Abstract
Bakgrunn
Regulatory T-celler (Treg) uttrykker transkripsjonsfaktor gaffelhode-box protein P3 (foxp3) har blitt identifisert til å motvirke anti-tumor immunrespons i løpet av tumorprogresjon. Dessuten, foxp3 presentasjon av kreftceller i seg selv kan også tillate dem å unnvike fra effektor-T-celle-responser, noe som resulterer i en overlevelsesfordel av svulsten. For tykktarmskreft (CRC) den kliniske relevansen av foxp3 ikke har blitt vurdert i detalj. Derfor er målet med denne studien var å studere dens innvirkning på tykktarmskreft (CRC).
Metoder og funn
Gene og protein analyse av tumorvev fra pasienter med CRC ble utført for å kvantifisere uttrykket av foxp3 i tumor infiltrerer treg og tykktarmskreftceller. Resultatene var korrelert med clinicopathological parametere og pasienter total overlevelse. Serial morfologisk analyse viste foxp3 til å bli uttrykt i cancerceller. Høy foxp3 uttrykk for kreft celler var assosiert med dårlig prognose i forhold til pasienter med lav foxp3 uttrykk. I kontrast, lav og høy foxp3 nivå i tumor infiltrerer Treg celler viste ingen signifikante forskjeller i samlet pasientens overlevelse.
Konklusjoner
Våre funn tyder sterkt på at foxp3 uttrykk formidles av kreftceller i stedet for av treg celler bidrar til sykdomsprogresjon
Citation. Kim M, Grimmig T, Grimm M, Lazariotou M, Meier E, Rosenwald A, et al. (2013) uttrykk for foxp3 i tykktarmskreft, men ikke i Treg celler korrelerer med sykdomsprogresjon hos pasienter med tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (1): e53630. doi: 10,1371 /journal.pone.0053630
Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina
mottatt: 07.11.2011; Godkjent: 03.12.2012; Publisert: 30 januar 2013
Copyright: © 2013 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Identifiseringen av CD4 + CD25 + T regulatoriske celler ( treg) har vist seg å spille en avgjørende rolle i å opprettholde immunologisk toleranse. Transkripsjonsfaktor gaffelhode boks protein P3 (foxp3) har blitt identifisert som en sentral aktør i Treg funksjon og er en obligat markør for CD4 + CD25 + Treg [1]. Enkelte undergrupper av treg utøve sin undertrykkende påvirkning via ekspresjon av immunosuppressive cytokiner, slik som interleukin (IL) -10 og transformerende vekstfaktor (TGF) -β [2], [3]. En høy tetthet av tumor-infiltrerende foxp3 + treg i tumorprøven har blitt assosiert med dårlig resultat i forskjellige faste tumorer, inkludert ovarial [4], bukspyttkjertel [5], og hepatocellulært karsinom [6]. Disse funnene tyder på en avgjørende rolle for treg i ulike kreft enheter. Dermed rettet mot treg kan ha en viktig innflytelse på immunterapeutiske anti-kreft strategier og kliniske resultatet av kreftpasienter [7].
Treg er mistenkt for å redusere T-celle aktivitet, men det er ikke kjent om tilstedeværelsen av treg kan ha en innvirkning på den kliniske utviklingen og på tumorrelatert overlevelse av pasienter med CRC. Den prognostiske betydningen av treg påvisning hos pasienter med begrenset og avansert sykdom er fremdeles kontroversielt. Hittil har få studier analysert infiltrere treg i CRC bruker foxp3 + farging. En fersk studie viste at Treg tettheten var høyere i lokalt begrenset enn i metastatisk sykdom, men var ikke assosiert med overlevelse av CRC pasienter [8]. I motsetning til resultatene observert i de fleste andre humane karsinomer ble det ikke observert noen signifikant sammenheng mellom det absolutte antall foxp3 + infiltrerende T-celler og prognose i flere studier med CRC-pasienter. Videre har en del andre studier tyder på at en høy hyppighet av tumor infiltrerende foxp3 + Treg er forbundet med gunstig prognose i CRC [9].
Nyere kliniske data fra lunge [10], bryst [11], [12] , bukspyttkjertel [13], hepatocellulær [14], og kreft i urinblæren [15] samt melanomer [16] gitt første bevis for en foxp3 uttrykk også i tumorceller. Det gjenstår imidlertid den biologiske betydning av foxp3 ekspresjon i kreftceller hos pasienter med CRC ukjent. Spesielt har bidraget av foxp3 uttrykk relatert til tumorceller i forhold til uttrykk i forbindelse med treg i klinisk CRC ikke blitt undersøkt så langt. Derfor hensikten med denne studien var å evaluere foxp3 uttrykk mellom tumor infiltrerer treg og kreftceller hos pasienter med CRC på ulike stadier av sykdommen, så vel som å diskriminere sin prognostisk betydning på lang sikt.
Resultater
Påvisning av CD4, CD25, foxp3 og immunsuppressive cytokiner IL-10 og TGF-beta gener ved RT-qPCR og immunhistokjemisk analyse
for å analysere om CD4, CD25, foxp3, IL-10, og TGF-β ekspresjon i CRC kan være forbundet med klinisk tumorprogresjon vi undersøkte svulster i begrenset sykdom (UICC i /II) og fremskreden sykdom (UICC III /IV). RT-qPCR-analyse viste en signifikant økning gen-ekspresjon av CD4 og CD25 i begrensede sykdoms tumorer (UICC I /II) sammenlignet med tumorer av fremskreden sykdom (UICC III /IV). I overensstemmelse med dette funn var genekspresjon av foxp3 og immunosuppressive cytokinene IL-10 og TGF-β signifikant redusert i begrensede sykdoms tumorer (UICC I /II) sammenlignet med de av fremskreden sykdom (UICC III /IV) (
figur
1A
).
(A) Betydelig økt genekspresjon av CD4 og CD25 på scenen UICC i /II sammenlignet med svulster på scenen UICC III /IV. Genekspresjon av foxp3, IL-10 og TGF-β ble signifikant redusert i trinn I /II sammenlignet med de på UICC III /IV. Den normaliseringen ble utført med normalt vev. Den relative kvantifiseringen verdi, fold forskjell, er uttrykt som 2
-ΔΔCt. * P 0,001. (B) foxp3 + IL-10 +, og TGF-β + uttrykkende kreftceller økte fra UICC I /II til UICC III /IV sammenliknet med normalt vev. Resultatet av fargingen ble uttrykt i prosent (%) positivitet. Alle verdier ble uttrykt som middelverdi ± SD; alle parvise tester (Tukey) resultere i p 0,001 med unntak av kontroll vs. UICC I /II i foxp3
+ (p 0,050).
Deretter undersøkte vi uttrykket av foxp3 og immunosuppressive cytokiner IL-10 og TGF-β i kreftceller. Som vist i
Figur
1B
, foxp3 +, IL-10 +, og TGF-β + uttrykker kreftceller økte fra tidlig til sent stadier av sykdommen sammenlignet med normalt vev. Foxp3
+ uttrykker kreftceller ble funnet i 60 av 65 kreft tilfeller (n = 60/65, 92,3%). I tillegg farget vi 36 av de samlede 65 tilfeller med et annet anti-foxp3 antistoff (klon 2481) og bekreftet resultatene (data ikke vist).
Immunhistokjemisk analyse av CD4 +, CD25 +, foxp3 +, og immunundertrykkende cytokiner IL -10+ og TGF-β + i treg
Vi neste undersøkt treg og kreftceller for en detaljert uttrykk analyse av foxp3, IL-10, og TGF-β ved immunhistokjemi. Først undersøkte vi ekspresjonen av CD4 +, CD25 +, foxp3 +, og immunosuppressive cytokinene IL-10 og TGF-p i treg. Som vist i
Figur
2A
, økt CD4 +, CD25 +, foxp3 +, IL-10 +, og TGF-β + uttrykk ble observert i et begrenset sykdoms tumorer (UICC I /II) sammenlignet til avansert sykdom tumorer (UICC III /IV) og normalt vev. Totalt sett foxp3 + uttrykke treg i forskjellige mengder ble funnet i 61 av 65 svulster pasientene (n = 61/65, 93,8%). Immunfluorescens dobbel farging vist at foxp3 + treg var av en CD4 + T-celle fenotype (
Figur
2B
). Bare en meget liten del av mindre enn 5% av cellene ble funnet å representere en CD8 + T-celle-subpopulasjoner som uttrykker foxp3 (data
ikke vist
).
(A) Økt CD4 +, CD25 +, foxp3 + IL-10 +, og TGF-β + ekspresjon i trinn UICC i /II sammenlignet med de på UICC III /IV. Resultatet av fargingen ble uttrykt i prosent (%) positivitet. Alle verdier ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Alle parvise tester resultere i p 0,001 med tre unntak: foxp3
+, kontroll vs. UICC III /IV, p = 0,091; IL-10
+, UICC I /II vs. UICC III /IV, p = 0,021; TGF-ß
+, UICC I /II vs. UICC III /IV, p = 0,020. (B) Representant eksempel på en immunfluorescens dobbel farging av foxp3 + og CD4 + i treg. Foxp3 ekspresjon ble hovedsakelig observert på CD4 + Treg (pil) (x 400 forstørrelse). FITC, grønn Fluoresceinisothiocyanate, Cy3, indocarbocyanin rød, og DAPI 4 «, 6-diamidino-2- phenylindoldihydrochlorid blå -. Atomkontra
Gene og protein analyse av foxp3 uttrykk i kreftceller fra pasienter med CRC og i humane tarmkreftcellelinjer ved RT-qPCR, immunfluorescens dobbel farging og flowcytometri
Først viste vi foxp3 uttrykk i kreftceller fra pasienter med CRC bruker immunfluorescens dobbel farging (
Figur
3
). For å bekrefte foxp3 uttrykk i tumorceller vi utførte RT-qPCR, FACS analyse og immunfluorescens dobbel farging analyser i ulike menneskelige tykktarmskreft cellelinjer (SW480, SW620, og HCT-116). Som demonstrert ved FACS 3,8% til 6,1% av kreftcellene faktisk uttrykt foxp3 (
Figur
4A og B
).
G
ene analyse av RT-qPCR bekreftet sitt uttrykk (relative uttrykk i cellelinjene varierte mellom 1,76 og 2,08,
Tabell
en
).
representativt eksempel på en immunfluorescens dobbel farging, viser foxp3 uttrykk og EpCAM costaining i kreftceller fra pasienter med CRC (× 100 forstørrelse ovenfor; × 400 forstørrelse nedenfor). FITC, grønn Fluoresceinisothiocyanate, Cy3, indocarbocyanin rød og DAPI 4 «, 6-diamidino-2- phenylindoldihydrochlorid blå -. Atomkontra
(A) Flowcytometri analyse av foxp3 uttrykk i SW480, SW620, og HCT-116 tykktarmskreft cellelinjer i forhold til isotypekontrollantistoff. 3,8% til 6,1% av tykktarm kreft celler express foxp3; PE: fysoerytrin; FS: forover scatter lineær. (B) Representative eksempler på immunfluorescens dobbel farging av foxp3 + uttrykk i SW480, SW620, og HCT-116 kreftceller. Cy3, indocarbocyanin rød og DAPI 4 «, 6-diamidino-2- phenylindoldihydrochlorid blå -. Atomkontra (× 400 forstørrelse)
Korrelasjonen av foxp3 + kreftceller med uttrykket av immundempende cytokiner IL -10 og TGF-β
for å undersøke om uttrykket av immunsuppressive cytokiner IL-10 og TGF-β korresponderte med foxp3 + uttrykker kreftceller vi stratifisert i to forskjellige grupper i henhold til de prosenter av uttrykk i immunhistokjemiske analyse. Tatt i betraktning foxp3 + ekspresjon i kreftceller som en kontinuerlig variabel, regresjonsanalyse viste at foxp3 + kreftcelle ekspresjon hadde en svak, men signifikant direkte sammenheng med uttrykk for de immunsuppressive cytokiner-10 IL (R
2 = 0,23, p 0,001, n = 65; r = 0,48) og TGF-β (R
2 = 0,33, p 0,001, n = 65; r = 0,57) (
Figur
5A og B
) .
(A /B) signifikant korrelasjon av foxp3 + kreftcelle ekspresjon med ekspresjon av IL-10 (A) og TGF-β (B). Regresjonsanalyse; R
2, koeffisienten. (C /D) representativt eksempel på en immunfluorescens dobbel farging av IL-10 + (C) og TGF-β + (D) i foxp3 + cancer celler (piler). FITC grønn Fluoresceinisothiocyanate, Cy3 rød og DAPI 4 «, 6-diamidino-2- phenylindoldihydrochlorid blå -. Atomkontra
immunfluorescens dobbeltfarging indikert uttrykk for de immunsuppressive cytokinene IL-10 og TGF-beta i foxp3 + uttrykker kreftceller (piler) (
Figur
5C og D
).
Korrelasjonen av foxp3 + treg med foxp3 + kreftceller
for å undersøke hvorvidt foxp3 + treg uttrykk korresponderte med foxp3 + kreftcelle uttrykk, vi stratifisert to forskjellige grupper i henhold til prosenter uttrykk for immunhistokjemisk analyse. Tatt i betraktning den foxp3 + kreftcelle uttrykk som en kontinuerlig variabel, regresjonsanalyse viste at foxp3 + kreftcelle ekspresjon hadde en svak, men signifikant invers korrelasjon med foxp3 + Treg uttrykket (R «sup> 2 = 0,17, p = 0,01, n = 65; r = -0,41) (
Figur
6A
). Immunhistokjemi viste økt foxp3 + treg uttrykk i foxp3 negativ kreft stromal vev (pil) (
Figur
6B
). I motsetning til dette var det ingen eller ubetydelig foxp3 + Treg ekspresjon funnet i foxp3 positiv kreft vev (pil) (
Fig
6C
).
(A) Signifikant invers korrelasjon foxp3 + kreftcelle uttrykk med foxp3 treg uttrykk. Regresjonsanalyse; R
2, koeffisienten. (B) Økt antall foxp3 + treg i foxp3 negativ kreft vev (pil). (C) Bare sporadisk eller ingen foxp3 + treg i foxp3 positive kreft vev (pil). DAB brun farge, Haemalaun blå farge – atomkontra. Representativt eksempel viser området forstørrelser x100 (til venstre) og x200 (til høyre).
Total overlevelse
multivariat Cox regresjonsanalyse ble utført trinnvis inkludert alder, kjønn, primærtumor (colon eller endetarm), UICC (i /II eller III /IV), dybde av tumorinvasjon (T kategori 1/2 eller 3/4), differensiering (1/2 eller 3/4), lymfeknutemetastase (N kategori), foxp3 (%), treg (%) TGF-P (%), og IL-10 (%). Den trinnvis prosedyre holdt i modellen N kategori og foxp3 uttrykk i tykktarm kreft celler som prognostiske parametre (Chi-QUADRAT statistikk, p 0,01,
Tabell
2
).
Univariate resultater ved hjelp av Kaplan-Meier
De identifiserte prognostiske faktorer fra Cox regresjonsmodellen presenteres i 7A og C. middelverdien av foxp3 + kreftcelle uttrykk ved immunhistokjemisk analyse for alle studert vevsprøver av de 65 svulster ble bestemt på 16%. Blant pasienter med CRC, de med høyt foxp3 + kreftcelle uttrykk ( 16%) hadde en dårligere prognose enn de med lav foxp3 + uttrykk nivåer ( 16%) (p 0,001, log rank test) (
Figur
7A
og Selge
Tabell
3
).
(A) Pasienter med høyt foxp3 + kreftcelle uttrykk ( 16%, som gjennomsnitt cut-off) hadde en dårligere prognose enn de med lav foxp3 + kreftcelle uttrykk profiler ( 16%, betyr cut-off: 16%), (p 0,001, log-rank test). (B) Ingen signifikant forskjell i total overlevelse sammenlikne pasienter med lav og høy foxp3 + treg uttrykk profiler (gjennomsnittlig cut-off: 12%), (p = 0,202, log-rank test). (C) Pasienter med lymfeknutemetastaser hadde en dårligere prognose enn de uten lymfeknutemetastase (p 0,001, log-rank test). Tider av sensurerte data er angitt med korte vertikale linjer.
Vurderer immunhistokjemisk analyse av prøvene fra de 65 vevsprøver for foxp3 + treg uttrykk gjennomsnittsverdien ble beregnet til 12%. Det var ingen signifikant forskjell i total overlevelse sammenlikne pasienter med lav og høy foxp3 + treg uttrykk nivåer ( 12% eller 12%) (p = 0,204, log rank test) (
Figur
7B
og Selge
Tabell
3
).
Hos pasienter uten lymfeknutemetastaser var signifikante forskjeller i total overlevelse sammenlignet med pasienter med lymfeknutemetastase. (p 0,001, log rank test) (
Figur
7C
)
Andre parametre som TGF-ß, IL-10, UICC, og T kategori viste også signifikante forskjeller i total overlevelse for tilsvarende lavere uttrykk og gradering, henholdsvis (p 0,001, log-rank tester)
Alder, kjønn, primær svulst, og histologisk differensiering ble ikke assosiert med. prognose i univariat analyse.
Diskusjoner
den aktuelle studien gir for første gang bevis for en betydelig økt tumorrelaterte uttrykk for transkripsjonsfaktoren foxp3 i kolorektal kreftceller som er forbundet med alvorlig prognose . Detaljert protein og gen-analyse ble brukt for å studere dets ekspresjon profiler i hvert tumorvev hos pasientene. Basert på mer nylig beskrevet kliniske funn av en foxp3 uttrykk i kreftceller av svulster som lunge, hepatocellulær, og kreft i urinblæren samt melanom vi antydet at forhøyede foxp3 uttrykk nivåer ble ikke nødvendigvis knyttet til treg alene, men også til kreftceller [10 ], [14], [15]. Ekspresjon av foxp3 av kreftceller vil gjøre dem i stand til å nedregulere effektor-T-celle-responser rettet mot tumoren. Dette vil gi kliniske bevis for en effektiv mekanisme for en direkte tumor-avledet unndragelse fra immunologiske ødeleggelse i CRC. Ved å diskriminere foxp3 uttrykk for kreftceller fra å infiltrere Treg og korrelere med total overlevelse over en langsiktig oppfølging vi gi ny innsikt i sin prognostisk betydning.
I samsvar med tidligere studier i ulike ondartede sykdommer fant vi signifikant høyere antall infiltrerende treg (CD4 + CD25 + foxp3 +) i alle CRC-prøvene sammenlignet med normale vev kolon [4] – [6], [17] – [20]. Men foreningen av foxp3 uttrykk i Treg og dens innvirkning på total overlevelse er fortsatt kontroversielt. Tvetydige data tyder på at tumorinfiltrasjon av foxp3 + Treg ikke er alltid forbundet med en dårlig prognose, men tvert imot, kan være forbundet med en forbedret prognose i enkelte krefttyper som i CRC [8], [9], [21], [22]. Videre ble det ikke observert noen signifikant sammenheng mellom det absolutte antall foxp3 + Treg og prognose i CRC [23], [24]. Forbedret overlevelse og den potensielt beskyttende rolle av treg, kan forklares ved deres evne til å redusere utviklingen av en aggressiv og cytotoksisk, potensielt proliferogenic cytokin miljø, noe som er grunnlaget for en betennelses drevet fremdrift av maligne sykdommer, [25], [26] .
Eksperimentelle studier på mus viste at CD4 + CD25 + treg ikke bare spille en sentral rolle i opprettholdelsen av immunologisk toleranse men treg er også potente hemmere av antitumor immunresponser [27], [28]. Tidligere studier har undersøkt de undertrykkende kapasiteter på CD8 + CD25 + foxp3 + T-celler i kolorektal kreft vev [29]. I CRC eksemplarer det absolutte antall CD8 + CD25 + foxp3 + T-celler var lav (mindre enn 5%). I tillegg er disse cellene var fraværende i de fleste normale vevsprøver, men er tilstede i de fleste CRC prøver; men deres kliniske relevansen er ukjent [29]. Flere grupper observert foxp3 ekspresjon av forskjellige krefttyper og dens potensielle rolle i immunovervåking ved å produsere immunundertrykkende cytokiner som IL-10 og TGF-β [30].
Til slutt, analyserte vi den totale overlevelse av pasienter med lave eller høy foxp3 + treg infiltrasjon i tumoren sammenlignet med overlevelse av pasienter med lav eller høy foxp3 ekspresjon av sine kreftceller. Pasienter med høy foxp3 + uttrykk profil i kreftceller var assosiert med dårligere prognose enn pasienter med lav uttrykk profilen foxp3 + i sine kreftceller. Denne korrelasjonen av høy foxp3 uttrykksmønster med dårlig prognose ble ikke observert for infiltrering av treg i tumoren. Kreftceller ekspresjon av foxp3 fulgt av sekresjon av cytokiner immunosuppressive inn i mikromiljøet av tumorvevet kan gi svulsten et kraftig verktøy for å omgå immunologisk ødeleggelse. Interessant nok ble det observert en invers korrelasjon mellom antall foxp3 + Treg og nivået av foxp3 + kreftceller i våre pasienter med CRC foreslår en anti-proliferativ effekt av TGF-β på treg.
Som konklusjon, til tross for det faktum at prøvestørrelsen i denne gruppen er liten for å trekke endelige konklusjon, viser vår studie for dette første gang at høy foxp3 ekspresjon i kreftceller er forbundet med en sturen prognose i CRC. Multivariat Cox regresjonsanalyse viste lymfeknutemetastase (N kategori) og foxp3 uttrykk i tykktarm kreft celler som viktige prognostiske parametre for å overleve i menneskelig CRC.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Etisk godkjenning for denne forskningen ble hentet fra human forskningsetiske komité ved Universitetet i Würzburg. Alle pasienter som gir svulstvevet samt prøver normale kolon vev signerte en samtykkeerklæring før kirurgisk fjerning av tarmkreft for å tillate denne forskningen som skal utføres.
Pasienter og kontroller
Sixty- fem pasienter med histologisk bekreftet CRC kreft omgår kurativ kirurgisk reseksjon i fargen mellom 01/2001 og 06/2004 ble inkludert i studien. Histologisk fasen av svulsten ble bestemt i henhold til Union Internationale Contre le Cancer (UICC) -TNM staging system [31]. Svulster ble evaluert for plassering, scene, og differensiering klasse. Data om alder, kjønn, nivå av veggen infiltrasjon, og lymfeknutemetastase ble samlet i en database. Regelmessige legebesøk av pasienter etter kurativ behandling ble utført med intervaller i henhold til de statlige retningslinjene for kreftpasienter. Pasienter som gjennomgikk noen neoadjuvant behandling eller R1 reseksjon ble ekskludert fra analysen. Tumor vevsprøver, så vel som eksempler normale tykktarm vev fra pasienter ble frosset umiddelbart i flytende nitrogen, og lagret ved -80 ° C inntil analyse. Normale kolon vev fra friske individer fungerte som kontroller (n = 10). Immunhistokjemisk analyse bekreftet at ingen analysert svulst fra pasienten kohort uttrykt hMLH1 og hMSH2 veiledende for mikro ustabilitet (positiv mismatch reparasjon [MMR] status). Den mucinous fenotype av CRC kan være assosiert med falske positive subcellulære reaksjoner ved immunhistokjemi og ble derfor ekskludert fra studien. Kliniske kjennetegn ved studiepopulasjonen er oppsummert i
Tabell 3
. Alle pasienter fullførte minst et 60 måneders oppfølging etter reseksjon.
Cell kultur
Den menneskelige tykktarmskreft cellelinjer SW620, ble SW480, og HCT-116 hentet fra ATCC (Manassas, VA ) og cellene ble dyrket ved 37 ° C i 5% CO
2 under anvendelse av RPMI 1640-medium (Life Technologies, GIBCO, Carlsbad, CA) tilsatt 10% (v /v) føtalt bovint serum (Life Technologies, GIBCO, Carlsbad , CA), 1% (v /v) L-glutamin (Biochrom AG, Berlin, Tyskland) og 1% (v /v) penicillin /streptomycin (Biochrom AG, Berlin, Tyskland).
Flowcytometri analyse (FACS)
kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP fra menneskets tykktarm kreft cellelinjer SW620, SW480, og HCT-116 ble høstet på en eksponentiell vekstfase ved hjelp av enzymet gratis celledissosiasjon løsning (Merck Millipore, Billerica, MA) og analysert for foxp3 uttrykk. Etter vask med dPBS (Life Technologies, GIBCO, Carlsbad, CA) to ganger, 5 × 10
5 celler ble behandlet med foxp3 flekker buffer kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner og inkuberes med PE konjugerte antilegeme foxp3 eller lgG1 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) i 30 minutter ved 4 ° C i mørket. Fluorescensen av foxp3 ble målt og analysert med FACS strømningscytometer (Coulter EPICS XL, Beckman Coulter, Brea, USA).
Immunohistokjemisk og immunofluorescerende farging
CD4 og CD25-antistoffer ble gjort tilgjengelig av Dako (Hamburg, Tyskland). To forskjellige foxp3 antistoff kloner (ab22510 mus monoklonale og ab2481 geit polyklonale) ble anskaffet fra Abcam (Cambridge, UK), TGF-β antistoff ble levert av Serotec (Dusseldorf, Tyskland), og IL-10-antistoff ved R & D Systems (Wiesbaden -Nordenstadt, Tyskland). Isotype kontroll-antistoffer ble innkjøpt fra eBioscience (San Diego, USA). Sekundære antistoffer som brukes for immunfluorescens dobbel farging og immunhistokjemi ble gitt av Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Suffolk, England). Sekundær EpCAM og CD4-antistoffer ble FITC-konjugert AffiniPure esel anti-geit IgG og sekundært antistoff fra foxp3, IL-10 og TGF-β var Cy3-konjugert AffiniPure esel-anti-muse-IgG ved en fortynning 1:200 (Jackson Immunoresearch).
For Cytospin forberedelser kolorektal carcinoma celler fra pasienter med CRC ble dyrket i kortsiktige primærkulturer og etablerte menneskelige tykktarmskreft cellelinjer ble høstet på en eksponentiell vekstfase ved hjelp av enzymet gratis celledissosiasjon løsning (Merck Millipore, Billerica , MA). Etter vasking med dPBS (Life Technologies, GIBCO, Carlsbad, CA) to ganger, ble cellene regulert til en konsentrasjon på 2 x 10
5 celler /ml. Cytospins ble utført med 50 ul cellesuspensjon ved 550 rpm i 1 minutt i en Cytospin4 cytosentrifuge (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).
farging av CD4, CD25, foxp3, TGF-β, og IL- 10 ble utført på serie kryostatsnitt av de 65 snap-frosset CRC eksemplarer i tidlig stadium svulster (UICC i /II) og sene stadier av tumorer (UICC III /IV) med nabo normal kolon vev og 10 normale kolon prøver. Alle tumorer farget positivt for cytokeratin-20 (CK-20) (Dako, Hamburg, Tyskland) og negativ for cytokeratin-7 (CK-7) (Dako), et mønster karakteristisk for colon adenokarsinom [32]. Først vurderte vi H.E. seksjoner fra hver svulstvev å skille mellom kreftcelleområder, stromale områder og infiltrere immunceller. Vi deretter farget for CD4, CD25, foxp3, TGF-β, og IL-10 i følgende seriesnitt. For foxp3 uttrykk cytoplasma, perinukleær cytoplasma, og nukleær farging mønster ble ulikt bestemt [30]. Serial kryostatsnitt (5 um) ble inkubert med det primære antistoff eller kontroll-antistoff, og med sekundære FITC-konjugert (Fluoresceinisothiocyanate) antistoff. Da objektglassene ble deretter inkubert med det andre primære antistoffet, etterfulgt av inkubasjon med sekundær Cy3-konjugert antistoff. Lysbilder ble kontra med DAPI (4 «, 6-diamidino-to-phenylindoldihydrochlorid) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Tyskland) og dekket med Polyvinyl-alkohol montering medium (DABCO, Sigma-Aldrich) og analysert ved hjelp av en Zeiss-kamera (Oberkochen, Tyskland).
for immunhistokjemi, forbehandlingen (fiksering) av lysbildene var den samme som beskrevet for immunofluorescens. Etter inkubasjon med det primære antistoff, anvendte vi en pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert AffiniPure Esel-anti-mus eller et esel anti-geite-IgG (Jackson Immunoresearch). Lysbilder ble deretter inkubert i DAB (3,3′-diaminobenzidin) (Biogenex, San Ramon, USA), kontra med Haemalaun og montert med Glycergel (Dako, Hamburg, Tyskland). Kvantifisering av hver immunoenzymatic farging av tumorceller av 65 individuelle tumorvev i seks separate forstørret felt (× 400 forstørrelse) for hver farging prøven ble scoret av cellen telling utført av to uavhengige etterforskere blindet for den underliggende sykdommen. Den forstørrede felt var representativt for hele svulsten delen. Resultatet av fargingen ble uttrykt i prosent (%) positivitet. Alle verdier ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
Sanntids kvantitativ revers transkripsjon-PCR-analyse
For å analysere genuttrykk av CD4, CD25, foxp3, TGF-β og IL-10 ved RT-qPCR, ekstrahert vi total cellulær RNA ved bruk av RNeasy MINIKIT fra Qiagen (Hilden, Tyskland). Områder av interesse (bare epitelceller regioner) for hvert vev seksjon ble manuelt microdissected ved hjelp av en skalpell blad. Like mengder av vevsområder ble vurdert (2 x 1,5 cm
2 overflateareal per seksjon, tykkelse på 10 um). RNA ekstraksjon av pasientprøver og etablerte menneskelige kolon cellelinjer (for foxp3) ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Primersett ble hentet fra Qiagen, 18S RNA primer parene (termin: TCA AGA ACG AAA GTC GGA GGT TCG, omvendt: TTA TTG CTC AAT CTC GGG TGG CTG) ble designet av Biomers (Ulm, Tyskland). Matchet menneskelige kolon cDNA ble kjøpt fra Pharmingen (Heidelberg, Tyskland) som kontroll og ble standardisert til baseline. Den husholdningsgener glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), ß-aktin, og 18S RNA [33] ble anvendt for relativ kvantifisering og kvalitetskontroll cDNA. Alle PCR reaksjoner ble utført med en DNA Engine Opticon 2 System (MJ Research, Biozym, Oldendorf, Tyskland). Den relative kvantifiseringen verdi, fold forskjell, ble uttrykt som 2
-ΔΔCt. For analyse i tykktarmskreft cellelinjer uttrykk er angitt i middelverdi, ΔCt og relative uttrykk (foxp3 /Rengjøring gener).
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SAS 9.2. Total overlevelse ble definert som perioden mellom randomisering og død uansett årsak. Pasienter som ble tapt for oppfølging ble sensurert på datoen for siste kontakt. Den total overlevelse ble evaluert ved hjelp av PROC PHREG (Cox Model). Parametrene for prognostisk potensial, identifisert i en trinnvis prosedyre, har blitt ytterligere undersøkt av Kaplan-Meier-metoden (PROC LIFETEST). For univariat analyse mener cut-off verdi for enten høy eller lav uttrykk ble satt til 12% for foxp3 i tumor infiltrerer Treg og 16% for foxp3 i kreftceller. Univariat analyse av betydning for foxp3 uttrykk for svulst infiltrere Treg og kreftcelle uttrykk forskjeller i overlevelseskurver ble evaluert av Log-rank test. På samme måte overlevelseskurver ble sammenlignet for N og T kategorier så vel som primære svulsten.
to uavhengige grupper av pasienter ble analysert ved anvendelse av Students t test (Satterthwaite). Mer enn to gruppene ble analysert søknad PROC GLM (analyse av avvik) med post-hoc testing (Tukey). Frekvensfordelinger ble sammenliknet med kxm tabeller (Chi-QUADRAT). Pearsons korrelasjonskoeffisient ble brukt for å beskrive og å teste bivariate sammenhenger. En p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Takk
Forfatterne takke Mr. Dipl.-Math. Mathias Brosz for statistisk rådgivning og Mrs. Sabine Müller-Morath, fru Mariola Dragan, Ms. Nadine Gutermuth, og fru Ingrid Strauss for deres tekniske support.
