Abstract
Bakgrunn
Beclin 1 er en hovedaktør i autofagi. Uttrykket av Beclin 1 og dens prognostisk rolle i magekreft er stort sett uutforsket. Hensikten med denne studien er å undersøke uttrykket av beclin en i magekreftceller, vev og sitt forhold til prognosen.
Metoder
uttrykk for Beclin en ble oppdaget i 271 eksemplarer av lymfe-node positive mage kreftpasienter ved immunhistokjemi. Korrelasjonen av Beclin en uttrykk for clinicopathologic funksjoner og overlevelse av magekreft ble studert. Beclin-1 uttrykk i mage kreft cellelinjer og kliniske prøver er også oppdaget ved hjelp av revers transkripsjon-PCR og Western blotting.
Resultater
Beclin 1 er oppregulert både mRNA og proteinnivåer i seks magecancercellelinjer sammenlignet med de i normal gastrisk mucosa-celle-linjen (GES-1). Ekspresjonen av Beclin-1 i mage kliniske prøver er også høyere enn de som er i de tilstøtende noncancerous vev. Av 271 pasienter, 229 (84,5%) var Beclin 1 høye uttrykk svulster ved immunhistokjemi. Beclin en uttrykk er nært forbundet med intravaskulær embolus. Kaplan-Meier-analyse viste høy beclin 1-ekspresjon var forbundet med lengre total overlevelse. Både univariat analyse og multivariat analyse viste at Beclin en uttrykks var uavhengige prognostiske faktorer i pasienter med lymfeknutepositiv magekreft.
Konklusjoner
Våre funn tyder sterkt på at Beclin 1 har en potensiell rolle i tumorigenesis av magekreft og kan være en lovende biomarkør for å forutsi prognosen for pasienter med lymfeknutepositiv magekreft. Det kan også tjene som en roman terapeutisk mål for magekreft behandling
Citation. Geng Q-R, Xu D-Z, Han L-J, Lu J-B, Zhou Z-W, Zhan Y-Q, et al. (2012) Beclin-1 Expression er en signifikant prediktor for overlevelse hos pasienter med Lymph Node-positiv Gastric Cancer. PLoS ONE 7 (9): e45968. doi: 10,1371 /journal.pone.0045968
Redaktør: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chile
mottatt: 04.04.2012; Godkjent: 23 august 2012; Publisert: 27.09.2012
Copyright: © Geng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Science Foundation Medical i Guangdong-provinsen (No. 2010B031600071). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er fortsatt et stort folkehelseproblem over hele verden, spesielt i østasiatiske land, alder-standardiserte insidensraten er 20 per 100 000 [1]. For den avanserte magekreft, er dens prognose fortsatt dårlig, med en anslått samlet 5-års overlevelse på 25% eller mindre [2], [3]. Lymfeknutemetastase er den kraftigste prognostisk indikator følgende kurativ reseksjon [4] – [7]. Om lag 75% av avanserte pasientene har lymfeknutepositiv magekreft, hvis prognosen er betydelig svakere enn for de med node-negativ sykdom [4].
I tidligere studier har vi funnet positiv lymfeknute ratio er et uavhengig prognostisk indikator for å pasienter med node-positiv magekreft og intraperitoneal kjemoterapi kan være gunstig [8], [9]. Imidlertid er en fundamental skritt mot å forbedre overlevelse av pasienter med lymfeknute-positiv magekreft ligger i økt forståelse av svulsten biologiske atferd og å lete etter mulige mål for individuell behandling [10], [11]. For eksempel har den human epidermal vekstfaktor reseptor 2 (HER2) blir nå en ny markør for magekreft etter evidensbaserte prinsipper [12] tilsetning ■ trastuzumab til standard kjemoterapi kunne endre den dårlige overlevelsen av pasienter med HER2-positiv metastatisk ventrikkelkreft [13] – [15]
Nylig har rollen som autofagi i kreftutvikling og kreftbehandling fått stor bekymring [16] -. [18]. Beclin en, en viktig regulator av autofagi formasjon, ble funnet overekspresjon i en rekke av kreft hos mennesker [19] -. [22]
Men det er fortsatt relativt få studier som har undersøkt sammenhengen mellom Beclin 1 og magekreft. Spesielt ingen data om deres virkninger på prognose i magekreft, har ennå ikke blitt rapportert.
Denne studien undersøkte Beclin en uttrykk i magekreftceller, vev og dens clinicopathologic betydning hos pasienter med lymfeknutepositiv mage kreft. Videre analyserte vi forholdet mellom den Beclin en uttrykk med prognosen for å avgjøre om Beclin en kan forutsi klinisk utfall.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kulturforhold
menneskelige mage kreft cellelinjer HGC-27, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823 var gaver fra Peking University School of Oncology (Beijing, Kina.) [23], [24]. Den normale mageslimhinnen cellelinje, GES-en, stammer fra et menneske fosterets mageslimhinnen epitel, ble hentet fra First Affiliated Hospital Sun Yat-Sen University [25]. Disse cellelinjene ble holdt i RPMI 1640-medium (Invitrogen) supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone), penicillin (100 enheter /ml) og streptomycin (100 enheter /ml) ved 37 ° C og 5% CO2 i en fuktig inkubator .
Revers transkripsjon-PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol metode. RNA ble forbehandlet med DNase og anvendt for cDNA-syntese med tilfeldige heksamerer. Blandingen (25 pl totalt) for PCR bestod av 0,5 pl cDNA, 0,5 U Taq DNA-polymerase, 2,5 ul 10 x PCR-buffer, 2,5 mM dNTP-blanding, og 50 pM sense- og antisense-primere hver. Beclin 1 ble analysert ved følgende primere: Beclin en 5’CGTGGAATGGAATGAGAT3 «
reverse primer 5′ GTAAGGAACAAGTCGGTAT3 «;
Actin: 5’AGCCATGTACGTAGCCATCC3′
og 5 «GTGGTGGTGAAGCTGTAGC 3 «.
Western blot-analyse
Cellene ble lysert i lyseringsbuffer, og konsentrasjonen av protein ble bestemt ved Bradford-fargemetode (Bio-Rad Laboratories). Like mengder av celleekstrakt ble underkastet SDS-PAGE og overført til PVDF-membran (Bio-Rad). Uttrykk for Beclin 1 ble bestemt med en kanin monoklonalt antistoff (1:1000, Novus Biologicals, NB500-249) i henhold til produsentens foreslåtte protokoller.
Pasienter studert
Studien besto av 271 gastric kreftpasienter som gjennomgikk radikal reseksjon for histologisk bekreftet magekreft fra Cancer Center of Sun Yat-sen-universitetet mellom januar 1998 og desember 2006. Vi har innhentet informert samtykke fra alle deltakerne i denne studien. Etisk godkjenning er innhentet fra Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center forskningsetisk komité. Kriteriene inkludert histologisk bekreftet R0 reseksjon, som ble definert som ingen makroskopisk og mikroskopisk resttumor og postoperativ overlevelsestid ≥6 måneder. Pasienter med fjernmetastaser eller preoperativ behandling eller lymfeknute-negative ble ekskludert fra studien. Den 7thTNM klassifisering av det amerikanske Joint Committee on Cancer og International Union Against Cancer kriterier ble brukt for patologisk staging [26]
Alle pasientene hadde oppfølging etter operasjonen på 6 til 12 måneders intervall.; Median oppfølgingstid var 38 (intervall 10-145) måneder for alle pasienter. Total overlevelse ble definert som ble definert som perioden mellom tidspunktet for kirurgi og død eller ble sensurert i siste oppfølging.
Immunohistochemistry
Beclin 1 ble oppdaget med en kanin monoklonalt antistoff ( 1:100, Novus Biologicals, NB500-249). Alle vevsprøver ble oppnådd fra kirurgisk resekterte gastriske cancere før adjuvant behandling. Formalinfikserte, parafininnstøpte vevsblokker ble lagret ved romtemperatur identifisert ved et identifikasjonsnummer. Prosedyrene ble utført på lignende måte som den fremgangsmåten som tidligere er beskrevet [23]. De immun seksjonene ble evaluert og vev fra menneskelige prostata adenokarsinomer tjente som positiv kontroll. Alle snittene ble evaluert ved to uavhengige observatører basert på andelen av positivt fargede tumorceller og intensitet av farging. I henhold til nylig beskrevne kriterier for vurdering Beclin 1-ekspresjon, intensiteten av membranfarging varierte fra svakt til sterkt: 0 (ingen farging), 1 (svak farging), 2 (moderat farging) og og 3 (intens farging) [27]. Prosentandelen av positive tumorceller ble scoret som 0 (mindre enn 5%), 1 (6% til 25%), 2 (26% til 50%), 3 (51% til 70%) og 4 (mer enn 70% ). Farging indeksen ble beregnet ved å legge sammen fargeintensitet score og andelen positive celler score. Immunoreactive scorer lik eller høyere enn 4 ble brukt til å klassifisere svulster med høy Beclin en uttrykk, og en farge score under 4 ble brukt for å indikere lav Beclin 1 uttrykk.
Statistiske analyser
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS (versjon 18 for Windows, SPSS, Chicago, IL). Forskjeller på P 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Foreningen av Beclin-1 uttrykk med ulike clinicalopathologic funksjoner ble analysert ved hjelp av chi-kvadrat test. Overlevelseskurver ble plottet i et Kaplan-Meier metoden og sammenlignet med den log-rank test. En Cox proporsjonal risikomodell (bakover, trinnvis) for multivariabel analyse ble brukt for faktorer som oppnådde betydning i univariable analyse.
Resultater
Beclin en uttrykk i mage kreft cellelinjer
Overuttrykte Beclin en har blitt rapportert i mange kreftformer. Dens uttrykk status på mage kreft cellelinjer, men er fortsatt uklart. For å bestemme uttrykket nivåer av beclin-1-transkripter og protein, semi-kvantitativ revers transkripsjon-PCR-analyse og western-blotting-analyse ble utført separat i normale humane mage-epitelceller (GES-1) og seks gastrisk cancer-cellelinjer (HGC-27, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823). Vi fant at Beclin 1 mRNA og protein ekspresjon nivå oppregulert i alle seks magecancercellelinjer sammenlignet med normale gastriske epitel-celler GES-1. (Fig. 1 A og B)
(A) Beclin en mRNA-ekspresjonsnivået oppregulert i magecancercellelinjer sammenlignet med normale gastriske epitel-celler ved revers transkripsjon-PCR. (B) Beclin en protein uttrykk nivå oppregulert i mage kreft cellelinjer sammenlignet med normale mage epitelceller av western blotting. (C) Beclin en mRNA uttrykk er forhøyet i primær mage svulster sammenlignet med sammenkoblede mage tilstøtende noncancerous vev ved revers transkripsjon-PCR. (D) Beclin en protein uttrykk er forhøyet i primær mage svulster sammenlignet med sammenkoblede mage tilstøtende noncancerous vev ved western blotting.
Beclin en uttrykk i mage kreft vev
For å finne ut beclin- 1 mRNA og protein uttrykk i mage kreft vev, 4 sammenkoblede mage kreft vev og noncancerous vev tilstøtende til kreft lesjoner ble oppdaget av revers transkripsjon-PCR-analyse og western blotting analyse, separat. Det ble funnet at Beclin-1 i alle fire tumor vevsprøver hadde en signifikant høyere uttrykk både mRNA og proteinnivåene enn i normalt vev tilstøtende til svulster fra samme pasient (fig. 1 C og D).
beclin en uttrykk i magekreft
for å undersøke om beclin-en kan klinisk korrelerer med magekreft progresjon, uttrykk og subcellulære lokalisering av beclin en protein ble oppdaget av immunhistokjemi i 271 parafininnstøpte mage kreft vev. Spesifikk Beclin en farging ble stort sett funnet på membranen-plasma og cytoplasma i kreftcellene, og til kjernen. Figur 2 viser representative eksempler på Beclin en farging. Av 271 pasienter, 229 (84,5%) var Beclin 1 høy uttrykk svulster.
Høy Beclin 1 (A) og lav Beclin 1 (B) uttrykk i menneskelige magekreft prøver (× 400), Beclin en positiv flekker i svulsten og negativ farging i normal tilstøtende slimhinnen (× 20) (C).
Survival analyse
Pasienter med Beclin en lav uttrykk magekreft viste signifikant kortere fem år generelle overlevelse (OS, p = .011; fig. 3) og sykdomsfri overlevelse (DFS, p = .010, fig. 4) enn de med Beclin 1 høy uttrykk seg. Uttrykket av Beclin en er nært forbundet med intravaskulær embolus (P = 0,017). Det var imidlertid ingen signifikant korrelasjon mellom ekspresjonsnivået av Beclin 1 og alder, kjønn, nettstedet, tumorstørrelsen, T klassifisering, N-klassifikasjon, eller patologisk stadium av magekreftpasienter (tabell 1). Beclin en uttrykk, nettsted, intra embolus, patologisk T klassifisering, patologisk N klassifisering og patologisk stadium var uavhengige prognostiske faktorer i univariat analyse (data ikke vist) .I multivariabel analyse, Beclin en uttrykk, intra embolus, site og patologisk stadium var signifikante uavhengige prognostisk faktor for overlevelse tid (tabell 2).
Pasienter med høyt uttrykk Beclin 1 viste signifikant lengre total overlevelse enn de med Beclin en lav uttrykk. (P = 0,011).
Pasienter med høyt uttrykk Beclin 1 viste signifikant lengre DFS enn de med Beclin en lav uttrykk. (P = 0,010).
Diskusjoner
Autophagy er en selv degradering mekanisme og assosiert med tumorprogresjon. Beclin 1, et pattedyr orthologue av gjær Atg6, spiller en avgjørende rolle i den vesikkel-kjernedannelsesprosessen av autophagy [28]. Det er et gen som uunnværlig for de første faser av autofagi [29] -. [30]
studien har for første gang vist en Beclin er oppregulert på både mRNA og proteinnivåer i seks magekreft cellelinjer sammenlignet med de i normale gastriske epitel-celler GES-1. Vi har også avdekket Beclin en uttrykk er forhøyet i primær mage svulster sammenlignet med fire sammenkoblede magekreft prøver ved siden av svulster fra de samme pasientene ved revers transkripsjon-PCR og Western blotting. Resultatene skiller seg fra de som er rapportert i leverkreftceller og livmorhalskreftceller, som viste Beclin en uttrykks betydelig lavere sammenlignet med tilsvarende normale vev [31], [32]. Den mulige forklaring er at beclin-1-ekspresjon i mage kreft bidra til induksjon av autophagic celledød, for derved å produsere selektivt trykk for å overstyre celledød under utviklingen av kreft [27], [33].
I foreliggende studie , observerte vi at 229 (84,5%) pasienter som hadde høy ekspresjon Beclin 1 i 271 kreftpasienter mage, i tråd med funn av den foregående studie av Ahn et al.Their data viste ingen eller meget svak ekspresjon av Beclin1 i normale slimhinnecellene magen ved immunhistokjemi [27]. Men de gjorde ikke utforske beclin-1 uttrykk på mRNA nivå i cellelinjer, og heller undersøke dens rolle i prognosen.
Vi analyserte forholdet mellom uttrykk for beclin-en og kliniske kjennetegn ved pasientene . Det var ingen signifikant korrelasjon mellom ekspresjonen av beclin-1 og alder, kjønn, T klassifisering, N-klassifikasjon, eller fasen av pasienter med magekreft. Interessant, i vår nåværende studie, var det en signifikant sammenheng mellom uttrykk for beclin-en og intra embolus. Det tyder på at beclin-1 kunne brukes som en markør intravaskulær embolus i pasienter med node-positiv magekreft. Disse observasjonene markere den viktige rollen beclin-en i utviklingen av magekreft.
Videre fant vi lav beclin-1 uttrykk var sterkt assosiert med redusert overlevelse hos pasienter med ventrikkelkreft (
P
= 0,011) og intra embolus undergruppe (
P
= 0,017). I multivariat analyse, Beclin-1 uttrykk beholdt sin uavhengighet som en prognostisk faktor (
P
= 0,044). Disse resultatene tyder på et potensielt lovende nytten av beclin-en som en prognostisk og overlevelse indikator. Mekanismen er fortsatt ikke klart. Alternativet forklaring på dette kan være at beclin-1 uttrykk i mage kreft grenser kromosom ustabilitet og reduserer hyppigheten av ytterligere mutasjon [34].
Så vidt vi vet, er studiet den første rapporten som Beclin en hadde en betydelig høyere ekspresjon i magekreftceller og vev, både på mRNA og proteinnivåene i forhold til deres normale motstykker. Videre fant vi høy beclin en uttrykk var forbundet med lengre total overlevelse. Både univariat analyse og multivariat analyse viste Beclin en uttrykk, nettsted, intravaskulær embolus og patologisk stadium var uavhengige prognostiske faktorer. Resultatene antyder sterkt at Beclin 1 har en potensiell rolle i tumordannelse av magekreft. Det kan være en lovende biomarkør og noen nye terapeutiske strategier til pasienter med lymfeknutepositiv magekreft. Videre studier er også nødvendig for å avklare mekanismen som autofagi skuespiller Beclin en er involvert i utvikling og progresjon av magekreft.
