Abstract
Bakgrunn
Lungekreft er fortsatt den ledende årsak til kreft død på verdensbasis. Radioresistance av lungekreftceller resulterer i uakseptabel rate av lokoregionalt svikt. Selv om stråling er kjent for å indusere apoptose, vår nylig studie viste at knockdown av pro-apoptotiske proteiner Bak og Bax resulterte i en økning i autophagic celledød og lungekreft Radiosensitivity
in vitro
. For ytterligere å undersøke mulighetene for apoptose hemming som en måte å bevisstgjøre lungekreft for terapi, testet vi M867, en ny kjemisk og reversibel caspase-3-inhibitor, i kombinasjon med ioniserende stråling
in vivo Hotell og
i vitro
.
Metoder og funn
M867 redusert klonogene overlevelse i H460 lungekreftceller (DER = 1,27, p = 0,007) sammenlignet med bilens behandlede behandlede celler. Vi har funnet at administrering av M867 med ioniserende stråling i en
in vivo
mus hind kreft modell lem lunge ble godt tolerert, og en signifikant tumorvekstforsinkelse i forhold til stråling alene. En dramatisk reduksjon i tumor vaskulaturen ble observert med M867 og stråling ved hjelp av von Willebrand-faktor farging. I tillegg Ki67-indeks viste fem gangers reduksjon av tumor proliferasjon i kombinasjonsterapigruppen, til tross for de reduserte nivåer av apoptose observeres med terminal deoksynukleotidyl transferase-mediert dUTP nick endemerking farging. Radiosensitizing effekten av M867 gjennom hemmer caspases ble validert
med
caspase-3 /-7 dobbel-knockout (DKO) mus embryonale fibroblaster (MEF) celle modell. I samsvar med vår forrige undersøkelse, bidro autofagi til mekanismen av økt celledød, etter hemming av apoptose. I tillegg matrigel analysen viste en nedgang i
in vitro
endothelial tubule formasjon under M867 /stråling kombinasjonsbehandling.
Konklusjoner
M867 forsterker de cytotoksiske effekter av stråling på lunge kreft og dens blodkar både
in vitro Hotell og
in vivo
. M867 har potensial til å forlenge tumorvekstforsinkelse ved å hemme tumor proliferasjon. Kliniske studier er nødvendig for å fastslå potensialet i dette kombinasjonsbehandling hos pasienter med lokalavansert lungekreft
Citation. Kim KW, Moretti L, Lu B (2008) M867, en Novel Selektiv hemmer av caspase-3 Forbedrer celledød og Utvider tumorvekst Stans i Bestrålet Lung Cancer Models. PLoS ONE 3 (5): e2275. doi: 10,1371 /journal.pone.0002275
Redaktør: Mark R. Cookson, National Institutes of Health, USA
mottatt: 05.02.2008; Godkjent: 17 april 2008; Publisert: 28. mai 2008
Copyright: © 2008 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes delvis av det amerikanske National Cancer Institute (NCI) Grant 1R01 CA125842-01A1. Finansiører hadde ingen rolle i utformingen og gjennomføringen av studien, i datainnsamling, analyse og tolkning, og beslutningen om å publisere, vurdering, godkjenning, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklærte at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Lungekreft er den vanligste kreftsykdommen i verden, og den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet tross multi-modalitet terapi, noe som resulterer i 160,390 estimerte dødsfall i USA bare i 2007 [1]. Ettersom tumorresistens grenser effektiviteten av nåværende behandlinger [2], [3], [4], slik som strålebehandling, er identifisering av nye terapeutiske strategier kritisk for å bedre resultatet. Av de forskjellige celledøds prosessene som er involvert i behandling av kreft, har apoptose vært den mest godt studert [5]. I løpet av apoptose, de viktigste mediatorer av cellulær ødeleggelse er effektorer caspase-3 og -7, medlemmer av cystein proteaser aspartat-familien, som spalter proteiner etter en aspartat rest [6]. Selv om stråling er kjent for å indusere apoptose, men det utgjør en mindre del av celledød i bestrålte solide tumorer [7], og vår fersk studie viste at knockdown av pro-apoptotiske proteiner Bak og Bax resulterte i en økning i lungekreft Radiosensitivity
in vitro product: [8]. Autofagi, en ikke-apoptotisk celledød typen ble vist seg å bidra til mekanismen for økt celledød.
Autophagy er en evolusjonært konservert prosess og en overlevelsesmekanisme som åpner for gjenbruk av langlivede organeller og proteiner [ ,,,0],9], [10]. Autofagi fungerer også som et selvmord vei med fullstendig selv fordøyelsen etter overdreven stress forhold [11], [12], som er klassifisert som programmert celledød Type 2 [9], [10]. Under autofagi, oppstår organ degradering gjennom dannelsen av cytoplasmatiske dobbel-membran vakuoler, kalt autophagosomes med intakte kjerner [13]. Autophagy regulering har vært av økende interesse, på grunn av dens implikasjon i tumorgenese. I tillegg kan forlenget autophagy føre til kreft celledød, som fører til den hypotese at autophagy kan utnyttes som et mål-kreftterapi [14], [15], [16], [17].
å ytterligere undersøke mulighetene for apoptose hemming som en måte for å sensibilisere lungekreft for terapi, testet vi M867, en ny kjemisk og reversibel caspase-3-inhibitor [18], i kombinasjon med ioniserende stråling
in vivo
og
in vitro
.
Materialer og metoder
Cell kultur
Primær mus embryonale fibroblaster (MEFs) ble avledet fra villtype (WT) og Caspase3
– /- /7
– /- dobbelt knockout (DKO) mus og udødeliggjort av transfeksjon med et plasmid som inneholder SV40-T-antigen (gitt av Dr. Richard Flavell, Yale University, New Haven, CT). MEFs ble dyrket i DMEM (Invitrogen Corporation) supplert med 10% føtalt bovint (FBS), 1% penicillin-streptomycin og 0,5 pmol /liter 2-merkaptoetanol. H460-lungecancerceller ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Grand Island, NY) supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C og fuktet 5% CO2. HUVECs ble erholdt fra Clonetics og ble opprettholdt i EBM-2-medium supplert med EGM-MV 2 enkelts alikvoter (BioWhittaker). M867 ble skaffet fra Merck WT MEFs celler og caspase 3/7 DKO MEFs celler ble behandlet med DMSO eller M867 (5nM og 10 nM for 24 timer); og MEFs celler ble behandlet med sirnas mot caspase-3 og-7, sirnas mot Beclin-en og ATG5, eller kontroll. Cellene ble deretter bestrålt med 0-6 Gy som angitt i en dose på 1,8 Gy /min, ved hjelp av en
137 Cs irradiator (J. L. Shepherd og Asssociates, Glendale, California). Etter bestråling ble cellene inkubert ved 37 ° C i 8-10 dager. Celler ble fiksert i 15 minutter med 3: 1 metanol: eddiksyre og farget i 15 minutter med 0,5% krystallfiolett (Sigma) i metanol. Etter farging ble koloniene telt ved bruk av en cut-off på 50 levedyktige celler. Gjenlevende fraksjonen ble beregnet som (gjennomsnittlig kimtall) /(celler inokulert) × (plating effektivitet (PE)), hvor PE ble definert som (gjennomsnittlig kimtall) /(celler inokulert for ikke-bestrålte kontroller). DER ble beregnet som den dose (Gy) for stråling alene dividert med den dose (Gy) for stråling pluss M867 (normalisert for M867 toksisitet) som er nødvendig for en overlevende fraksjon på 0,25. Forsøkene ble utført i tre eksemplarer og mener, SD, og P-verdiene ble beregnet.
Immunoblotting
Cells (0,5 × 10
6) ble behandlet med ulike Gy og narkotika. De ble samlet opp ved forskjellige tidspunkter, og deretter ble vasket med iskald PBS to ganger før tilsetningen av lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 1% NP40, 50 mM NaF, 1 mM Na3Vo4, 1mM NaMO4 og cocktail inhibitor (Sigma, 5 ul /ml). protein~~POS=TRUNC konsentrasjonen~~POS=HEADCOMP ble kvantifisert ved Bio-Rad-metoden. Like mengder protein, ble lastet inn i hver brønn og separert ved 12,5% SDS-PAGE-gel, etterfulgt av overføring til PVDF-membraner ( . BIO-RAD) Membraner ble blokkert ved anvendelse 5% fettfri tørrmelk i PBS-T i 1 time ved romtemperatur Blottene ble deretter inkubert med Caspase-3 (celle signalisering),. Caspase-7 (celle signalisering); LC-3- (Medical Biological Laboratories Co. LTD), Akt, fosfor-Akt (Ser-473), S6 ribosomal protein og fosfor-S6 ribosomalt protein (Ser-240/244) (Cell Signaling), og Actin antistoffer for 1t ved 4 . ° C Geit-anti-kanin-IgG sekundært (1: 5000, Santa Cruse Biotechnologies).. ble inkubert i 45 min ved værelsestemperatur immunoblot ble utviklet ved hjelp av kjemiluminescens påvisningssystem (PerkinElmer) i henhold til fremstilling protokoll og autoradiografi
Måling av apoptose
Cells (2,5 × 10
5) ble sådd ut i 10mm retter for hvert datapunkt. Etter 24 timer på 37 ° C inkubasjon, H460 celler ble behandlet med M867 (100 nM for 2 timer) og umiddelbart bestrålt med 5Gy, 10Gy eller 20Gy, og WT og Caspase3
– /- /7
– /- DKO cellene ble bestrålt med 5Gy eller 10Gy. Etter 24 timer ble cellene behandlet med 1 ml av Accutase (holde alle flytende celler) for 4min og deretter telles for hver prøve. Cellene ble sentrifugert og resuspendert i 1 x bindingsbuffer ved en konsentrasjon på ~ 1 x 10
6 celler /ml. 100 ul av den oppløsning (~ 1 x 10
5 celler) ble overført i 5 ml FACS rør, tilsettes 1,2 ul av Annexin V-FITC og 1,2 ul PI. Etter inkubering i 30 minutter ved romtemperatur i mørke, 400 ul av 1 x bindingsbuffer ble tilsatt til hvert rør. Hastigheten av apoptose ble målt ved bruk av Annexin V-fluorescein-isotiocyanat apoptose deteksjon kit I (Pharmingen) med strømningscytometri.
Autophagy Assay
MEFs Celler ble transfektert med 2,5 ug av GFP-ekspresjon LC3 plasmid (gave fra Dr. Norboru Mizushima) [19] med lipofektamin reagens (Invitrogen Life Technologies). Etter 24 timer ble cellene behandlet med 5Gy av stråling, med eller uten dosering M867. Etter 24 og 48 timer, ble observert fluorescens av GFP-LC3 hjelp confocal gjennomlysning.
siRNA Transfeksjon
sirnas mot mus caspase-3 og-7, Beclin og kontroll siRNA ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi. siRNA ATG5 (mus) ble syntetisert ved Dharmacon Research. De sense- og antisense tråder av ATG5 ble påbegynt ved nukleotid, 5′-AACUUGCUUUACUCUCUCAUCAUU-3 «(Sense) og 3′-UUUUGAACGAAAUGAGAGAUAGU-5». (Antisens) Cellene ble transfektert med 25nm av siRNAs bruker LipofectAMINE 2000. De transfekterte celler ble brukt til eksperimenter 24 timer senere
endotelcelle Morphorgenesis analysen. Tubuli Dannelse
HUVECs vokst til ~70% konfluens ble behandlet med 5nM M867, 3Gy, eller kombinasjonsterapi. Cellene ble så trypsinert og telt. De ble sådd ut på 48 000 per brønn på 24-brønners plater belagt med 300 ul av Matrigel (BD Biosciences). Disse cellene gjennomgå differensiering i kapillær-lignende rør strukturer periodevis observert ved mikroskopi. 24 timer senere ble cellene farget med hematoxylin og eosin (H E) og bildene ble tatt via mikroskop. Det gjennomsnittlige antall rørelementer ble beregnet ut fra undersøkelse av tre separate mikroskopiske felt (100 x) og representative fotografier ble tatt.
Tumorvolum vurderings
human lungekreft H460-celler ble anvendt i en xenograft modell i hunn atymiske nakne mus (nu /nu), 5-6 uker gamle [Harlan Sprague Dawley Inc., Indianapolis, iN]). En suspensjon av 1 x 10
6-celler i 50 ul volum ble injisert subkutant inn i den venstre bakre flanke av mus ved hjelp av en 27½-gauge nål. Svulster ble dyrket for 6-8d til gjennomsnittlig tumorvolumet nådd 0.25cm
3. Behandlingsgruppene besto av kjøretøy kontroll (i DMSO), M867, kjøretøy pluss stråling, og M867 pluss stråling. Hver behandlingsgruppe inneholdt 5 mus. DMSO eller M867 ble gitt daglig ved intraperitoneal (i.p.) injeksjon ved doser på 2 mg /kg i 7 påfølgende dager. I tilfelle av kombinasjonsbehandlingen, ble medikament eller vehikkel gis til 2d før den første dose av bestråling. Mus i strålings grupper ble bestrålt 1t etter narkotika eller kjøretøy behandling med daglige 2Gy fraksjoner gitt over 5 sammenhengende dager. Svulster på flankene av musene ble bestrålt ved hjelp av et røntgenstråle (Therapax, Agfa NDT, Inc., Lewis Town, PA). Den ikke-tumorbærende deler av musene ble skjermet av bly blokker. Tumorer ble målt 2-3 ganger ukentlig i 3 perpendikulære dimensjoner ved bruk av en Vernier caliper og volumet ble beregnet ved bruk av den modifiserte ellipsen volum formel (volum = (høyde x bredde x dybde) /2). Vekstforsinkelse ble beregnet for behandlingsgruppene i forhold til kontroll tumorer.
Histologiske snitt, vWF, og Ki67 TUNEL-farging
Mus ble implantert med H460-celler og behandlet som beskrevet ovenfor i tumorvolumet studiene. Etter 7d av daglige behandlinger, ble musene avlivet og svulster ble parafin fikset. Lysbilder fra hver behandlingsgruppe ble deretter farget for von Willebrand-faktor (vWF) ved anvendelse av anti-vWF polyklonalt antistoff (Chemicon). Blodårene ble kvantifisert ved tilfeldig velge 400 × felt og telle antall blodkar per felt. Dette ble gjort i triplikat og gjennomsnittet av de tre tellinger ble beregnet. Ki67 og terminal deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick slutten merking (TUNEL) farging ble utført i Vanderbilt University patologi kjernen laboratoriet ved hjelp av standardprotokoller. Antall positive celler per felt ble scoret og tegnes ved gjennomsnitt tre gjentatte vurderinger.
Statistisk analyse
Analyse av studieresultater fokusert på testing av forskjeller i gjennomsnittlig tumorvolum mellom behandlingsgrupper og ulike tidspunkt punkter. Dataanalysen ble gjennomført ved hjelp av begrenset /rest maximum likelihood-baserte blandet modell for å justere intracorrelation effekt for musene som hadde flere målinger. Modellen rapportert i papiret ble valgt på basis av den Schwarz bayesisk kriterium. Alle tester av betydning var to-sidig, og forskjellene ble vurdert som statistisk signifikant når p var mindre enn 0,05. En statistikkpakke, SAS v8.2, ble brukt for alle analyser.
Resultater
M867 hemmet apoptose men økt stråling følsomhet i H460 lungekreftceller
For å teste effekten av hemming av caspase-3 på lungekreft følsomhet overfor stråling, ble H460-celler behandlet med ny reversibel inhibitor M867 i kombinasjon med ioniserende stråling. Overlevende kolonier ble talt 8 dager senere. Klonogene overlevelses assay, vist i figur 1 A, viste en minsket overlevelse i forskjellige dosegruppene med 10 nM av M867 som resulterer i størst forbedring i Radiosensitivity, sammenlignet med kontroll (DER = 1,27, p = 0,007). Nivået av apoptose i H460-celler ble målt etter behandling M867 (100 nM i 2 timer) og bestråling med 5Gy til 20Gy, ved hjelp av Annexin V-assay. Det har tidligere vært vist at Annexin V-binding ble blokkert ved M867 med en IC
50 av 80 nM [20]. Som vist i figur 1B, ble nivået av apoptose gradvis forhøyet med økte doser av stråling. 20% av bestrålte H460-celler var apoptotiske på 20 Gy. Når M867 ble gitt før bestråling, ble apoptotiske celler ble redusert til halvparten ved både lave og høye dosenivåer av stråling. Disse resultater viser at sensibilisering av H460-lungekreftceller overfor ioniserende bestråling ble assosiert med redusert apoptose.
(A) H460 NSCLC-celler ble behandlet med DMSO kontroll, M867 (doseområdet 1,4 til 10 nM for 24 timer) med stråling. Etter 8 d, ble kolonier farget og scoret kolonier ble fremstilt grafisk. Overlevelseskurver for H460-celler ± M867 behandling. Poeng, mener; barer, SD (
P
= 0,007). Vist er gjennomsnitt +/- standardavvik for tre separate gjentatte eksperimenter. (B) Annexin V-analyse som viser nivået av apoptose i H460-celler behandlet med enten kontroll, 100 nM av M867 i 2 timer, stråling (5, 10 eller 20 Gy), og begge modalitet. Dette ble gjort i triplikat og gjennomsnittet av de tre tellinger ble beregnet. Kolonner, gjennomsnittlig; barer, SD.
Kombinert M867 /strålebehandling forlenger tumorvekst forsinkelse og er godt tolerert i lunge xenograft modell
Etter å ha etablert effektiviteten
in vitro
for M867-indusert bestrålingssensibilisering av lungekreft celler, ble en mus hind lem xenograft modell genereres for å utforske stråling respons ved M867
in vivo
. H460 lungecancerceller ble injisert subkutant i atymiske nakne mus, og tumorene ble tillatt å vokse i ca. 7 dager for å frembringe et midlere tumorvolum på 0.25cm
3 før behandling. Behandlingsgruppene besto av en bærerkontroll, M867, bærer pluss stråling, og kombinasjonen av M867 pluss stråling. M867 ble administrert daglig ved 2 mg /kg intraperitoneal injeksjon i 7 påfølgende dager. Hind lem H460 tumorxenotransplantater i mus ble behandlet som beskrevet i Materialer og Metoder delen. Vekstforsinkelse ble beregnet som antall dager som kreves for å nå en tumorvolum på 2 cm
3 for behandlingsgruppene i forhold til kontroll tumorer. Som vist i figur 2A, ble en signifikant tumorvekstforsinkelse sett med kombinasjonsterapi av M867 og stråling i forhold til bestråling alene (26 vs 20 dager, p 0,005), og M867 alene hadde også betydelig innvirkning på tumorveksten sammenlignet med kontroll (~ 4 dager forsinkelse, p = 0,003). Dette tyder på at M867 kan øke tumorrespons i kombinasjon med strålebehandling. I tillegg ble kroppsvektendring de også spores i mus for å vurdere hvorvidt behandling med M867, stråling, eller kombinasjonsbehandling ga systemisk toksisitet (figur 2B). Bare minimal vekttap ble sett på 10 dager etter den kombinerte M867 og bestråling behandling. Endringer i kroppsvekt etter denne tidsperioden reflektert tumorvekst. Som forventet, er kombinasjonen behandlingsgruppen som hadde den mest langvarige tumorvekstforsinkelse, hadde den minste økning i kroppsvekt.
H460 lungekreftceller ble xenopodet subkutant i atymiske mus. Etter 6-8 dager ble musene behandlet daglig i 7 dager, med bærerkontroll, M867 (2 mg /kg), og deretter ble behandlet en time etter medikamentbehandling med 2 Gy av stråling, daglig over 5 påfølgende dager. Tumor ble spaltet da nådd størrelse på ca 2,5-3,0 cm
3 og tumorvekstforsinkelse som definert ved antall dager som kreves for å nå en tumorvolum på 2 cm
3 ble målt. (A) Svulster ble målt regelmessig og vekstforsinkelse ble beregnet for behandlingsgruppene i forhold til å kontrollere svulster. Den kombinerte bi-modalitet terapi ga en markert tumorvekstforsinkelse sammenlignet med stråling alene (26 vs 20 dager, p 0,005). (B) Kroppsvekten ble målt hver 5 dager og kroppsvekt forholdet ble beregnet i forhold til baseline måling.
M867 reduserer tumor spredning indeksen til tross for markert nedgang i apoptose i bestrålt H460 mus xenograft
for å finne den mekanismen som bidrar til tumorvekst opphold etter kombinasjonsbehandling, Ki67 proliferativ indeksen ble undersøkt ved hjelp av faste H460 tumorsnitt i alle behandlingsgrupper. Som vist i figur 3A, M867 pluss strålekombinasjonsbehandling resulterte i en 6 ganger (15% vs 92%, p 0,001) og to ganger (15% vs 33%, p 0,001) reduksjon i prolifererende celler sammenlignet med kontrollen og stråling alene grupper, henholdsvis. Vi neste vurdert apoptose nivåer i anleggs H460 svulstdelene med TUNEL farging. Som vist på figur 3B ved hjelp av TUNEL-farging, kombinert M867 og strålebehandlingen resulterte i to tredjedels reduksjon i apoptose (4,5% vs 15%, p 0,008)., Sammenlignet med stråling alene
Histologiske snitt ble oppnådd fra tumorer i mus i hver behandlingsgruppe fra tumorvolumet studien. Antall positive celler ble scoret og tegnes ved gjennomsnitt tre gjentatte vurderinger. (A) Gjennomsnittlig Ki67 proliferative indeks for hver behandlingsgruppe ble bestemt ved den prosent av Ki67-positive celler per mikroskopisk felt. Dette ble gjentatt tre ganger. Kolonner, mener; barer, SD. (B) TUNEL farging ble også utført på kreft seksjoner, og apoptotisk indeksen ble på samme måte beregnes ved prosent av positive TUNEL fargede celler per mikroskopisk felt. Kolonne, mener; barer, SD.
M867 reduserer vaskulær tetthet i bestrålte lungetumormodell og sensitizes HUVECs for stråling
Siden tumorvaskulatur er et mål for kreftbehandling, mus ble behandlet på samme måte som de i tumorvekstforsinkelse studium og faste lungetumorsnitt ble anvendt for å bestemme effektene av M867 og stråling på tumorvaskulatur
in vivo
. Lysbilder fra hver behandlingsgruppe ble analysert ved å følge von Willebrand Factor (vWF) farging for studium vaskulær tetthet, slik som vist i figur 4A. Antall skip pr mikroskopisk feltet ble deretter bestemt for hver behandlingsgruppe. Kombinasjonsbehandling med M867 og stråling (1,3; SD = 0,57) resulterte i en dramatisk 5-fold reduksjon i gjennomsnittlig antall skip pr mikroskopisk felt i forhold til kontroll (6; SD = 1; p 0,002) og en ~2- fold reduksjon i forhold til strålebehandling alene (2,3; SD = 0,57; p 0,007). (Figur 4A)
(A) histologiske snitt ble hentet fra svulster i mus i hver behandlingsgruppe fra
in vivo
tumorvolumet studien, og farget for blodårer ved hjelp av et antistoff for vWF. Blodårene ble kvantifisert ved tilfeldig velge 400 × felt og telle antall blodkar per felt. Dette ble gjort i triplikat og gjennomsnittet av de tre tellinger ble beregnet. Kolonner, gjennomsnittlig; barer, SD. (B) humant navlevene endotel-celler (HUVECs) ble behandlet med 5 nM M867 og deretter umiddelbart bestrålt med enten 0 eller 3 Gy. Seks timer senere ble cellene trypsinert og utsådd i 24-brønners plater belagt med Matrigel. Etter 24 timer ble cellene fiksert og farget med H E. Platene ble undersøkt ved mikroskopi (x 100), og representative felt er vist. (C) Farget tubuli ble deretter regnet i tre separate, tilfeldig utvalgte felt. Kolonner, mener antall tubuli telles per mikroskopisk felt; barer, SD.
For ytterligere å undersøke effektene av M867 og stråling på blodkardannelse, ble menneskenavlevene endotelceller (HUVECs) brukes til å undersøke tubuli formasjon for angiogen funksjon
in vitro
. Endotelcelle morfogenese analyse ble utført for å undersøke muligheten for behandlede HUVECs å frem kapillær-lignende rørstrukturer. Et representativt bilde og det midlere antall telte rør i tre separate (x100) felt er vist i figur 4B og C, respektivt. Behandling med M867 kombinert for å stråling signifikant redusert tubuli dannelse sammenlignet med stråling alene (5,7 vs 1,7, p 0,001). Ingen behandling kontroll hadde 13 rørelementene (SD = 1,0) pr mikroskopisk felt og M867 alene hadde 9 rørelementene (SD = 1,0), noe som tyder på en anti-angiogen effekt av M867 i tillegg til den radio-sensibilisering.
Caspase 3 /7 mangel fremmer strålesensitivitet av autophagy induksjon i fravær av apoptose
å validere hvorvidt inhibering av kaspaser har bidratt til å øke strålebehandling, caspase-3/7 mangelfull (DKO) MEF-celler ble anvendt. Disse cellene er i stand til å gjennomgå apoptose, ettersom de mangler kaspaser 3/7, mens WT MEFs kan (figur 5A og 5B). Som vist i figur 5C, WT MEFs behandlet med M867 var mer følsomme for stråling i forhold til de WT MEFs behandlet med DMSO (DER = 1,2 for 5nM M867, p = 0,017, og DER = 1,62 for 10NM M867, p = 0,001). Det var ingen signifikant forskjell i overlevelse mellom kaspase DKO MEFs behandlet med en hvilken som helst dose av M867 sammenlignet med DMSO. I tillegg WT MEFs-celler transfektert med caspase-3/7 sirnas også presentert betydelig økning i strålingssensitivitet, noe som tyder på at disse resultatene ikke skyldes klonal variasjon av disse cellene (data ikke vist). Basert på vår tidligere studie, hypoteser om vi at forbedret strålesensitivitet i caspase DKO-celler kan skyldes alternative programmert celledød, for eksempel autofagi [8]. For å teste denne hypotesen, ble WT og caspase 3/7 DKO celler transfektert med GFP-LC3 plasmid. Celler med punktat GFP signale ble regnet som autophagic celler på grunn av den karakteristiske lysosomal lokalisering av LC3 protein i løpet av autofagi [19]. Etter WT og caspase DKO-celler ble utsatt for 5Gy av stråling, ble prosentandelen av celler med GFP punctates økte med ca. 3-fold i bestrålte kaspase DKO-celler, sammenlignet med bestrålte WT celler (30% vs 10%, henholdsvis) (figur 6A ). Ved 48h post-stråling, prosentandelen av autophagic celler økte til ~55% i kaspase DKO-celler sammenlignet med 15% i vekt av kontroll. Disse resultater ble også bekreftet ved å vurdere nivået av bearbeidet LC3 protein, hvor caspase DKO-celler viste økt nivå av LC3-I og II-proteinene etter bestråling sammenlignet med WT-celler (Figur 6B). Fordi mTOR veien er kjent for å regulere oppstart av autofagi, undersøkte vi Akt /mTOR signal ved å bestemme nivåene av fosfor-Akt og fosfor-S6 i bestrålte WT og caspase DKO MEF celler. Som vist i figur 6C, ble fosfo-proteinene økes i de bestrålte WT celler, mens de ble redusert i den bestrålte caspase DKO MEF-celler. Disse data tyder på at pro-autophagic signalering er oppregulert i bestrålt caspase DKO celler.
(A) WT og caspase 3/7 DKO MEFs ble inkubert med Annexin V-fluoresceinisotiocyanat og propidiumjodid- 24 timer etter bestråling og analysert ved FACScan. Data er vist som gjennomsnittet av tre forsøk S.D. (B) caspase spalting ble bestemt ved immunblotting av spaltet caspase-3 etter WT eller caspase 3/7 DKO MEF-celler ble behandlet med 0, 2.5, 5, 7.5, og 10 Gy. Cellene ble høstet etter 24 (C) bestrålingssensibilisering av WT eller caspase 3/7 DKO MEFs. Cellene ble bestrålt med de angitte doser av stråling og behandlet med DMSO kontroll eller M867 (doseområde fra 5 til 10 nM for 24 timer). Etter 10 dager ble kolonier farget og scoret. Rapporterte verdier er gjennomsnitt ± S.D. av tre separate gjentatte forsøk.
(A) GFP-LC3-transfekterte WT eller caspase 3/7 DKO MEF celler ble behandlet med og uten 5 Gy og deretter undersøkt av fluorescens mikroskopi etter 24 timer. Prosentandelen av celler med punktformet GFP-LC3 fluorescens ble beregnet i forhold til alle GFP-positive celler. Feilfelt vises som gjennomsnitt standardavvik (B) LC-I og -II-ekspresjon ble bestemt ved Western blot ved anvendelse av lysater fra WT og Caspase 3/7 DKO MEF-celler behandlet med 0 eller 5 Gy etter 24, 48 timer. Actin ble analysert for å demonstrere lik belastning. (C) er også vist immunoblotter av fosfor-Akt og p-S6 bruker lysatene fra WT og caspase 3/7 DKO MEF celler behandlet med 0 eller 5 Gy etter 30 min. (D) WT og caspase 3/7 DKO MEF-celler ble transfektert med enten kontroll siRNA eller 25 nM sirnas rettet mot ATG5 og Beclin-1 eller (E) transfektert med vektoren eller ATG5 og Beclin-1 cDNA-inneholdende plasmider. De ble deretter bestrålt med på 0 til 6 Gy. Etter 8 dager ble kolonier farget og scoret. Verdier som vises er gjennomsnittet ± S.D. av tre separate gjentatte forsøk.
Autophagy endrer stråling følsomhet i caspase 3/7 manglende celler
For å avgjøre om autofagi er mekanismen ansvarlig for høyere Radiosensitivity observert i caspase DKO celler, uttrykk av ATG-5 og Beclin-en, to essensielle autofagi proteiner [21], [22], [23], ble slått ned i villtype og caspase DKO celler. Tidligere studier har vist at siRNA mot Beclin-en og ATG-5 spesielt downregulated endogent protein uttrykk [8]. Som vist i figur 6D, behandling av kaspase DKO-celler med sirnas rettet mot ATG-5 og Beclin-en opphevet den sensibiliserende virkning som følge av caspase-3/7 sletting og forårsaket betydelig økning av klonogene celleoverlevelse sammenlignet med kontroll siRNA behandling av kaspase DKO-celler (DER = 1,34, p = 0,008). Omvendt, overekspresjon av Beclin-1 og ATG-5 i kaspase DKO-celler forårsaket vesentlig økning i klonogene celledød under økende strålingsdose i forhold til Beclin-1 og ATG-5 overekspresjon i WT-celler (DER = 1,32, p = 0,008) ( Figur 6E). Sammen utgjør disse resultatene viser at økt Radiosensitivity i caspase DKO celler er avhengig av nøkkel autofagi molekyler.
Diskusjoner
I denne rapporten, først viste vi at M867 behandling resulterte i effektiv bestrålingssensibilisering av lunge kreftceller
in vitro
. De potensielle terapeutiske virkninger ved M867 ble deretter vist i en
in vivo
mus hind lem tumor modell. Videre in vitro eksperimenter viste at caspase-3/7-null MEF celler, var mer følsomme for den cytotoksiske effekten av stråling, hovedsakelig på grunn av økt autofagi. Denne studien antyder også at M867 effekter på blodkar kan bidra til den observerte økning i tumorvekst forsinkelse lunge som svar på stråling.
Samtidig kjemoradioterapi er en bærebjelke i behandling av avansert lungekreft, men prognosen for disse pasientene fortsatt globalt dårlig. Derfor er nye strategier for å forbedre dagens behandlingseffektivitet ved målretting av ikke-apoptotisk celledød siden apoptose er begrenset følgende konvensjonell terapi. Nylig har det vært en stor vekt på autofagi som en kreftbehandling målet, delvis drevet av observasjoner som kreft behandlinger indusert autofagi, for eksempel i bestrålte kreftceller [17], [24]. Vi viste nylig at autofagi kan utløses ved å inhibere pattedyr målet eller rapamycin (mTOR) pathway [17], eller ved å inhibere pro-apoptotiske proteiner Bak /Bax for å forbedre strålingseffekten
in vitro product: [8]. Et meget attraktivt mål i den apoptotiske reaksjonsvei er caspase-3, som har en sentral rolle i apoptose som den dominerende effektor caspase involvert i proteolytisk spaltning av protein underlag, inkludert cytoskeletal proteiner, kinaser og DNA-reparasjonsenzymer. I denne studien analyserte vi de potensielle effektene av caspase-3-hemming på lungekreft respons på stråling med romanen inhibitor M867. Vi viste at administreringen av M867 i kombinasjon med ioniserende stråling minsket dramatisk overlevelsen av H460-lungekreftceller (figur 1), på en doseavhengig måte. Av notatet, observerte vi økt cytotoksisitet på konsentrasjon høyere enn 10 nM i vår klonogene analysen. Likevel har det vist seg at M867 er en potent og reversibel caspase-3-inhibitor (IC
50 av 0,0001 uM), og en mindre potent caspase-7-inhibitor (IC
50 til 0,036 uM) [18]. I tillegg fant vi at radiosensitizing effekten av M867 er avhengig av caspase-3 og -7, som demonstrert av fraværet av dens innvirkning på caspase 3/7 DKO celler.
