Abstract
Tocopherylquinone (TQ), oksidasjon produkt av alfa-tokoferol (AT), er et bioaktivt molekyl med forskjellige egenskaper fra AT. I denne studien er AT og TQ forsket for sine komparative effekter på vekst og androgene aktivitet i prostatakreftceller. TQ potent hemmet veksten av androgen-responsive prostatakreftcellelinjer (f.eks, LAPC4 og LNCaP celler), mens veksten av androgen-uavhengig prostatakreftceller (f.eks DU145 cellene) ble ikke påvirket av TQ. På grunn av den veksthemmende effekter indusert av TQ på androgen-responsive celler, ble anti-androgene egenskaper av TQ undersøkt. TQ hemmet androgen-indusert aktivering av en androgen-responsive reporter og hemmet frigjøring av prostataspesifikt antigen fra LNCaP celler. TQ forbehandling ble også funnet å hemme AR aktivering som målt ved bruk av Multifunksjonell Androgen Receptor screeningsbestemmelsen. Videre redusert TQ androgen-responsive genekspresjon, inkludert TM4SF1, KLK2, og PSA i løpet av fem-ganger, mens ved ikke påvirker ekspresjonen av androgen-responsive gener. Av betydning, ble antiandrogene virkninger av TQ for prostatacancerceller funnet å resultere fra androgen-reseptor-protein nedregulering produsert av TQ som ikke ble observert med AT behandling. Videre ingen av androgene endepunkter vurderes ble påvirket av AT. Nedregulering av androgen-reseptor-protein ved TQ ble opphevet ved samtidig behandling med antioksidanter. Totalt sett den biologiske effekten av TQ ble funnet å være forskjellig fra AT, hvor TQ ble funnet å være en potent hemmer av cellevekst og androgene aktivitet i androgen-responsive prostatakreftceller
Citation. Fajardo AM, MacKenzie DA, Olguin SL, Scariano JK, Rabinowitz jeg, Thompson TA (2016) Antioksidanter oppheve Alpha-Tocopherylquinone-mediert nedregulering av androgen Receptor i androgen-Responsive prostata kreft celler. PLoS ONE 11 (3): e0151525. doi: 10,1371 /journal.pone.0151525
Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 21 oktober 2015; Godkjent: 28 februar 2016; Publisert: 17 mars 2016
Copyright: © 2016 Fajardo et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Støtte ble gitt av National Institutes of Health Grant, gir nummer: 1 R03 CA133941 (TAT) og University of New Mexico Cancer Center Focus-Interactive Gruppe Award (TAT og IR). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
rolle antioksidant handling i kreftutvikling og progresjon er uklart. Vitamin E er en familie av naturlig forekommende kostholdsfaktorer (f.eks α-, β-, γ-, δ-tokoferoler og -tocotrienols) med et stort biologisk aktiv form anerkjent som RRR-α-tokoferol (RRR-AT) [1, 2]. α-tokoferol (AT) virker hovedsakelig som en antioksidant, og reduserer cellulær oksidativ skade produsert av oksiderte lipider [1,2]. Den store oksidasjonsprodukt av AT er α-tocopherylquinone (TQ), som er dannet av to-elektron oksydasjon av kromanol-delen av AT (figur 1). TQ har distinkte kjemiske egenskaper sammenlignet med AT med en unik spektrum av biomolekylære handlinger [3]. For eksempel har TQ blitt vist å hemme veksten av tykktarmskreftceller, mens ved ikke ble observert å forandre veksten av disse cellene [4]. Selv TQ er etablert som et bioaktivt kinon for visse typer kreft, dens virkning på prostatakreft cellevekst og androgene trasé i prostatakreftceller er ukjent.
AR er en nødvendig bidragsyter til prostatakreft utvikling og er anerkjent som en meningsfylt mål for prostatakreft forebygging og behandling [5]. Dette støttes av betydningen av AR i prostata cancer progresjon [6-8], og fra resultatet av studier med inhibitorer av testosteron metabolismen til å forhindre prostatakreft utvikling [8,9]. AR er et medlem av steroid hormon /nukleær reseptor superfamilien [10], som virker som en ligand-aktivert transkripsjonsfaktor for gener som er involvert i vekst, overlevelse og differensiering av prostata [11]. I tillegg bidrar AR-aktivitet til utvikling, progresjon og opprettholdelse av prostatakreft [7,12]. Klinisk blir nedregulering av AR aktivering oppnådd gjennom en rekke midler som inkluderer den direkte innblanding av androgen-binding til AR som med AR-antagonister, ved å redusere dihydrotestosteron produksjon med 5-alfa-reduktasehemmere, eller ved å redusere produksjonen av testosteron av gonadotropin-frigjørende hormon agonister og CYP17A1 hemmere [7,12,13]. Disse strategiene ikke direkte rettet mot uttrykket av AR protein og dermed under disse tiltakene, forblir AR funksjonell.
Informasjon om de biologiske handlinger TQ er begrenset i forhold til de mer omfattende undersøkelser på AT. Til dags dato er det ingen studier som undersøker effekten av TQ på cellevekst og androgene aktivitet i prostatakreftceller. Imidlertid modulering av AR-aktivitet av AT-relaterte midler har blitt rapportert. Mekanismen for androgene inhibering av disse kjemikaliene kan være direkte eller indirekte. For eksempel har vi tidligere har vist at kromanol delen av AT blokker androgen aktivitet ved kompetitiv inhibering av androgen-binding til AR [14]. Direkte inhibering av AR har blitt observert med AT-suksinat, en mer vannoppløselig ester-derivat av AT, som har vist seg å ned-regulere AR-protein i androgen-responsive prostatakreftceller [15]. Fordi på analoger og derivater har vist biologisk tiltak mot prostata kreft celler, mens handlingene til oksidasjon produkt av AT i prostata kreft er ukjent, rettet vi å finne ut om TQ besatt unikt biologisk handling i prostatakreftceller. I denne studien ble effekten av både AT og TQ for prostatacancer celleproliferasjon, anti-androgen aktivitet, og potensiell mekanisme av AR-protein nedregule evaluert. Sammenlignet med AT, ble TQ funnet å ha karakteristiske egenskaper på androgen-responsive prostatacancer-cellelinjer med bemerkelsesverdige virkninger på ekspresjonen av AR. Antioksydanter ble funnet å modifisere virkningene av TQ på disse cellene. Denne studien begynner å belyse mekanismen av TQ på å hemme AR protein uttrykk som kan være gjennom sin aktivitet for å endre redoks staten i prostatakreftceller.
Resultater
Hemming av celleproliferasjon i androgen- sensitive prostatacancercellelinjer ved TQ
Tidligere studier har vist at ester-konjugert, vannoppløselige VE-analoger (for eksempel vitamin E succinat) kan hemme prostatakreft cellevekst i kultur [15,16]. På grunn av bekymringer angående fremstilling av de fysiologisk aktive frie former av AT og TQ fra de konjugerte former, ble den ukonjugerte, frie former av disse midler undersøkt. Ettersom de frie former av AT og TQ har lav vandig løselighet, ble et bærerbasert levering metode som er utviklet for å administrere de frie former av disse midler i cellekultur, som beskrevet i
Materialer og metoder
. AT behandling hadde minimal effekt på veksten av androgen-sensitive LAPC4 og LNCaP celler samt androgen-uavhengig DU145 prostata kreft celler etter behandling med konsentrasjoner av opptil 40 mikrometer (Fig 2A). I motsetning til dette, TQ behandling produserte en doseavhengig vekst reduksjon av androgen-responsive LAPC4 og LNCaP prostata kreftceller, mens veksten av DU145-celler ikke ble påvirket av TQ ved doser opp til 40 uM (figur 2B). I en mer løst dose-respons med LAPC4 celler, EF
50 av TQ for inhibering av cellevekst ble funnet å være 8,2 um (figur 2C). Tilsvarende, i en fokusdannende analyse av LNCaP cellevekst, ble TQ funnet å hemme dannelsen fokus, mens ved ikke påvirker fokusdannelse (figur 2D). For å finne ut om hemming av cellevekst ved TQ var delvis på grunn av effekter på celle levedyktighet, ble DU145, LAPC4 og LNCaP celleviabilitet målt ved hemocytometry og trypanblått eksklusjon. Levedyktigheten av celler behandlet med 5, 10 og 25 uM TQ var ikke forskjellig fra bærer-behandlede celler (figur 2E). I tillegg er en strømningscytometrisk basert propidiumjodid utelukkelse analyse av LNCaP-celler viste 92,4% (± 1,4%) levedyktighet i vehikkelbehandlede kontroller og 93,2% (± 1,2%) for 25 uM TQ-behandlede LNCaP-celler. For DU145 cellene, 94,7% (± 1,0%) ble observert levedyktighet i behandlede kontroller og 94,4% (± 1,3%) for 25 um TQ-behandlede celler ved propidiumjodid utstøting, ytterligere støtte som TQ ikke akutt påvirke cellulære levedyktighet på doser opp til 25 mikrometer. LNCaP-celler ble behandlet med enten 10 eller 25 uM TQ viste en økning i antall celler i G1 fase med en samtidig reduksjon i S-faseceller (Fig 2F). Disse data underbygger at TQ hemmer androgen-sensitive prostatacancer celleproliferasjon gjennom en G1 arrest ved doser som ikke reduserer levedyktigheten til disse cellene.
A-F. TQ-mediert inhibering av celleproliferasjon, men ikke levedyktighet, i prostata kreftcellelinjer. (A) AT vekstanalyse i androgen-sensitive LAPC4 og LNCaP celler og androgen-uavhengig DU145 prostata kreft celler. (B) Dose-respons av DU145, LAPC4, og LNCaP cellevekst i celler behandlet med TQ for 4 d. (C) TQ EF
50 besluttsomhet for LAPC4 cellevekst. (D) Bestemmelse av LNCaP vekst foci etter behandling med enten 10 uM AT eller 10 pM TQ for 5 d. (E) Levedyktigheten analyse i DU145, LAPC4 og LNCaP-celler på 5, 10, og 25 uM TQ i 48 timer uten noen reduksjon i celleviabilitet. (F) cellesyklusanalyse (dvs. DNA-innhold) i LNCaP-celler behandlet med 10 og 25 uM TQ viser et G1 arrest. *
P
. 0,05
TQ, ikke AT, reduserer behandling AR aktivitet og AR regulert mRNA transkripsjonsnivåer
Studier for å fastslå om TQ eller ved modulert AR aktivitet ble igangsatt ved hjelp av en androgen-sensitive luciferase reporter system. For denne studien ble androgen-følsomme rapportøraktivitet stimuleres ved hjelp av den syntetiske androgen R1881 og ble vurdert etter behandling med enten 30 uM TQ eller AT (figur 3A). TQ behandling alene ikke modulere reporter aktivitet. I motsetning til dette ble TQ funnet å inhibere R1881-indusert aktivering reporter etter to d i forhold til R1881-stimulerte kontrollceller. Overraskende, 30 pm til behandling økt androgen-sensitive reporter aktivitet (figur 3A). Disse dataene støtter en hemmende rolle for TQ på AR-aktivitet i motsetning til AT, som ikke utviser antiandrogene aktivitet.
A-D. Hemming av androgene reaksjoner i LNCaP celler ved TQ behandling. (A) androgen-induserte [dvs. R1881 (R)] luciferase-ekspresjon fra en androgen-følsomme promoter målt etter TQ eller AT behandling i 48 timer. Bikalutamid ble anvendt som en androgen reseptor antagonist. (B) PSA meldingen ble stimulert med 50 pM R1881 eksponering i LNCaP celler og målte 4 d etter TQ eller AT behandling. (C) PC3-celler ko-transfektert med en androgen reseptor ekspresjonsvektor og en androgen responsiv-GFP reporter stimulert med R1881. Celler behandlet med bærer (venstre panel) og 25 uM TQ (høyre panel) som viser R1881-stimulert, GFP uttrykkende celler (piler) (se MARS assay i Materialer og Metoder). (D) Kvantifisering av GFP-positive celler per brønn i forhold til kontroll, bærerbehandlede prøver i en dose-respons av TQ fra 5 til 50 uM. *
P
. 0,05
Utgivelsen av prostataspesifikt antigen (PSA; KLK3) fra LNCaP celler er anerkjent som en sensitiv indikator på androgene respons i LNCaP celler [17] . For ytterligere å undersøke TQ effekter på androgene trasé ble androgen-stimulert frigjøring av PSA fra LNCaP celler bestemt. LNCaP-celler ble behandlet med TQ viste en doseavhengig reduksjon i R1881-indusert PSA frigivelse sammenlignet med ubehandlede kontrollceller (figur 3B). I motsetning til dette, behandling med 10 til 40 uM AT ikke påvirker androgen-indusert PSA-frigjøring fra LNCaP-celler (figur 3B). Tvunget ekspresjon av androgen reseptoren i humane prostata PC3-celler for å vurdere aktivering av en androgen responsiv-grønn fluorescens reporter ble anvendt for å måle evnen til TQ til å inhibere androgen reseptoraktivering. Control, bærer-behandlede celler viste omfattende androgen reseptoraktivering etter stimulering med det syntetiske androgen R1881 (figur 3C [venstre panel] og figur 3D), mens celler behandlet med 5, 10, viser 25, eller 50 uM TQ en betydelig reduksjon i androgen reseptor aktivering av R1881 (fig 3C [panel right] og figur 3D).
nedgangen i PSA meldingen kan skyldes delvis til nedregulering av
PSA
genuttrykk produsert av TQ ( tabell 1). I tillegg til
PSA
mRNA nivåer, andre androgen-responsive gener ble målt etter TQ behandling. Som vist i tabell 1, mRNA nivåer for AR-responsive gener
kallikrein 2
,
prostein
,
prostata syre fosfatase
,
NKX3
.
1 Hotell og
prostata spesifikt membranantigen
ble redusert i LNCaP celler 4 d etter behandling med TQ. I motsetning til TQ, AT behandling ikke vesentlig endre uttrykk for androgen-sensitive mRNA (tabell 1).
nedregulering av AR proteinnivået i androgen-responsive prostatakreftceller ved TQ
for å fastslå effekten av aT og TQ på AR protein i androgen-responsive celler, ble immunoblot analyse for AR protein utført. LnCap og LAPC4 celler ble behandlet med bærerkontroll, 25 uM TQ, eller 25 uM AT i 4 d (figur 4A og 4B). For begge linjer, celler behandlet med TQ viste en betydelig reduksjon i AR-protein sammenlignet med vehikkelbehandlede kontroller, mens AT viste ingen forskjell i AR deteksjon sammenlignet med kontroller (figur 4A og 4B). For bedre å forstå dynamikken i AR nedregulering av TQ i prostatakreftceller, ble celle AR lokalisering, dose, og tiden som kreves for TQ effekter i LAPC4 og LNCaP celler bestemt. En dose-respons på 4, 12,5 eller 25 mikrometer TQ i LNCaP celler viste redusert AR protein nivåer med 25 mikrometer etter 4 d (fig 4C). I likhet med LNCaP-celler, TQ signifikant hemmet AR proteinnivåer i LAPC4 celler behandlet med 25 uM TQ for 24, 48, 72, og 96 h (figur 4D). Immunocytokjemisk farging av AR i LNCaP-celler viste signifikant nukleær lokalisering av AR (figur 4E), mens celler behandlet med 25 uM TQ for 4 d viste intakte celler med en betydelig reduksjon i nivåene av AR-protein farging (figur 4F). Samlet utgjør disse resultatene viser at TQ, men ikke AT, har potente antiandrogene effekter på androgen-responsive prostatakreftcellelinjer.
A-F. Cellular lokalisering, dose-respons, og tidsforløpet av TQ-indusert AR protein ned-regulering i AR-uttrykke prostata kreft celler. AR proteinnivåer bestemt ved immunblot i LNCaP (A) og LAPC4 (B) celler ble behandlet med 25 uM TQ eller 25 uM AT i 4 d. (C) TQ doseavhengig reduksjon i AR proteinnivåene i LNCaP-celler ble behandlet med 4, 12,5 eller 25 uM TQ for 4 d. (D) Immunoblot av tidsavhengige forandringer i AR proteinnivåer fra LAPC4 celler behandlet med 25 uM TQ for 24, 48, 72 og 96 timer. Kvantifisert AR protein nivåer presenteres under hver immunoblot (*
P
0,05). (EF) LNCaP celler ble behandlet med kjøretøy kontroll (E) eller 25 mikrometer TQ (F) for 4 d og AR protein uttrykk ble oppdaget av immunocytochemistry.
Fastsettelse av
AR
mRNA nedregulering av TQ og AT
Vi vurderes nærmere TQ nedregulering av
AR
mRNA og demonstrere denne handlingen var forskjellig fra AT.
AR
mRNA-ekspresjon etter TQ behandling for 24, 48, 72 og 96 t i LNCaP-celler ble bestemt som viser en betydelig reduksjon i
AR
mRNA ved 96 timer (figur 5A). Dermed ble uttrykket nivåer av
AR
mRNA i LAPC4 celler og flere mRNA målt etter behandling med 25 mikrometer TQ eller AT for 4 d.
AR
mRNA nivåer ble redusert 1,7 ganger etter behandling med 25 mikrometer TQ i LAPC4 celler (figur 5B). Legg merke til at reduksjoner i AR protein nivåer (fig 4D) ble observert å skje før reduksjonen observert i
AR
mRNA. Videre, selv om en betydelig reduksjon av
AR
mRNA ble sett ved 4 d på TQ behandling i både LnCap og LAPC4 celler, ved sammenligning med den relative nedregulering av
AR
mRNA ved 4 d , AR-protein er mer signifikant inhibert i matchede prøver (data ikke vist), noe som tyder på at TQ nedregulering av AR-protein ekspresjonen kan være, i det minste delvis, uavhengig av transcriptional inhibering av
AR
mRNA-ekspresjon. TQ også betydelig redusert
FOXA1
mRNA uttrykk nivåer (Fig 5C). Det er bemerkelsesverdig at AT ikke påvirke
AR
eller
FOXA1
nivåer mRNA nivåer etter 4 d (figur 5A, 5B og 5C). Men mRNA nedregulering var ikke en åpenlys handling av TQ som
retinoid X reseptor
,
alpha product: (
RXRa
) mRNA nivåer ble ikke endret ved TQ i LNCaP celler (fig 5D). Selv om AT behandling ikke påvirke mRNA nivåer av androgen-responsive gener vurdert, AT produserte en 20% reduksjon i
RXRa
mRNA nivåer (figur 5D), noe som gir ytterligere støtte for ulike effekter av AT og TQ på prostata kreftceller.
AD. Uttrykk av transkripsjonsfaktorer mRNA i TQ-behandlede LNCaP og LAPC4 celler. (A) Tid løpet analyse av AR mRNA nivåer i TQ behandlet LNCaP celler i forhold til AR mRNA nivåer i kontroll, kjøretøy behandlet LNCaP celler. (B) mRNA nivåer i LAPC4 celler behandlet for 4 d med 25 mikrometer TQ eller 25 pm til i forhold til kontroll, kjøretøy-behandlede celler. Nivåer av
Foxa
en mRNA (C) og
RXR
α mRNA (D) i LNCaP celler behandlet for 4 d med 25 mikrometer TQ eller 25 mikrometer AT sammenlignet med kontroller. *
P
. 0,05
AR protein nedregulering av TQ ble opphevet av antioksidanter
Den antioksidanter N-acetylcystein (NAC) og AT ble brukt for å bestemme om en potensiell mekanisme for TQ er nedregulering av AR-protein ekspresjon påvirkes av antioksidant behandling. LNCaP-celler ble forbehandlet med 5 mM NAC eller 25 pm AT i 24 timer og deretter behandlet med 25 pm TQ med eller uten AT (figur 6A) og NAC (figur 6B) i 48 timer. TQ-mediert nedregulering av AR-protein ble funnet å være betydelig svekket ved nærvær av antioksidanter, som støtter at TQ kan ned-regulere AR-protein gjennom veier som er følsomme overfor virkningen av disse antioksidanter.
AB . Hemming av TQ-mediert AR protein nedregulering av antioksidanter AT og NAC i LNCaP celler. (A) Immunoblot-analyse av AR-protein ekspresjon i celler forbehandlet i 24 timer med 25 uM AT og deretter behandlet med 25 uM TQ i nærvær eller fravær av 25 pM AT i ytterligere 48 timer. (B) Immunoblot-analyse av AR-proteinnivåene i celler forbehandlet i 24 timer med 5 mM NAC og deretter behandlet med 25 uM TQ i nærvær eller fravær av 5 mM NAC i 48 timer. (*
P
0,05 sammenlignet med kontroll; #
P
0,05 sammenlignet med TQ-behandlede AR protein nivåer)
Diskusjon
.
De biologiske handlinger AT har blitt grundig undersøkt. I kontrast er mye mindre kjent om AT oksidasjon produkt, TQ. Her ble den nedregulering av androgen aktivitet ved TQ undersøkt med det funn at denne aktiviteten var avhengig av TQ aktivitet som en pro-oksidant. AT ikke signifikant innvirkning på veksten av prostata kreft celler eller veier som er kjent for å være kritisk i prostata kreft progresjon i forhold til TQ. Denne studien begynner å identifisere de nye anti-androgene aktivitet av TQ og viser den differensielle aktivitet av AT og TQ i humane prostatacancerceller. TQ inhiberte signifikant androgen-responsive prostatacancer celleproliferasjon, AR-aktivitet, og AR-protein ekspresjon. TQ ble funnet å ned-regulere AR-protein-ekspresjon i både en tids- og doseavhengig måte via en mekanisme som involverer endringer i cellulær redoks. Vi har videre demonstrert at TQ nedregulering av AR-protein ble dempet ved antioksidanter NAC og AT. Evnen til disse forskjellige antioksidanter for å oppheve handlingene til TQ på AR protein i prostatakreftceller er fokus for fremtidige studier. Alt i alt, en ny virkning for TQ ble funnet i nedregulering av androgen aktivitet i humane prostatacancerceller.
I denne studien var ingen vekst av prostata kreftceller eller de veier som er kjent for å være kritisk i prostata cancer progresjon som ble sammenlignet ble påvirket av aT, mens TQ potent hemmet veksten av androgen-sensitive prostatakreftceller. Nedgangen i cellevekst som produseres av TQ behandling kan være AR avhengig som TQ behandling ikke hadde en uttalt effekt på veksten av androgen-uavhengig DU145 human prostatacancer cellelinje. Viktigere, TQ, men ikke AT, ble funnet å redusere både
AR
mRNA og AR proteinnivået i prostata kreft celler med en samtidig reduksjon i androgene veier. Flere studier har vist at nedregulering av AR resulterer i redusert celleformering i androgen-sensitive prostatacancerceller. For eksempel, redusert AR-ekspresjon ble oppnådd i LNCaP humane prostatakreftceller ved hjelp av siRNA som resulterer i en reduksjon i LNCaP vekst [18,19]. Således kan reduksjon i cellevekst som produseres av TQ i androgen-sensitive prostatacancer cellelinjer skyldes i det minste delvis av virkningen av TQ for å ned-regulere ekspresjonen AR.
AR er en vev-spesifikk ligand-aktiverte transkripsjonsfaktor som er kjent for å regulere uttrykket av gener som
trans 4 L seks familiemedlem en
,
PSA
,
kallikrein 2
,
prostein
,
prostata syre fosfatase
,
NKX3
.
en
, og
prostata spesifikt membranantigen
i prostata celler [20-24 ]. Fordi AR spiller en sentral rolle i opprettholdelsen av uttrykket av disse genene, ville deres uttrykk reduseres ved tiltak som ned-regulerer AR. Faktisk var ekspresjonen av flere av disse genene redusert etter behandling av LNCaP-celler med TQ. I tillegg uttrykk fra en androgen-sensitive reporter ble hemmet ved samtidig androgen og TQ behandling. I motsetning til dette, AT hadde minimal effekt på moduleringen av androgen-responsive gener eller genprodukter. Den reduserte uttrykk for AR-responsive gener indusert av TQ behandling sterk støtte til at AR er et viktig mål på TQ i prostatakreftceller.
AR er anerkjent som en viktig bidragsyter til alle stadier av prostatakreft fra carcinogenesen til kastrering-resistent sykdom [7,12,25,26]. Til dags dato er de fleste inngrep mot prostatakreft redusere AR-aktivering via inhibering av produksjon av androgene ligander, slik som testosteron eller dihydrotestosteron. Disse strategiene påvirker ikke AR selv. Å modulere AR-aktivitet, er det nødvendig å identifisere tiltak som er rettet mot nedregulering av ekspresjon AR. Her viser vi at nedregulering av AR-protein og mRNA kan oppnås ved hjelp TQ med en markert innvirkning på androgen aktivitet i prostatakreftceller. Det er bemerkelsesverdig at AT ikke inhiberer enten AR ekspresjon eller aktivitet i prostatakreftceller. Dette er viktig, da dette er den formen av AT som er forventet å være fysiologisk aktive i motsetning til ester konjugerte former, for eksempel vitamin E succinat, som er tilsynelatende omdannes til a-tokoferol ved hjelp av virkningen av esteraser i celler og i kroppen.
Selv om AT ikke viser anti-androgene egenskaper innenfor vårt system, har vitamin E (VE) analoger blitt rapportert å påvirke AR protein uttrykk i prostatakreftceller. For eksempel, Zhang et al. [16] rapporterte at VE analog, VE succinate, reduserer AR aktivitet i androgen-sensitive menneskelige prostata kreft celler. I likhet med TQ, VE succinate behandling ble funnet å redusere både AR mRNA og proteinnivåer i LNCaP celler [16]. Av betydning, Zhang et al. [16] fant at i det minste en del av VE-succinat handling er på grunn av en reduksjon i AR oversettelse. Vårt laboratorium har tidligere rapportert om anti-androgen aktivitet av en annen VE analog, 2,2,5,7,8-pentametyl-6-chromonol (PMCol) [14]. Det antioxidant del med AT, PMCol, består av chromonal ringstrukturen av AT, men mangler fytyl-kjeden. Vi viste at PMCol hemmet spredning av androgen-sensitive prostatakreftceller som virker som en kompetitiv hemmer av AR ligand binding og at PMCol hemmer AR aktivering [14]. Men PMCol hemmet ikke AR uttrykk. Derfor begrensningene VE analoger kan innbefatte mangel på metabolsk omdannelse til AT og følgelig TQ, eller mangel på AR-protein nedregulering.
Identifisere mekanismen for TQ anti-androgen aktivitet og selektiv hemming av AR protein uttrykk kan gi innsikt i nye AR reguleringsmekanismer. Fordi TQ hadde uttalt hemmende effekt på markører for AR aktivitet, ble AR i androgen-sensitive prostatakreftcellelinjer undersøkt. Både AR-protein og mRNA ble funnet å bli redusert ved TQ behandling i både LAPC4 og LNCaP human prostatacancerceller. Det var imidlertid betydelig reduksjon av AR-protein ekspresjon som gikk forut for inhibering av AR mRNA-ekspresjon, noe som viser at TQ handlinger for AR nedregulering ikke kan være helt på grunn av hemming av AR mRNA-ekspresjon. Interessant,
FOXA1
mRNA ble også redusert med TQ behandling. FOXA1 er anerkjent som en potent bidragsyter til androgene aktivitet for prostata gener [27]. Imidlertid, nedregulering av mRNA-ekspresjon var ikke en utilslørt virkning av TQ aktivitet. For eksempel
RXRa
mRNA uttrykk ikke ble funnet å være påvirket av TQ behandling.
Handlingene til AT som et tiltak for å lindre prostatakreft er kontroversielle. På grunn av avvik mellom epidemiologiske studier om AT aktivitet for prostatakreft, bør alternative forklaringer på resultatene av disse studiene bli utforsket. For eksempel røyking var en stor uoverensstemmelse mellom deltakerne i Alpha-Tocopherol, betakaroten Cancer Prevention (ATBC) prøve [28], som inkluderte tunge røykere, og selen og vitamin E Cancer Prevention Trial (VELG) [29] , som har registrert seg for det meste ikke-røykere. Dette er spennende når de vurderer prostata kreft forebyggende tiltak av supplerende AT da tatt av menn som røyker sett mellom disse to studiene. For eksempel, i den ATBC undersøkelsen, ble en 32% reduksjon i forekomsten av prostatakreft og 41% reduksjon i dødelighet observert blant røykere tar tilskudd AT sammenlignet med kontrollgruppene [30]. I Professionals studie Harvard Health, ble ingen effekt av supplerende AT alene funnet på forekomsten av prostatakreft; men det ble rapportert at, «blant nåværende røykere og siste røykesluttere, de som spiste minst 100 IE supplerende AT per dag hadde en relativ risiko på 0,44 for metastatisk eller dødelig prostatakreft» [31]. Andre studier har funnet noen effekt av supplerende AT når det tas alene, men gjorde rapportere en reduksjon i utviklingen av prostatakreft blant røykere tar VE kosttilskudd [28,32,33]. I motsetning til disse rapportene, har en fersk studie fant at AT seg selv kan ha aktivitet mot utvikling av avansert prostatakreft [34]. Disse finne konflikt med resultatene fra SELECT, som ikke klarte å finne prostata kreft forebyggende tiltak av supplerende AT [29,35]. Dermed flere studier så langt tyder på at AT seg selv kan ikke være et effektivt tiltak mot prostatakreft. Støttende av disse funnene, fikk resultatene fra denne studien ikke finner signifikant effekt på prostatakreftceller fra AT. Vi har imidlertid funnet at TQ, hovedoksidasjonsproduktet av AT, er meget effektivt for å redusere både vekst og androgen aktivitet i prostatacancercellelinjer. Det er interessant å tenke på at TQ kan være den aktive derivat av AT involvert i forebygging av prostatakreft blant storrøykere tar tilskudd VE, som i besittelse av en fysiologisk oksidativt stress kan effektivt forvandle AT til TQ. Resultatene fra denne studien støtter sterkt videre undersøkelser for å fastslå effekten av TQ som en modalitet for forebygging prostatakreft.
Den forhøyede påvisning av TQ nivåer ved AT tilskudd og økt oksidativt stress har blitt vist i dyremodeller. For eksempel, Wurzel, H et al. [36] gjennomførte en
in vivo
studie som utsettes rotter til kronisk sigarettrøyk og AT i 65 uker. I den eksperimentelle gruppen, fant de høye nivåer av TQ i den bronkoalveolare vaskevæske som demonstrerer at røyk-eksponerte dyr som genereres en større mengde av oksydative produkter [36]. Påvisning av TQ hos mennesker er rapportert i en sammenlignende studie av voksne lunge pasienter rutinemessig mottar oksygen terapi [37]. Konverteringen av AT i TQ etter oksidativt fornærmelse kan være en potensiell forklaring på avviket observert mellom forebyggelsesstudier som tidligere nevnt.
Rapporter om de biologiske effektene av TQ er begrenset. Dette kan skyldes delvis til TQ blir sett på bare som et produkt av AT oksidasjon med begrenset iboende biologisk aktivitet. Imidlertid er TQ kjemisk forskjellig fra AT og kan derfor ha unike biologiske virkninger sammenlignet med AT. De forskjellige biologiske virkninger av TQ og AT er sterkt støttet av resultatene på selektiv AR nedregulering av TQ observert i denne studien. En fysiologisk handling forbundet med TQ er antikoagulerende aktivitet [38]. Dette er ikke overraskende i at kinon og fytyl-kjedestruktur av TQ er minner om den for vitamin K, vitamin et kritisk involvert i blodlevring. Generelt er kjemikalier i besittelse av kinon strukturer funnet å være toksisk. Dette er hovedsakelig på grunn av tilstedeværelsen av elektrofile karbon sentre som er tilstede i kinonstruktur som kan bli påvirket av nukleofiler er tilstede i cellebestanddeler [3]. I denne studien ble TQ ikke funnet å være svært cytotoksiske. Interessant er alle elektrofile områder i TQ blokkert av metyl-substitusjoner og således TQ ville være forventet å være mindre reaktive enn kjemikalier med ublokkerte kinon strukturer. I tillegg TQ er blitt funnet å være en potent substrat for biotransformasjon enzymet NQO1 [39]. Reduksjonen av TQ til hydrokinon ved NQO1 ble funnet å være så effektivt det ble foreslått at TQ kan være en av de primære substrat for NQO1 biologiske aktivitet [39]. Resultater fra denne studien og andre støtter sterkt at TQ har potente biologiske handlinger som er forskjellig fra AT. Viktigere er TQ er nedregule AR protein uttrykk i menneskelige prostata kreft celler mediert av endringer i mobilnettet oksidativt stress som kan avskaffet av antioksidanter.
Materialer og metoder
Kjemi, cellekultur, og
