprehensive Cancer Network (NCCN , https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/PDF/colon.pdf.) krever KRAS mutasjonsanalyse på tykktarmskreft før anti-EGFR terapi.
En annen lovende biomarkør av anti-EGFR motstand er representert ved BRAF
V600E mutasjon, som oppstår i omtrent 10% av kolorektal kreft. BRAF er den umiddelbare nedstrøms effektor av KRAS i Ras /Raf /MAPK-signalveien og BRAF
V600E aktivere mutasjon er gjensidig utelukkende for KRAS-mutasjoner [6]. Til tross for de for tiden begrenset data, og mangel på fullstendig enighet, er det sannsynlig at BRAF mutasjoner har en rolle i å bestemme respons til anti-EGFR-mAb-behandling, og det er forbundet med dårligere prognose, uavhengig av behandling [8], [9]. Videre kan pasienter med svulster bærer mutant BRAF også dra nytte av selektive BRAF-hemmere som PLX-4032 [10].
I dagens situasjon av screening strategier, dagens analysemetoder (konvensjonell sekvensering, pyrosekvensering, etc .) er tidkrevende, kostbart og mangler robusthet. Et annet økende problem er forbundet med den reelle følsomhet av disse fremgangsmåter for å påvise minoritets muterte alleler bare når det er tilstede i konsentrasjoner som er høyere enn 10-20%. I tidligere arbeider [11], [12], understreket vi viktigheten av følsomheten ved påvisning av minoritets muterte alleler i biologiske prøver og bekrefter anvendeligheten av KALDT-PCR for deres anrikning, særlig i prøver med lave prosenter av tumorceller. I gjennomsnitt 15% av pasientene i utgangspunktet klassifisert som negative for KRAS eller BRAF
V600E varianter ble funnet positiv etter COLD-PCR [11], [12].
Mikromatriser representere en billig og nøyaktig verktøy for parallell genotyping av flere markører, egnet for rutineanalyse innen medisinsk diagnostikk [13]. Her rapporterer vi på utviklingen av en svært følsom microarray for påvisning av KRAS og BRAF-mutasjoner. Microarray er utviklet ved bruk av et krystallinsk silisium lysbilde belagt med et termisk dyrket silisiumdioksyd (SiO
2) lag og funksjon ved adsorpsjon av en kopolymer av dimetylakrylamid (DMA), N-acryloyloxysucinimide (NAS) og meta-acryloy propyl trimetoksysilan (MAPS), kopoly (DMA-NAS-MAPS), opprinnelig utviklet for glass DNA-mikromatriser [14]. Ryggraden av polymeren består av DMA, en monomer som adsorberes til overflaten ved hjelp av hydrogenbinding; NAS er kjemisk reaktivt monomer som reagerer kovalent med bio-sonder, mens MAPS bidra til å filme stabilitet ved å kondensere med overflatesilanoler. Belegget Fremgangsmåten er enkel og reproduserbar, sammenlignet med organo-silanisering, en prosess som krever svært kontrollerte betingelser og lider av dårlig reproduserbarhet. Dette funksjonelle polymer har blitt mye brukt i biosensor feltet for bio-funksjonalisering av polystyren nanobeads [15], silisium microcantilevers [16], polydimethylsiloxane [17], og nitrocellulose [18] underlag.
Valget av silisium substrat belagt med et lag av SiO
2 av 100 nm tykkelse fører til en sterk intensivering av fluorescens på overflaten som følge av optisk konstruktiv interferens mellom de innfallende og reflekterte lys fra det fluorescerende stråling. Tilstanden til konstruktiv interferens på underlaget overflaten er oppfylt i flere typer glassplater belagt med lag av dielektrisk eller metallfilm [19]. Men strategien er involvert i å produsere slike komplekse multi-layer strukturer lider ofte lav reproduserbarhet og vanskelig prosess kontroll. Den enkleste konfigurasjon for å oppnå en fluoriserende forbedring i nærheten av det som tilbys av flerlagsglass består av silikon plane reflektor belagt med en tynn film av SiO
2 [20], [21] er foreslått av dette arbeidet.
for å evaluere tekniske forestillinger av den nyutviklede plattform og bekrefte sin evne til å korrigere genotyping av KRAS og BRAF
V600E mutasjoner i kolorektale tumorprøver, valgte vi 60 vevsprøver allerede er klassifisert for disse genetiske varianter av komplette protokoller av konvensjonell og KALDT -PCR, High Resolution Melting analyse og direkte sekvensering. Den utmerkede utfallet av resultatene vil bli diskutert for å vise fordelene og ulempene med begge teknologiene.
Materialer og metoder
Etikk
Vevsprøver ble samlet på Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi i Firenze (Italia) fra 75 pasienter som gjennomgår kirurgi for CRC i perioden 1/6 /2009-2 /5/2011. Alle personer som deltok i denne studien gitt skriftlig informert samtykke. Studien ble godkjent av gjennomgangen styret ved Universitetet i Firenze. Videre har vi brukt to cellelinjer som leveres av ATCC-LGC Standards Partnership: den CCRF-CEM cellelinje som referanse for KRAS mutasjon p.G12D (heterozygot) og den humane melanomcellelinje A375 som kilde for homozygot BRAF
V600E DNA . Den menneskelige tykktarmskreft cellelinje SW620 (brukt som referanse for KRAS mutasjon pG12V, homozygousand den menneskelige brystkreft cellelinje MCF-7 (villtype for både KRAS og BRAF gener) ble levert av Banca Biologica e Cell Factory (IRCCS Azienda Ospedaliera Universitaria San Martino -. IST Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro)
Prøvepreparering
Seksti vevsprøver ble samlet under operasjonen og umiddelbart gjennomsyret RNAlater (Qiagen Gmbh, Hilden, Tyskland) ved 4 ° C i 24 timer og deretter lagret ved -80 ° C inntil analyse. vev ble avbrutt av Tissue Lyser med rustfritt stål perler 5 mm (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. DNA rensing ble utført med Qiacube ™ og QIAamp DNA mini Kit (Qiagen )
konsentrasjonen av DNA ble bestemt med Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Thermo Scientific, DE, USA)
Videre 15 FFPE vev ble også analysert,.. DNA fra FFPE- vev ble ekstrahert bruker FFPE Tissue kit (Qiagen) etter produsentens anvisninger.
DNA-prøver ble først undersøkt ved hjelp av konvensjonell PCR og KALDT-PCR forsterkning fulgt av HRM og direkte sekvensering. Deretter ble de blindt sendt til analyse ved den nyutviklede mikromatrise enhet til asses sin evne i KRAS og BRAF-mutasjoner genotyping.
Positive kontrollprøver ble representert av DNA fra cellelinjer mutasjoner i de aktuelle genene (se forrige § etikk). Spesielt villtype og mutante prøver ble analysert separat som enkeltprøver, og som blandinger, for å få kjent andel av mutert allel (fra 6% til 0,01%) som skal brukes for bestemmelse av analysesensitiviteten for KRAS p.G12D og BRAF V600E varianter.
Videre ble plasmidic DNA inneholdende villtype-sekvenser og alternativt kan alle betraktes variantene anvendes for å oppnå rekonstituerte prøver å påvise analyse sensitivitet og spesifisitet for alle de andre KRAS-mutasjoner.
Mutagenese
Mutant-bærende plasmider ble samlet ved kloning av spesifikke Muterte PCR-produkter som bærer de syv mutasjonene som ble testet i analysen og den tilsvarende villtype-fragment. Mutageniserte fragmenter ble fremstilt ved anvendelse av en modifikasjon av den fremgangsmåte som tidligere er rapportert [22]. I korthet mutagenese ble oppnådd ved å dele hvert fragment inn i to fragmenter. 5′-fragmentet ble deretter amplifisert med det opprinnelige forover primer og en revers primer mutagenese innføre en konservativ transversjon. Parallelt ble det 3′-fragmentet amplifisert med den opprinnelige revers primer og en mutagenisert forover primer innføre den samme nukleotidvariasjon som ovenfor (se tabell S1). Dette førte til produksjon av to delvis overlappende fragmenter, som ble hver gel-eluert i et sluttvolum på 50-100 ul destillert vann for å fjerne ikke-inkorporerte primere. Vi blandet 2 ul av hver eluerte løsning sammen; hver blanding ble deretter forlenget i 15 sykluser i nærvær av PCR-reaksjonsblandingen inneholdende alle reagenser, men primere. Produktet fra reaksjon forlengelse, noe som resulterer i en full-lengde en sentral mutagenisert fragment, var ytterligere PCR-amplifisert i 20-30 cykler ved tilsetning av den fullstendige PCR-blandingen og klonet inn i plasmidvektoren (TOPO TA Cloning, Invitrogen, Life, Milano, Italia ) i henhold til produsentens protokoll. Direkte sekvensering bekreftet at det ønskede nukleotid endringen ble innført i mutagenisert styre
PCR-betingelser
Exon 2 av KRAS-genet ble amplifisert med følgende primersett:. 5′- GCC TGC TGA AAA TGA CTG AA -3 «(fremover) og 5’AGA ATG GTC CTG CAC CAG TAA-3′ (5-amino-modifisert, reverse) genererer en 167 bp fragment. Primerene anvendt for amplifikasjon av BRAF exon 15 (fragment størrelse 173 bp) var 5»-TGC TTG CTC TGA TAG AAT GAA G-3 «(fremover) og 5′- CCA CAA AAT GGA TCC AGA CA-3» (5-amino- -modifisert, omvendt).
PCR for begge genene ble utført i 25 pl reaksjon inneholdende 15 ng DNA, 200 uM av hver deoksynukleotid, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl
2, 1,5 U DNA-polymerase (AmpliTaq Gold; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og 10 pmol av hver primer. Veksling innebar en innledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, fulgt av 35 sykluser ved 95 ° C i 30 s, 58 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s, og en sluttforlengelse ved 72 ° C i 10 min .
PCR rensing
Etter amplifikasjon prosessen, hver fragment ble renset og avsaltet med bruk av en 96-brønns plate (Multiscreen-PCR-plater MANU 030) kombinert med Multiscreen separasjonssystem (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA). PCR produktene ble eluert i 35 ul 1 × utskrift buffer (150 mM natriumfosfat pH 8,5).
Reporter og stabilisator design
Journalister ble utformet i en dot-blot format med base variasjon svarende til de soner som befinner internt (tabell 1). En universell merking format ble anvendt (figur 1), basert på reportere som inneholder en sekvens-spesifikk hale som hybridiserer til universell Cy3 eller Cy5 merkede prober (vill-type probe: CTC AAT GTT CGG ACT CAG-Cy3, mutant probe: TGT CAA GCG ATA TAC TGC-Cy5) [23]
Hybridisering trinn:. 1) stabilisator oligonukleotid for å åpne den sekundære struktur av PCR-fragmentet; 2) Den «universelle reporter mix». Blandingen inneholder vill-type og mutante pressen. Hver reporter er forlenget med en hale som er komplementær til det merkede oligonukleotid universell. Cyanine 3- (Cy3) og cyanine 5- (Cy5) merket universell oligonukleotid gløding til villtype og mutant journalister, henholdsvis.
stabilisatoren (oligonukleotid nødvendig å åpne de sekundære strukturer til stede i den amplicon) og reporter utforming ble utført ved hjelp av web-frie programmer (DNAmfold server: https://www.bioinfo.rpi.edu/Ezukerm/rna og OligoAnalyzer 3.0 av Integrerte DNA Technologies: http: //www.idtdna Com) [24]. Alle journalister ble utformet ved hjelp av anti tråd som mål amplicon. Alle de 7 KRAS mutasjonene ble analysert med den samme stabilisator oligonukleotid rapportert i tabell 1. Den kodon 600 BRAF mutasjoner kreves bruk av to stabilisatorer (Stab 1: ligger ved 5 «for mutasjonen; Stab 2: ligger ved 3» for mutasjon rapportert i tabell 1).
Silicon lysbilde belegg og microarray forberedelse
Ubehandlet silisium glir 1000A Thermal Oxide (14 × 14 mm
2) ble levert av SVM, Silicon Valley Microelectronics Inc . (Santa Clara, CA USA). Silisium Glassene ble forbehandlet med 0,1 M natriumhydroksyd i 30 minutter og vasket med vann og tørket. Etter forbehandling, ble silisium lysbilder nedsenket i 30 min i en kopoly (DMA-NAS-MAPS) løsning (1% vekt /volum i 0,9 M (NH4)
2SO
4 vannoppløsning). Kopoly (DMA-NAS-MAPS) ble syntetisert og karakterisert som beskrevet [14].
Lysbilder ble til slutt skylt med vann og tørket under vakuum ved 80 ° C.
PCR produktene for hver -genet, amplifisert fra primere med en 5 «primær amino-gruppe, er nødvendig for å binde amplikonene kovalent til substratet gjennom en reaksjon mellom aminogruppene og de aktive estere av polymerbelegget, ble flekket på microarray substrater. Tre mL av amino-modifisert amplikonene ble trykt i 6 replikater ved hjelp av et piezoelektrisk spotter, SciFLEXARRAYER S5 (Scienion Tyskland), på bestrøket silisium lysbilder. En amino-modifisert oligonukleotid merket med Cy3 ble oppdaget som en posisjonell referanse i fire kolonner i hver rekke. Spotting forholdene ble utført ved som beskrevet [25]. De amplikonene ble koblet til oppstillingene ved inkubering i en avdekket oppbevaringsboks, som legges i et forseglet kammer, mettet med natriumklorid (40 g /100 ml H
2o) og inkubert ved romtemperatur over natten.
etter inkubasjon ble alle gjenværende reaktive grupper av belegget polymer blokkert ved å dyppe raset i forvarmet blokkering løsning som rapportert [25].
hybridisering
Umiddelbart før hybridisering, trykt lysbilder ble dyppet i 0,1 M NaOH i 5 minutter for å denaturere dobbelttrådet immobiliserte amplikonene, deretter skylt med vann og tørket. Sekvenser av reportere og stabilisatorer sammen med hybridiserings-temperaturer er beskrevet i tabell 1. I det første trinn ble 0,5 mL av stabilisator oligonukleotid blandet med 49,5 ul av hybridiseringsbuffer (2 x SSC, 0,1% SDS, 0,2 mg /mL BSA) opp til 1 mikrometer endelig konsentrasjon og spredt på flekket området av lysbildet. Platene ble inkubert ved 20 ° C i 30 minutter i den termomikser Comfort (Eppendorf) hybridisering kammer, og deretter vasket ved romtemperatur i en 4 x SSC-buffer for å fjerne dekkglass. Denne første vasketrinn ble etterfulgt av en kort vask (30 s) i en lav-salt-buffer (0,2 x SSC). Deretter, for påvisning av G12S, G12D, G12C, G12R, G13D KRAS mutasjoner og for BRAF
V600E mutasjoner, reporteren for villtype og muterte sekvenser og tilhørende universelle oligonukleotider merket med Cy3 og Cy5 henholdsvis ble blandet sammen i ekvimolare mengder (sluttkonsentrasjon 1 um) og tilsatt til hybridiseringsbufferen (2 x SSC, 0,1% SDS, 0,2 mg /mL BSA) (se figur 1 for analysen skjema). I tilfelle av G12A og G12V KRAS mutasjoner var det nødvendig å inkubere de amplikoner i to påfølgende trinn. I det første trinn blir amplikonene ble hybridisert med reporteren er komplementær til den muterte sekvens sammen med den tilsvarende universell oligonukleotid merket med Cy5; deretter, etter en kort vask i 4 x SSC for å fjerne dekkglass, i den andre en til amplikonene ble hybridisert med reporteren komplementær til vill-type og dens tilsvarende universell oligonukleotid merket med Cy3. Begge Inkubasjonene varte i 1 time.
Endelig er de silisiumglass ble fjernet fra kammeret hybridisering og fuktet kort i 4 x SSC-buffer for å fjerne dekkglass, vasket to ganger i 5 minutter i 2 x SSC /0,1% SDS , forvarmes ved spesifikk hybridisering temperatur, deretter dyppet, i sekvens, i en oppløsning 0,2 x SSC og 0,1 x SSC i 1 min ved romtemperatur, ble tørket ved sentrifugering ved 780 rpm i 3 min og skannet.
Bilde skanning og dataanalyse
ProScanArray (Perkin Elmer, MA, USA) ble brukt til å skanne hybridiserte lysbilder. Spesielt en grønn laser (λ
ex 543 nm /λ
em 570 nm) for Cy3 fargestoff og en rød laser (λ
ex 633 nm /λ
em 670 nm) for Cy5 fargestoff ble brukt. Fotomultiplikatoren (PMT) rør forsterkning og lasereffekt endret mellom fluorokromer og forskjellige eksperimenter. 16-bits TIFF-bilder ble analysert ved 5 mikrometer oppløsning. Data intensiteter ble ekstrahert med skannerprogramvaren og ble utført dataanalysen for hvert forsøk som tidligere beskrevet [25].
Konvensjonell og KALDT-PCR forsterkning fulgt av High Resolution Melting (HRM) og direkte sekvense
Konvensjonell PCR, COLD-PCR, HRM og sekvense protokoller er allerede beskrevet [11], [26].
Resultater
1) Konvensjonell og KALDT-PCR forsterkning HRM og sekvense resultater
i utgangspunktet alle de 75 prøvene ble undersøkt for forskning av KRAS-mutasjoner og BRAF
V600E av HRM og sekvensering. I en andre fase, ble samtlige prøver (muterte og vill-type) sendt inn til en fullstendig screening ved hjelp av kald-PCR amplifikasjon fulgt av HRM og sekvensering som allerede rapportert [11].
globalt, 59 av 75 prøver inneholdt alternativt en mutasjon enten på KRAS hotspots eller BRAF
V600E variant, mens 16 ble klassifisert som villtype prøver og inkludert som negative kontroller. Det er viktig å merke seg at i 9/59 mutert prøver, identifikasjonen av basesubstitusjon ble bare gjort mulig gjennom bruk av raske eller full kald PCR protokoller, sannsynligvis på grunn av lavere prosenter av muterte alleler i utgangsprøvene. Disse prøver ble appositely innført i validerings studien for å teste følsomheten av den foreslåtte plattformen. For en detaljert beskrivelse av fordelingen av KRAS og BRAF varianter i våre prøver, se tabell 2.
2) Optimalisering av silisium lysbilde analyse
Wild-type kontrollprøver og rekonstituert heterozygot kontroll prøvene (som ble generert ved bruk av riktig blanding plasmidic DNA inneholdende villtype og muterte sekvenser av alle 7 KRAS mutasjoner og i BRAF
V600E variant) ble anvendt for å teste analysens spesifisitet. Etter optimalisering av temperatur og hybridisering periode ble en korrekt identifikasjon av alle genotyper oppnådd. Et eksempel er vist på figurene 2 og 3 hvor et hybridisering eksperiment for G12R KRAS og BRAF
V600E mutasjon er vist, henholdsvis. I optimalisert system, for alle de analyserte mutasjonene kan vi bevis for at: i) fluorescente signalene var høy, ii) ingen kryss-hybridisering ble oppnådd, selv om varianter som påvirker de samme eller tilstøtende nukleotid posisjoner (figur 2D), og iii) et god reproduserbarhet fra sted til sted (vist ved feilfelt) ble funnet.
(A) microarray avsøkning av Cy3 fluorescens signal i samsvar med villtype-allelet. Spots i kolonne 1,2,3,4 representerer amino-modifisert oligonukleotid merket med Cy3 brukt som referanse flekker. (B) skanning av Cy5 fluorescens signal som svarer til det muterte allel. (C) microarray spotting ordningen. wt: wild-type kontrollprøver; Het1, Het2 og Het3: heterozygote kontrollprøver for G12A, G12C, G12R, G12S, G12V, G13D; G12D KRAS-mutasjoner; lys grå firkanter representerer amino-modifisert oligonukleotid merket med Cy3 brukt som referanse flekker. (D) normalisert relativ fluorescens intensitet etter hybridisering av kjente kontrollprøver med reportere komplementære til den G12R variasjon. Barer er gjennomsnittet av intensiteten av 6 replikater av hver prøve. Feilstolpene er standardavvikene til den fluorescens-intensiteten for hver prøve.
(A) Cy3 fluorescens signal tilsvarende villtype-allelet. Spots i kolonne 1,2,3,4 representerer amino-modifisert oligonukleotid merket med Cy3 brukt som referanse flekker. (B) Cy5 fluorescens signal tilsvarende den muterte allel. (C) microarray spotting ordningen. wt: wild-type kontrollprøver; Het1, Het2 og Het3: heterozygote kontrollprøver; mut: homozygot mutant kontrollprøve; lys grå firkanter representerer amino-modifisert oligonukleotid merket med Cy3 brukt som referanse flekker. (D) normalisert relativ fluorescens intensitet etter hybridisering av kjente kontrollprøver med reportere komplementære til den V600E BRAF variasjon. Barer er gjennomsnittet av intensiteten av 6 replikater av hver prøve. Feilstolpene er standardavvikene fluorescens intensitet av hver prøve.
3) Følsomhet for analysen
Følsomhet for analysen i diskriminerende ulike andeler av muterte alleler ble evaluert på seriefortynninger (6%, 3%, 1,6%, 0,8%, 0,4%, 0,2%, 0,1%, 0,05%, 0,02%, 0,01% muterte /vill-type) av mutert DNA opportunely blandet med vill skriver DNA. Spesielt brukte vi CCRF-CEM cellelinje som referanse for KRAS mutasjon p.G12D (heterozygot), human colorectal carcinoma cellelinje SW620 (anvendt som referanse for KRAS mutasjon pG12V, homozygot), og det humane melanoma-cellelinjer A375 (brukt som kilden til homozygot BRAF
V600E DNA). Den humane brystkreftcellelinje MCF-7 ble anvendt som villtype for både KRAS og BRAF gener. For alle de andre KRAS-mutasjoner vi brukte den muterte bærende plasmider som genereres.
deteksjonsgrensen for den foreslåtte metoden var forskjellig for de 7 KRAS-mutasjoner testet og for V600E BRAF mutasjon. Spesielt har den microarray systemet har vært i stand til å detektere et minimum på omtrent 0,01% av muterte alleler i en bakgrunn av villtype-DNA for G13D-mutasjon, omtrent 0,025% av mutert allel for den G12R mutasjonen, 0,05% for G12C mutasjonen , 0,1% for G12D-mutasjon, 0,2% for V600E BRAF mutasjoner, 0,4% for G12A og G12S mutasjoner og 0,8% for henholdsvis G12V. I figur 4 to eksempler på de resultater som ble oppnådd for den G13D KRAS mutasjon og for BRAF
V600E mutasjon er vist.
påvisningsgrensen for G13D-mutasjon (A) og av den V600E BRAF mutasjoner (B) . wt: wild-type kontrollprøver; Het1, Het2 og Het3: heterozygote kontrollprøver; tall fra 1 til 10: serielle fortynninger, 1 = 6%, 2 = 3%, 3 = 1,6%, 4 = 0,8%, 5 = 0,4%, 6 = 0,2%, 7 = 0,1%, 8 = 0,05%, 9 = 0,02%, 10 = 0,01% henholdsvis. Barer er gjennomsnittet av intensiteten av 6 replikater av hver prøve. Feilstolpene er standardavvikene fluorescens intensitet av hver prøve.
4) Blind validering
Analyse validering ble utført på en blindet måte ved å analysere 75 prøver fra fagene enten positiv eller vill-type for KRAS og BRAF-mutasjoner, som tidligere preget av HRM og direkte sekvensering. Som et eksempel, blir de mikroarray resultatene for G12C KRAS mutasjon og for BRAF
V600E mutasjon for frosne vev er vist i figurene 5 og 6, respektivt. Videre i figur 7 og 8 microarray resultater for G12R KRAS mutasjon og for BRAF
V600E mutasjon i FFPE- prøvene er vist henholdsvis. Systemet var meget spesifikke i tildeler den riktige genotypen til alle prøver. Blind validering vises fullstendig samstemmighet av resultatene (tabell 2) med den forventede unntak av prøvene n.31 og n.40, bærer p.G13C og p.V14I KRAS varianter, som ble uttrykkelig innført for å teste spesifisitet av den nyutviklede prober (se tabell 2).
(A) Cy5 fluorescens signal tilsvarende den muterte allel. (B) spotting ordningen. wt: wild-type kontrollprøver; Het1, Het2 og Het3: heterozygote kontrollprøver for G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G13D, G12V KRAS-mutasjoner; tall fra 1 til 60: seksti forskjellige solide svulst DNA-prøver. Grey markører representerer prøvene positive for G12C mutasjon; lys grå firkanter representerer en amino-modifisert oligonukleotid merket med Cy3 brukt som referanse flekker. (C) HRM analyse av prøven nummer 30 (nummer 2) sammenlignet med smelte profiler av kontrollprøver (villtype referanse = nummer 1; mutert referanse = nummer 3) etter forsterkning av COLD-PCR: smelteegenskapene er tankevekkende for tilstedeværelsen av mutert DNA i prøven. (D) direkte sekvensering analyse av prøvenummer 30 legges COLD-PCR amplifikasjonsprotokoll: den elektroferogrammet bekrefter tilstedeværelsen av mutert DNA (G12C) i prøven
(A) Cy3 fluorescens signal tilsvarende. villtype-allelet. Spots i kolonne 1,2,3,4 representerer amino-modifisert oligonukleotid merket med Cy3 brukt som referanse flekker. (B) Cy5 fluorescens signal tilsvarende den muterte allel. (C) spotting ordningen. wt: wild-type kontrollprøver; BRAF Het1, Het2 og Het3: heterozygote kontrollprøver; mut: homozygot mutant kontrollprøve; tall fra 1 til 60: seksti forskjellige solide tumorprøver. Grey markører representerer prøvene positive for BRAF mutasjon; lysegrå kvadrater representerer et amino-modifisert oligonukleotid merket med Cy3 brukt som referanse flekker.
(A) Cy3 fluorescens signal tilsvarende villtype-allelet. Spots i kolonne 1,2,3,4 representerer amino-modifisert oligonukleotid merket med Cy3 brukt som referanse flekker. (B) Cy5 fluorescens signal tilsvarende den muterte allel. (C) spotting ordningen. wt: wild-type kontrollprøver; het: heterozygote kontrollprøver for G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13D, KRAS-mutasjoner; tall fra 1 til 15: femten forskjellige FFPE- solid svulst DNA-prøver. Grey markører representerer prøvene positive for G12R mutasjon; lys grå firkanter representerer en amino-modifisert oligonukleotid merket med Cy3 brukt som referanse flekker. (D) Relativ fluorescensintensitet for detektering av sensitiviteten til systemet evaluert for G12R mutasjonen. wt: wild-type kontrollprøver; het: heterozygote kontrollprøver; tall fra 1 til 15: FFPE-prøver. Barer er gjennomsnittet av intensiteten av 6 replikater av hver prøve. Feilstolpene er standardavvikene til den fluorescens-intensiteten for hver prøve.
(A) Cy3 fluorescens signal tilsvarende villtype-allelet. Spots i kolonne 1,2,3,4 representerer amino-modifisert oligonukleotid merket med Cy3 brukt som referanse flekker. (B) Cy5 fluorescens signal tilsvarende den muterte allel. (C) spotting ordningen. wt: wild-type kontrollprøver; BRAF Het1, Het2: heterozygot kontrollprøver; BRAF Mut1, Mut2: homozygot mutant kontrollprøve; tall fra 1 til 15: femten forskjellige FFPE- solid svulst DNA-prøver. Grey markører representerer prøvene positive for BRAF mutasjon; lys grå firkanter representerer en amino-modifisert oligonukleotid merket med Cy3 brukt som referanse flekker. (D) Relativ fluorescensintensitet for detektering av sensitiviteten til systemet undersøkt ved V600E BRAF mutasjoner. wt: wild-type kontrollprøver; het: heterozygote kontrollprøver; tall fra 1 til 15: FFPE-prøver. Barer er gjennomsnittet av intensiteten av 6 replikater av hver prøve. Feilstolpene er standardavvikene fluorescens intensitet av hver prøve.
Diskusjoner
Følsomhet og spesifisitet er grunnleggende egenskapene til noen diagnostisk metode. Svært sensitive analyser, i stand til å detektere små mengder av stoffet under etterforskning, kan åpne nye muligheter i flere kliniske applikasjoner. Spesielt identifisering av minoritets muterte alleler i et overskudd av villtype-allel som representerer et vanlig problem i analysen av cancer DNA, er teknisk meget krevende, og krever bruk av svært følsomme teknikker.
Innenfor denne
