Abstract
Side befolkningen (SP) celler har blitt rapportert å ha egenskaper av kreft stamceller lignende celler (cscs) i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), men deres molekylære funksjoner har ikke vært fullt belyst. Her viser vi at NSCLC-SP celler ble beriket i G
0 /G
en fase av cellesyklus, hadde høyere aldehyd dehydrogenase aktivitet samt høyere klonogene og selvfornyende evne i forhold til hoved befolkningen (MP) celler. Interessant, SP celler var også i stand til å trans differensiere i angiogene tubuli
in vitro Hotell og var svært tumorigent i forhold til MP celler. SP-deriverte svulster viste intratumoral heterogenitet bestående av både SP og MP celler, noe som tyder på selvfornyelse og differensiering evne SP celler er manifestert
in vivo
også. βArrestin-en (βArr1) er involvert i utviklingen av ulike kreftformer, inkludert NSCLCs og vi finner at uttømming av βArr1 betydelig blokkert SP fenotype; mens uttømming av βArr2 hadde relativt små effekter. Ektopisk uttrykk for βArr1 resulterte i økt SP frekvens og ABCG2 uttrykk mens oppheving av βArr1 uttrykk trykkes den selvfornyelse vekst og utvidelse av A549 celler. Anti-apoptotiske protein Mcl-1 er kjent for å være en av de viktigste regulatorer av selvfornyelse av vev stamceller og er antatt å bidra til overlevelse av NSCLC-celler. Våre eksperimenter viser at høyere nivåer av Mcl-1 ble uttrykt i SP-celler sammenlignet med MP-celler på begge transkripsjonelle og translasjonelle nivåer. I tillegg kunne Obatoclax, et farmakologisk inhibitor av Mcl-1, effektivt hindre selvfornyelse av både EGFR-inhibitor sensitive og resistente NSCLC-celler. I konklusjonen, våre funn tyder på at βArr1 og Mcl-en er involvert i selvfornyelse og utvidelse av NSCLC-cscs og er potensielle mål for anti-kreft terapi
Citation. Singh S, Bora-Singhal N , Kroeger J, Laklai H, Chellappan SP (2013) βArrestin-en og Mcl-en modulere selvfornyelse veksten av kreft Stem-Like Side-Befolknings celler i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (2): e55982. doi: 10,1371 /journal.pone.0055982
Redaktør: Ming Tan, University of South Alabama, USA
mottatt: 10 september 2012; Godkjent: 04.01.2013; Publisert: 13. februar 2013
Copyright: © 2013 Singh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av tilskuddet CA127725 fra National Cancer Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Srikumar P. Chellappan er en akademisk redaktør for PLoS ONE; Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Til tross for betydelige terapeutiske fremskritt, forårsaker lungekreft maksimalt antall kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis [1 ], [2]. Ifølge Verdens helseorganisasjon (WHO), vil lungekreft føre til om lag 2,5 millioner dødsfall per år innen år 2030 [3]. I USA, ca 85% av pasientene med diagnosen NSCLCs, dø av sykdommen i løpet av fem år [4], [5]. Disse fakta markere et behov for bedre forståelse av de cellulære og molekylære hendelser som ligger bak tilblivelsen av denne sykdommen for utvikling av mer effektive behandlingsformer. Cancer stamcelle modell har dukket opp som en levedyktig forklaring for initiering og progresjon av aggressiv kreft som NSCLCs og er potensielle terapeutiske mål [6], [7], [8], [9], [10].
Kreft stamcelle modell antyder at en undergruppe av celler betegnes som kreft stamceller lignende celler (cscs) i svulsten har deregulerte egenskapene til normale stamceller med vedvarende selvfornyelse, og kan generere sekundære svulster som rekapitulere heterogenitet og mangfold av opprinnelig tumor [9], [11], [12], [13], [14], [15]. Hoechst 33342 fargestoff eksklusiv-celler, kalt side-populasjon (SP) celler, er blitt beskrevet å ha CSC lignende egenskaper i en rekke tumorer, inkludert NSCLCs [16], hvor de vises økte tumorgenisitet når transplantert inn i immunkompromitterte mus [17], [ ,,,0],18] i forhold til hovedpopulasjonen (MP). SP fenotype er avhengig av differensial evnen til cellene til dyseutstrømningen Hoechst 33342 fargestoff via den ATP-bindende kassett (ABC) familie av transportørproteiner, hovedsakelig ABCG2 (også kjent som brystkreft motstand protein, BRCP1), som er spesielt uttrykt i cellemembranen av stamcellepopulasjoner [19]. Tidligere studier har demonstrert eksistensen av SP-celler i visse etablerte humane NSCLC-cellelinjer [16] forblir imidlertid deres detaljert molekylær karakterisering så vel som funksjonelle evne til å generere heterogene tumorer å bli klarlagt. I denne studien, gir vi omfattende bevis for at SP celler isolert fra etablerte menneske NSCLC cellelinjer og svulster er høyanriket med NSCLC-cscs. I tillegg finner vi at ALDH1, som har blitt identifisert som en markør fra andre typer svulster for CSC, er beriket i SP celler fra NSCLC. Vår molekylAnalyser viser at stamcellelignende egenskaper med SP-cellene styres i det minste delvis av stillaset protein, β-arrestin-1; i tillegg spiller overlevelsen protein Mcl-1 en rolle i den selvfornyelse av disse cellene. Dermed ser det ut til at målretting β-arrestin-en eller Mcl1 kan være levedyktig middel for å hemme stamcellelignende egenskaper SP celler fra NSCLC.
Materialer og metoder
Cellelinjer og reagenser
ikke-småcellet lungekreft adenokarsinom cellelinjer, A549, ble H1650, H460 og H1975 innhentet fra ATCC og vedlikeholdes i RPMI eller DMEM containing10% føtalt bovint serum (FBS, Mediatech) i 5% CO
2 ved 37 ° C. Selv om disse cellelinjene opprinnelig ble kjøpt fra ATCC, hadde vi ikke forlenge dem. Fumitremorgin C (FTC) ble kjøpt fra Sigma Inc og Obatoclax ble kjøpt fra Selleck Chemicals LLC.
RNA Utarbeidelse og Real Time qPCR analyse
RNA ekstraksjon og cDNA forberedelse ble fulgt som beskrevet tidligere [20 ], [21], [22]. Real-time PCR ble utført med en mL av cDNA i en MyiQ real-time PCR deteksjon system (Bio-Rad) ved hjelp iQ SYBR Grønn PCR Supermix (Bio-Rad) i henhold til produsentens retningslinjer. Brett inductions ble beregnet ved hjelp av formelen 2
– (ΔΔCt) bruker GAPDH som intern kontroll genet. Den genspesifikke primer-par var som følger. CD31 (F) 5′- CCTGACAGTGTCTTGAGTGGGTG -3 «, CD31 (R) 5′- AGTGATTTTGGCTAGGCGTGGT -3′; βArr1 (F) 5»- AGAGTCTATGTGACGCTGACCTGC -3 «, βArr1 (R) 5′- GTTCCTGCAGCCGCGTCAG -3′, Mcl-1 (F) 5»- ATGCTTCGGAAACTGGACAT -3 «, Mcl-1 (R) 5»- -3 TCCTGATGCCACCTTCTAGG «, GAPDH (F) 5′-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3′, GAPDH (R) 5»-GTT GCT GTA GCC AAA TTC GTT GT-3 «.
Western blot analyse
Lysater fra sortert SP og MP-celler ble fremstilt ved å NP40 lysering som tidligere beskrevet [20]. I korte trekk, ble sorterte cellene vasket to ganger med iskald PBS. Cellene ble sentrifugert ved 800
g
og lysert ved hjelp av M2 lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 3 mM EGTA, og 3 mM EDTA) inneholdende protease inhibitorer. Like mengder av proteiner (50 ug) ble separert på SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad), blokkert med 5% fettfri tørrmelk i PBS inneholdende 0,1% Tween-20 og inkubert med de passende primære antistoffer. Monoklonale antistoffer mot ABCG2 og βArr1 ble kjøpt fra Millipore og polyklonale antistoff mot E2F1 og Mcl1 ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology Inc.
Hoechst 33342 Dye utstrømning analyse for SP analyse og celle Sortering
heftende celler ble høstet ved hjelp accutase reagens (Sigma Inc). For tumor eksplantater ble det primære humane tumorvev dyrket i atymiske nakne mus hakket, enzymatisk spaltet med 0,2% kollagenase IV (Worthington Biochemical Corporation) fremstilt i 10% FBS inneholdende medium i 60 minutter ved 37 ° C. Digestionen ble ytterligere inndelt ved å passere gjennom 10 ml pipette flere ganger, og ble filtrert gjennom 100/70-mikrometer celle sil for å oppnå en enkel cellesuspensjon. Cellene ble vasket og resuspendert i DMEM /F12K med 2% FBS ved 1 x 10
6 celler /ml tetthet og inkubert med 4 ug /ml Hoechst 33342 fargestoff (Invitrogen) i 90 minutter ved 37 ° C i nærvær eller fravær av 1 uM FTC, som beskrevet av Goodell et al. [23]. Celler ble inkubert med 2 ug /ml propidiumjodid (PI; Sigma Inc.) før analyse for å visualisere og inkluderer alle de ikke-levedyktige celler. Den Hoechst 33342 fargestoff ble eksitert ved 350 nm ved hjelp av UV laser og dets fluorescens ble analysert ved hjelp av 400-500 nm BP filter for blå utslipp og 640-680 nm BP filter i kombinasjon med 655 nm LP-filter for rød utslipp. Flowcytometere fra BD Biosciences ble brukt for datainnsamling. Data ble anskaffet ved hjelp LSRII eller FACS Vantage (DiVa), og sortert ved hjelp av FACS Vantage (DiVa) celle sorter. Data analyser ble gjort ved hjelp av FlowJo programvare (Tre stjerne).
Aldefluor analysen
Aldefluor kit ble brukt til å profilere og separate celler med høy Aldh aktivitet i henhold til instruksjon av produsenten (Stem Cell Technologies). Kort sagt ble Hoechst 33342 fargede celler inkubert med Aldh proteinsubstrat BODIPY-aminoacetaldehyd (BAAA) i Aldefluor analysebuffer supplert med 1 uM FTC for å forhindre utstrømningen av Hoechst fargestoff. Etter 45 minutters inkubering ved 37 ° C, ble celler som kan konvertere BAAA til sin fluorescerende produkt BODIPY-aminoacetat (BAA) som anses å Aldh-Hi. Portene for flowcytometrisk analyse ble trukket i forhold til grunnlinjen fluorescens, som ble bestemt ved tilsetning av Aldh-spesifikk hemmer diethylaminobenzaldehyde (DEAB). Prøvene som ble behandlet med DEAB alene tjente som negativ kontroll.
Sphere Dannelse eller selvfornyelse analysen
Ordnet SP eller MP celler ble sådd ut i ultra-lav adhesjon 96 brønners plater (Corning) ved tetthet på 10.000 celler /ml (1000 celler /brønn i 100 ul medium) i serumfritt DMEM /F12K (1:1) (Invitrogen), supplert med 1 x-N2-supplement (Invitrogen), 10 ng /ml EGF og 10 ng /ml bFGF (Sigma) og fikk vokse i 10 dager. Bilder fra kulene ble tatt ved hjelp av fasekontrast-mikroskop (Nikon) og totalt antall sfærer mer enn 60 um ble tellet. For å studere effekten av medikamenter på den selvfornyelse av SP-celler, ble legemidler tilsatt til de respektive brønner på dag 1 og 5 og størrelse (mer enn 60 um) og antall av kulene ble analysert på dag 10.
In vivo
svulstdannelse analysen.
5-uker gamle kvinnelige SCID-beige mus ble brukt for disse eksperimentene henhold en protokoll som ble godkjent av Institutional Animal bruk og vedlikehold Utvalget ved University of South Florida (Animal Welfare Assurance Antall A4100-01). Sortert SP eller MP-celler fra H1650 cellelinjen ble vasket med serumfritt DMEM-F12K og suspenderes i en 01:01 blanding av vekstfaktor redusert Matrigel (BD) og HBSS ved indikerte tall og implantert subkutant. Tumorvolumer ble bestemt en gang i uken ved å måle lengden (
L
) og bredde (
W
), og volumet beregnes med formelen
V =
1/2 ×
L
×
W
2as beskrevet tidligere [21], [22], [24], [25]. Den helsetilstanden til mus ble overvåket daglig for tegn på ubehag, inkludert inaktivitet, hypoaktivitet, hyperaktivitet, rastløshet, selv traumer, aggressivitet, isolasjon fra bur kamerater, ataksi, grunne, rask og /eller anstrengt pust, bleke slimhinner, cyanose , unnlatelse av å stelle, kakeksi, skittent anogenital området, unnlatelse av å svare på stimuli, mangel på nysgjerrighet, stemmebruk, ascites, og /eller krum holdning. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse. Ved slutten av forsøket blir dyrene avlivet ved å utsettes for økende konsentrasjoner av CO
2 i en egen CO
2 kammeret; komprimert gass ble anvendt en kilde for CO
2.
statistiske metoder
Data ble presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD). For å vurdere statistisk signifikans av forskjeller, ble student
t
test utført. Alle de statistiske analysene ble utført ved hjelp av Microsoft Excel-programvare. Dataene ble ansett som statistisk signifikant når
p
verdien var mindre enn 0,05.
Resultater
SP Celler fra NSCLC Demonstrer Stem Cell-lignende egenskaper
forsøk ble gjort for å vurdere den prosentandel av SP-celler i fire forskjellige humane NSCLC-cellelinjer, valgt på basis av K-Ras eller EGFR mutasjonstatus. A549 (K-Ras mutant; villtype EGFR forsterkning) og H460 (K-Ras mutant) samt H1650 (EGFR mutante; Exon 20 delesjon: delE746-A750) og H1975 (EGFR mutant, L858R og T790M-mutasjoner) celler inneholdt SP -cellene med varierende frekvens i området fra omtrent 8% (H1975) til 40% (H460). En spesifikk inhibitor av ABCG2 [26], Fumitremorgin C (FTC) kunne hindre forekomsten av SP-celler (figur 1A), noe som tyder på at denne spesielle transporter spiller en spesifikk rolle i å opprettholde SP fenotype. Disse resultatene tyder på at SP-celler er til stede i NSCLC-linjer, og deres utbredelse er uavhengig av K-Ras eller EGFR mutasjonstatus.
(A) FACS-analyse på enkeltcellesuspensjon av humane NSCLC-cellelinjer farget med Hoechst 33342 dye viser SP celler. SP-cellene er omsluttet innenfor området avgrenset i rosa. Fumitremorgin C inhiberte utstrømning av fargestoff og forårsaket forsvinning av SP-celler. Hyppigheten av SP-celler er representert. (B, C) cellesyklusanalyse ved hjelp av område-histogram parameter for den blå emisjon av Hoechst 33342 som beskrevet i teksten. Profilen vist i B er representant for alle de fire cellelinjer. (D) Aldefluor analysen på Hoechst 33342 farget H1975 og H1650 celler. Grunnlinjen fluorescens ble etablert ved å inhibere ALDH-aktivitet med DEAB (venstre) for å generere porten for å identifisere ALDH-Hi-celler i total samt SP og MP-celler som ikke er inkubert med DEAB (tre høyre panel). Alle ALDH-Hi-celler er omsluttet innenfor området avgrenset i rosa. Den ganger forskjell i frekvens av ALDH-Hi celler mellom SP og MP-celler er plottet.
Det er blitt foreslått at den normale vev stamceller og stilk-lignende tumorceller initiere har forskjellige cellesyklusprofiler sammenlignet differensierte celler, og de går gjennom cellesyklusen tregere [27], [28]. Med dette som bakgrunn har vi gjort forsøk på å undersøke hvorvidt cellesyklusen profilen til SP celler skilte seg fra de differensierte MP celler. For å undersøke cellesyklusfordeling, ble histogrammet profilen genereres fra området parameter for blå emisjon av Hoechst 33342 anvendes for å undersøke cellesyklusen fasefordelingen for SP og MP-celler. Siden FTC behandling gjør at både SP og MP celler til å beholde Hoechst 33342 fargestoff, ble denne prøven brukes til å markere grensene for G
1 og S-G
2 /M faser, basert på deres DNA-innhold. Lignende portene ble søkt om prøvene der FTC ikke ble lagt, og dermed SP celler dukket opp som en sub-G
0 /G
1 befolkningen (figur 1B). Ved sammenligning av fordelingen av FTC behandlede og ubehandlede celler, ble det funnet at 80-100% av SP-celler var i G
0 /G
en fase av cellesyklusen, avhengig av cellelinjen (figur 1C). I alle tilfeller, SP-celler hadde mer G
0 /G
1 celler enn MP celler fra den samme cellelinje, noe som tyder på at de har dempet cellesyklusprogresjon karakteristisk for stilk-lignende celler.
eksperimenter ble utført for å undersøke hvorvidt andre kreftstamcelle markører uttrykkes på SP-celler. Mot dette formål, flow cytometri ble utført for aktiviteten av aldehyddehydrogenase (Aldh-Hi) som nylig har blitt brukt som en potensiell markør for å identifisere cscs i NSCLCs [29], [30]. Analyse ved hjelp av Aldefluor analysesett på H1650 og H1975 cellelinjer viste 8 og 6 ganger høyere frekvens av Aldh-Hi-celler i SP-celler sammenlignet med MP-celler, noe som tyder på at SP-celler isolert fra NSCLC-cellelinjer er anriket på stammen lignende celler (figur 1 D), som vist ved ekspresjon av en annen markør. Totalt sett, ca 1,3% av H1650-SP celler og 2% av H1975-SP celler Aldh-Hi-celler.
SP Cells Vis Stem Cell-lignende egenskaper
in vitro
In vitro
eksperimenter ble utført for ytterligere å karakterisere SP og MP-celler. Ved cellesortering, ble cellene sådd ut i høy tetthet (10.000 celler /brønn i 96-brønners plate) i fullstendig media og overvåket i 6 dager ved MTT-analyse. H1650-SP og MP-celler hadde sammenlignbare spredningskapasitet når dyrket i komplett medium i henhold til adherente betingelser (figur 2A), noe som tyder på at både de sorterte cellefraksjoner er like friske og Hoechst 33342 fargestoff farging for SP analyse og cellesortering protokollen ikke hadde noen skadelig virkning på disse cellene. Et karakteristisk trekk ved stamceller er deres evne til å fornye seg selv og også for å gi opphav til mer differensierte celler, ved asymmetrisk divisjon [15]. Selv fornye normal eller kreft-stammen som cellene kan vokse som ikke-heftende kuler når de dyrkes ved lav tetthet i serum gratis, stamcelle selektivt medium; differensierte celler ikke vokse eller danne kuler i dette medium [13], [31], [32]. Den selvfornyelse tilhører SP celler ble undersøkt ved å utføre sfære formasjon analyse ved hjelp av SP og MP celler isolert fra H1650 celler. Mens SP-celler var i stand til å vokse som sfærer, MP-celler hadde en betydelig dårligere evne til å vokse under lignende betingelser (figur 2B) som tyder på at selvfornyelse evne karakteristisk for stamceller vises bare ved SP-celler. Vi undersøkte klonogene potensialet i både SP og MP celler ved plating av cellene og dyrking ved klonal tetthet (1000 celle i 60 mm plate) i 21 dager i FBS inneholdende media. I dette panelet, blir cellene sådd ut i meget lav tetthet, og deres langsiktige spredning og kolonidannende evne ble kontrollert. Som vist i figur 2C, dannelse av store kolonier var betydelig større hos SP-celler enn det var blant MP-celler. Den levedyktighet av kolonidannende celler ble bestemt ved MTT-analyse (figur 2D), kollektivt og gir bevis for at SP celler displayet økt clonogenicity.
(A) Vekstkurve på 10.000 H1650-SP eller MP celler ble generert ved hjelp av MTT assay celleproliferasjon i vanlig dyrkningsmedium [22]. (B) SP eller MP-celler fra H1650 cellelinjen ble platet i serumfritt medium supplert med EGF og bFGF i 10 dager. Gjennomsnittet (± SD) antall sfærer fra 1000-celler er plottet. (C) H1650-SP-celler resulterte i større og flere kolonier sammenlignet med MP-celler når sådd ut med en tetthet på 1000 celler pr 60 mm skål. (D) Cellenes levedyktighet ble analysert etter 21 dagers plette via MTT-analyse. (E) SP eller MP-celler ble sådd ut på Matrigel og dyrket i endotelial vekstmedium (Lonza) over natten. SP celler ga opphav til angiogene som tubuli effektivt. (F) Real time qPCR analyse på SP og MP celler utført for
CD31
mRNA uttrykk. (G) CD31 ekspresjon på angiogene rørelementer som visualisert ved immunofluorescens.
Visse typer av tumorer har blitt rapportert å demonstrere vaskulær mimikk, på grunn av evnen av tumorceller for å skaffe egenskapene til endoteliale celler og andre cellulære komponenter i det vaskulære karet [33], [34], [35]. Rollen til kreftstamceller i denne sammenheng har blitt undersøkt, og de siste bevisene tyder på at cscs fra hjernesvulst kan trans-differensiere i endothelial avstamning [33], [34], [35]. Med dette som bakgrunn, undersøkte vi kapasiteten på H1650 SP celler til å danne angiogene tubuli
in vitro
. H1650-SP celler belagt på matrigel dannet et nettverk av angiogene tubuli ved behandling med VEGF, mens MP celler ble betydelig svekket i denne evnen (figur 2E). Det ble funnet at MP-celler holdt seg relativt uorganisert, sammenlignet med den organiserte tubuli lignende strukturer som er dannet av SP-celler. Eksperimenter ble utført for å vurdere om tubule lignende strukturer dannet av SP celler vise biokjemiske funksjoner i angiogene fartøy. For dette formål blir en real-time PCR-analyse ble utført først, noe som viste en høyere ekspresjon av endotelial spesifikk
CD31
mRNA i SP-celler sammenlignet med MP-celler (figur 2f). Videre er immunofluorescens farging av rørelementene viste at disse rørelementer dannet av SP-celler sterkt positive for CD31 ekspresjon (figur 2G), som tyder på at SP-celler kan oppnå en endothelial avstamning. Disse eksperimentene fråtset at SP celler isolert fra en NSCLC cellelinje kan transdifferentiate inn endothelial-lignende celler og kan være i stand til å gi opphav til angiogene tubuli i svulstene.
SP Cellene Beriket med Svulstfremkallende Cells og Demonstrert Self fornyelse og Differensiering av SP Cells
in vivo
Gitt muligheten for SP celler til selv fornye og differensiere til angiogene tubuli samt MP celler, vi neste undersøkt muligheten for SP eller MP celler å danne svulster i SCID-mus. SP og MP celler fra H1650 cellelinje ble implantert subkutant på rygg flankene av SCID-mus og tumorvekst vurderes ukentlig av caliper målinger. Som vist i figur 3A, fire mus (n = 5) injisert med SP 10.000 celler produserte store tumorer (volum ~1400 mm
3) i løpet av 11 uker etter implantasjon. Men tilsvarende antall MP-celler ble betydelig svekket i deres evne til å danne svulster i løpet av den samme tidsrammen; tumorene var forholdsvis mindre og holdt seg nær det implanterte størrelse (volume~100 mm
3) (figur 3B). Videre SP celler dannes svulster selv med 1000 celler (volum ~471 ± 141 mm
3) etter 19 uker med implantasjon, mens tilsvarende antall MP celler ble ikke klarte å generere noen tumorer (figur 3A).
(A) Ordnet SP og MP celler fra H1650 cellelinje ble implantert i flankene av SCID-mus. Tumor forekomst og gjennomsnittlig volum (± standardfeil) av svulstene dannet innen den angitte tiden er ordnet. (B) Vekstkinetikk av svulster fra SP og MP celler, målt ukentlig. Punktene representerer gjennomsnittet (± standard feil). (C) subkutane tumorer avledet fra 10.000 H1650-SP-celler eller 100000 H1650-MP-celler ble resekterte og analysert for SP fenotype i nærvær eller fravær av FTC. Svulster fra SP og MP cellene inneholdt hovedsakelig differensierte MP celler.
For å belyse hvorvidt svulster generert fra SP celler hadde heterogen SP og MP-celler ble utført Hoechst 33342 farging og SP-analyse etter enzymatisk dissosiasjon av subkutan svulst xenografter. Svulster generert fra 10.000 H1650-SP celler ble i hovedsak består av MP-celler, mens SP celler ble opprettholdt på ca 3% frekvens innen svulsten (figur 3C, øvre panel). Disse resultatene indikerer at SP celler er svært beriket med cscs som er i stand til gi opphav til svulster samt fornye seg selv og skille seg
in vivo
. Men svulster generert i en mus (av tre) ved implantering på 100.000 H1650-MP celler demonstrerte dedifferentiation av MP celler til å generere SP celler
in vivo plakater (Figur 3C, nedre panel), etter 9 uker i disse mus (figur 3B). Faktisk har det blitt rapportert at differensierte kreftceller kan være i stand til å de-differensiere og skaffe stamceller-lignende egenskaper i enkelte tilfeller [36], sannsynligvis lette forsinket veksten av svulster.
βArr1 Regulerer selvfornyelse vekst av SP Cells
βarrestin-en (βArr1) er et stillas protein som spiller en viktig rolle i desensitivisering av G-protein koblede reseptorer [20], [37], [38], [39], [40]. Nyere studier har vist at βArr1 spiller en rolle i aktiveringen av Src kinaser av ulike reseptorer og kan lette spredning av lungekreftceller [38], [41]. Videre ble βArr1 nivåer funnet å være forhøyet i metastatisk NSCLC og andre kreftformer sammenlignet med normalt vev eller primære svulster [20], [39], [40], [41]. Gitt korrelasjonen av βArr1 med tumorprogresjon og metastase, undersøkte vi hvorvidt dette proteinet spiller en rolle i stamcellelignende egenskaper av SP-celler. I det første settet med eksperimenter ble sirnas til βArr1 eller relaterte βArr2 gener transfektert inn H1650, H1975 og A549 celler; en ikke-målsøkende siRNA ble anvendt som kontroll. Det ble funnet at forbigående transfeksjon av βArr1 spesifikk siRNA redusert frekvens av SP-celler med omtrent 40 til 70%; reduksjonen var bare 10 til 20% når βArr2 siRNA ble transfektert (figur 4A); antyder en viktig rolle i reguleringen av βArr1 SP frekvens. For ytterligere å belyse hvilken rolle βArr1 i stammen lignende funksjoner av SP celler, genererte vi A549 celler som stabilt overuttrykt rotte βArr1, eller de som ble stabilt transfektert med en shRNA til βArr1. Det ble funnet at celler som stabilt overuttrykker βArr1 hadde omtrent tre ganger mer SP-celler sammenlignet med kontroll A549-celler som stabilt uttrykte GFP (A549-GFP). Omvendt, stabil uttømming av βArr1 ved hjelp av en spesifikk shRNA (A549-shβArr1) resulterte i en signifikant reduksjon i SP-frekvens sammenlignet med en kontrollcellelinje som var stabilt transfektert med et ikke-målsøkende shRNA (A549-kontroll) (figur 4B). Real-time PCR eksperimenter ble utført for å vurdere om endringene i SP frekvens korrelert med ulike nivåer av ABCG2. Det ble funnet at A549 stabilt overekspresjon βArr1 hadde to ganger mer ABCG2 melding sammenlignet med celler transfektert med GFP. Omvendt,-celler utarmet av βArr1 hadde signifikant lavere ABCG2 melding sammenlignet med kontroll shRNA uttrykkende celler (figur 4C). Disse resultatene ble bekreftet ved Western-blotting (figur 4D); ble det funnet at βArr1 null-celler hadde lavere mengder av ABCG2 samt βArr1, men sammenlignbare mengder av β-aktin og E2F1, som ble anvendt som kontroller.
(A) H1650, H1975 og A549-celler ble transfektert med siRNA mot βArr1 og βArr2. Frekvens av SP celler ble sammenlignet med ikke-måls kontroll siRNA transfekterte celler. SP-cellene er omsluttet innenfor området avgrenset i rosa. Søylediagrammene representerer ganger forskjell i frekvens i siRNA transfekterte celler i de respektive cellelinjer. (B) SP frekvens ble analysert og representert for A549 celler ectopically uttrykker rotte-βArr1 eller GFP og shRNA mot βArr1 eller ikke-måls kontroll shRNA. (C) Real-time PCR og (D) western-blot-analyse for ekspresjon ABCG2 ble utført for disse stabile cellelinjer. (E, F, G) A549-celler som stabilt uttrykker shRNA mot βArr1 og ikke-målsøkende shRNA ble sådd ut for selvfornyelse analysen. (E) fasekontrastmikroskop-bilder av sfærene i nærvær eller fravær av legemidler er presentert. (F, G) Gjennomsnittlig antall og størrelsen av kulene som genereres per brønn fra 1000-celler er plottet (gjennomsnitt ± SD).
På grunn av rollen til βArr1 i genereringen av SP-celler, ved siden undersøkte vi hvorvidt dette proteinet letter selvfornyelse i tillegg. For dette formål ble SP-celler isolert fra A549-celler som stabilt uttrykker en shRNA mot βArr1 eller et ikke-målsøkende kontroll shRNA og selvfornyelse egenskap vurdert ved sfære formasjons analyser. Det ble funnet at celler som mangler βArr1 hadde markert lavere antall sfærer (figur 4E); ytterligere, størrelsen på sfærene dannet av βArr1 null-celler var vesentlig lavere enn de som er dannet av SP-celler fra kontrollceller (figur 4F, G). Disse eksperimentene viser tydelig at stillaset protein βArr1 spiller en rolle i etableringen av SP celler gjennom regulering av ABCG2 uttrykk og også forenkler selvfornyelse tilhører disse NSCLC stilk-lignende celler.
hemmer av Mcl- 1 Mål selvfornyelse Vekst av SP Cells
Forbedret celle overlevelse og narkotika motstand er en funksjon av kreft stamceller [10], [42]. Den anti-apoptotiske protein Mcl-1, er blant de mest vanlige amplifiserte gener i human kreft, inkludert NSCLCs [22], [43], [44],. Nylig, studier har også knyttet MCL-en funksjon med regulering av selvfornyelse av blodkreft stamceller [48], [49]. Gitt den potensielle rolle Mcl-en i blodkreft stamceller, neste utforsket vi om Mcl-1-funksjonen bidrar til selvfornyelse tilhører NSCLC-SP celler. Som et første trinn ble QRT-PCR utført på RNA isolert fra SP og MP-celler isolert fra H1650, H1975 og A549 cellelinjer. MCL-en melding ble uttrykt på et høyere nivå i SP celler fra alle tre cellelinjene (figur 5A). MCL-1-protein nivået ble også forhøyet i SP-celler sammenlignet med MP-celler i alle de tre cellelinjene, som sett ved Western-blotting (figur 5B).
(A, B) Relativ ekspresjon av Mcl-1 ble undersøkt på mRNA og proteinnivåene for angitte cellelinjer ved RT-PCR og western blot analyse. (C) Oppbygging av Obataoclax og dens behandling planen er representert. (D) H1650-SP-celler ble sortert og belagt for selvfornyelse assay i nærvær eller fravær av Obatoclax ved angitte konsentrasjon. Gjennomsnittlig antall sfærer som genereres per brønn fra 1000-celler er plottet (gjennomsnitt ± SD). Fasekontrastmikroskop-bilder av sfærene i nærvær eller fravær av legemidler er presentert. (E) SP-celler ble sortert fra erlotinib resistent cellelinje H1975 og belagt for selvfornyelse assay i nærvær eller fravær av medikamenter indikert. Gjennomsnittlig antall sfærer som genereres per brønn fra 1000-celler er plottet (gjennomsnitt ± SD) og (F) fasekontrastmikroskopi bilder av sfærene i nærvær eller fravær av legemidler er presentert. (G) Western-blot-analyse av βArr1 og βArr2 i Obatoclax behandlede celler. Inhibering av Mcl-1 påvirket ikke ekspresjon av βArr1 og βArr2 i noen av cellelinjene som ble testet.
Obatoclax er et hydrofobt molekyl (figur 5C) som ble utviklet som en Bcl-2-familien antagonist inkludert Mcl-1 [50]. Obatoclax har vist seg å overvinne resistens mot apoptose mediert spesifikt ved Mcl-1 [51]. Derfor her brukte vi Obatoclax for å undersøke hvilken rolle Mcl-1 i selvfornyelse av SP-celler, ved å drive kuledannelsesforsøk i nærvær eller fravær av Obatoclax. Som vist i figur 5C, ble cellene sådd ut på dag 1 for sfære dannelsesbestemmelsen og Obatoclax ble tilsatt på Dag 1 og dag 5 i det angitte dose. Etter 10 dager etter plettering av antall sfærer ble talt og analysert. Som vist i figur 5D, inhibering av Mcl-1-aktivitet ved 200 nM av Obatoclax viste en 4-5 gangers reduksjon i antall sfærer; ytterligere størrelsen av kulene var også signifikant redusert som vist på bildet over søylen (figur 5D). 500 nM konsentrasjon av Obatoclax fullstendig undertrykt sfæren dannelse (figur 5D).
Erlotinib og gefitinib er hemmere av EGFR som viser signifikant effekt i behandling av NSCLC pasienter som hadde EGFR mutasjoner [52], [53]. På samme tid, er en sekundær punktmutasjon i exon 20 av EGFR (T790M) forbundet med ervervet resistens mot EGFR-inhibitorer, inkludert erlotinib [52].
