Abstract
Bakgrunn
Casticin er en av de viktigste aktive komponentene er hentet fra
FRUCTUS Viticis
og har blitt rapportert å utøve anti-kreftfremkallende aktivitet på en rekke kreftceller, men den nøyaktige mekanismen bak denne aktiviteten er fortsatt uklart.
Materialer og metoder
apoptotiske aktiviteter casticin (1,0 mikromol /l) og TRAIL (25, 50 ng /ml) alene eller i kombinasjon i magecancercellelinjer BGC-823, SGC-7901 og MGC-803 ble detektert ved bruk av en celle apoptose ELISA deteksjon kit, flowcytometri ( FCM) med propidiumjodid (PI) flekker og aktiviteter caspase-3, -8 og -9 ved ELISA og spalting av polyADP-ribose polymerase (PARP) protein ved hjelp av western blot analyse. Død reseptorer (DR) uttrykk nivåer ble evaluert ved hjelp av FCM analyse og western blotting. 2 «, ble 7»-dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA) anvendt som en probe for å måle økningen av reaktive oksygenarter (ROS) nivåer i celler. Flere tiltak, slik som siRNA transfeksjon og farmakologiske hemmere ble brukt til å utforske mekanismene for disse handlingene.
Resultater
Subtoxic konsentrasjoner av casticin betydelig potensierte TRAIL-indusert cytotoksisitet og apoptose i BGC-823, SGC-7901 og MGC-803 celler. Casticin dramatisk oppregulert DR5 reseptor uttrykk, men hadde ingen effekt på DR4 eller lokkefugl reseptorer. Sletting av DR5 av siRNA betydelig redusert apoptose indusert av co-anvendelse av TRAIL og casticin. Gene stanse av den CCAAT /Enhancer bindende protein homolog protein (CHOP) og forbehandling med salubrinal, en endoplasmatiske retikulum (ER) stresset inhibitor, svekket casticin-indusert DR5 reseptor uttrykk, og apoptose og ROS produksjon. Casticin downregulated uttrykket nivåer av celleoverlevelsesproteiner cFLIP, BCL-2, XIAP, og Survivin. I tillegg casticin også indusert uttrykk for DR5 protein i andre mage kreftceller (SGC-7901 og MGC-803).
Konklusjon /Betydning
Casticin forbedrer TRAIL-indusert apoptose gjennom downregulation celle overlevelse proteiner og oppregulering av DR5 reseptorer gjennom handlinger på ROS-ER stress-CHOP veien
Citation. Zhou Y, Tian L, Long L, Quan M, Liu F, Cao J (2013) Casticin forsterker TRAIL apoptose av magekreft celler gjennom endoplasmatiske retikulum stress. PLoS ONE 8 (3): e58855. doi: 10,1371 /journal.pone.0058855
Redaktør: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 11 juni 2012; Godkjent: 08.02.2013; Publisert: 11 mars 2013
Copyright: © 2013 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av prosjekt av NSFC (nummer 30760248), prosjektleder for vitenskapelig forskning i Hunan-provinsen administrasjonen Bureau of tradisjonell kinesisk medisin (nummer 2010081), Project of Scientific Research i Hunan-provinsen, Department of Education (antall 10C0975), major prosjekt Sak of Scientific Research i Hunan-provinsen Department of Education (antall 09A054) og prosjektet for vitenskapelig forskning i Changsha City Bureau of Science and Technology (antall K1104060-31). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
FRUCTUS Viticis
(
Manjingzi
er det kinesiske navnet) nemlig frukten av
Vitex trifolia L. plakater (familie
Verbenaceae
) som er en tradisjonell kinesisk medisin brukt som et anti-inflammatorisk middel. Casticin er en av de aktive komponenter som stammer fra
FRUCTUS Viticis product: [1]. Mange studier har vist at casticin utøver anti-kreftfremkallende aktivitet i bryst [2], cervical [3], prostata [4], lunge og tykktarmskreft [5], [6], så vel som i magekreft [7]
in vitro
. Det har også blitt rapportert at casticin hemmer veksten av humane myelogene leukemiceller [8] og induserer død av leukemiceller ved induksjon av enten apoptose eller en mitotisk katastrofe [9].
Nylig har tidligere arbeid fra vårt laboratorium indikerte at effekten av casticin på apoptose av humane hepatocellulære karsinomceller er involvert i reaksjonsveien DR5 uavhengig av statusen til p53 [10]. Det har blitt dokumentert at CCAAT /Enhancer bindende protein homolog protein (CHOP), også kjent som vekst arrest og DNA-skader gen 153 (GADD153), regulerer direkte DR5 uttrykk gjennom en CHOP bindingssete i 5-flankerende område av DR5 genet [11], [12]. Vi, og andre, har rapportert at enkelte stoffer, slik som 5, 7-dimethoxyflavone og dimetyl-celecoxib, indusere DR5 uttrykk gjennom CHOP-avhengig trans av DR5 genet [13] – [15]. Videre har flere studier vist en nær sammenheng mellom endoplasmatiske retikulum (ER) stress og DR5 uttrykk. ER stress induseres når utfoldet proteiner akkumuleres i ER lumen [16]. Det virker som dette svaret kan aktivere bestemte apoptotiske veier å eliminere alvorlig skadede celler, der proteinfolding feil ikke kan løses [17], [18]. Ulike ER stress indusere som MG132 [12], tunicamycin [19] og thapsigargin [20], har konsekvent vist seg å indusere DR5 uttrykk på celleoverflaten. Selv om de molekylære mekanismene for DR5 protein uttrykk ved ER stress-indusere kan variere med stimuli og celletyper, det ER stress-induserbare transkripsjonsfaktor, hogge, har gitt en sammenheng mellom ER stress og DR5. Men induserer om casticin DR5 uttrykk i mage kreftceller og hvis så, er ukjent art av den molekylære mekanismen involvert.
En fersk studie har vist at effektiv tumornekrosefaktor-α-relatert apoptose-induserende ligand ( TRAIL) -basert kombinasjonsbehandling kan oppnås ved oppregulering DR4 og DR5 uttrykk, og direkte rettet mot tumorcelle mitokondrier for å stimulere apoptose-induserende egenskaper [21]. Evnen til mitokondrier å mediere apoptose er strengt regulert av medlemmer av Bcl-2-superfamilien [22]. Undertrykkende anti-apoptotiske proteinekspresjon, med antisens RNA eller siRNA, har vist seg å sensibilisere kreftceller for å TRAIL [23]. Som et resultat av midler som nedregulere slike anti-apoptotiske proteiner som Survivin, cellulær FADD-lignende interleukin-1β-konverterende enzym-inhiberende protein (cFLIP), Bcl-2, og X-bundet hemmer av apoptose protein (XIAP) kan potensielt sensibilisere kreft celler til apoptotiske virkninger av TRAIL [23], [24].
i denne studien, derfor har vi fokusert på å undersøke om casticin forsterker TRAIL-indusert kreft celle apoptose, og i så fall hvordan casticin forsterker dette effekt. Vi fant ut at casticin forsterkes TRAIL-indusert apoptose ved oppregulering DR5 gjennom ROS-ER stress-CHOP sti og ved downregulating uttrykk for celleoverlevelsesproteiner BCL-2, XIAP, cFLIP, og Survivin i mage kreftceller.
Resultatene
Subtoxic konsentrasjoner av casticin selektivt forsterker TRAIL-indusert cytotoksisitet i magekreftceller
Den cytotoksisitet av casticin og TRAIL, alene eller i kombinasjon, ble undersøkt i menneskelige magekreft linjer BGC- 823, SGC-7901 og MGC-803, som bestemmes av MTT analysen. Casticin og TRAIL alene forårsaket cytotoksisitet av magekreftceller, på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 1A og B). Svakt cytotoksisitet ( 20%) ble observert ved en lavere konsentrasjon av casticin (1,0 umol /l, figur 1A). Behandling av mage kreft celler med 25-50 ng /ml TRAIL i 24 timer indusert begrenset cytotoksisitet ( 20%). Men samtidig behandling av mage-kreftceller med casticin (1,0 umol /l) og TRAIL (25 ng /ml eller 50 ng /ml) markert øket den cytotoksiske effekten sammenlignet med behandling med casticin eller TRAIL alene (figur 1C).
Effekter av casticin (A) og TRAIL (B) alene, eller en kombinasjonsbehandling av casticin og TRAIL (C) på cytotoksisitet av BGC-823, SGC-7901, og MGC-803 celler (gjennomsnitt ± SD,
n
= 3).
*
P 0,05
vs. behandling med DMSO;
#
P 0,05
vs. behandling med en mikromol /l casticin eller 25 ng /ml TRAIL eller behandling med TRAIL ved samme konsentrasjon alene. Effekter av casticin og TRAIL alene, eller en kombinasjonsbehandling av casticin og TRAIL på cytotoksisitet av GES-1 celler (D).
Fordi vi fant ut at den kombinerte behandlingen med casticin og TRAIL sterkt indusert cytotoksisitet i magekreftceller, vi neste undersøkt effekten av behandlingen på udødeliggjort human gastrisk mukosa epitelcellelinje GES-1. Interessant, gjorde kombinasjonen av casticin og TRAIL ikke indusere cytotoksisitet i GES-1 celler (figur 1D) .Disse Resultatene indikerer at subtoxic konsentrasjoner av casticin selektivt sensibilisert menneskelige magekreftceller i Trail-indusert cytotoksisitet.
Subtoxic konsentrasjoner av casticin bevisst mage kreftceller til TRAIL-indusert apoptose
for å undersøke om apoptose er involvert i celleveksthemming ved samtidig behandling med casticin og TRAIL, vi først undersøkt apoptose ved hjelp av flowcytometrisk analyse for å avdekke økninger i hypodiploid celle populasjoner. Resultatene viste at frekvensen av apoptose var 3,78 ± 1,3%, 4,69 ± 1,7% og 37,1 ± 4,9% (gjennomsnitt ± SD,
n
= 3) for casticin (1 mikromol /l), TRAIL (50 ng /ml) og casticin pluss TRAIL, henholdsvis (figur 2A). Under G1 befolkningen i BGC-823 celler ble betydelig økt på 12 timer, og toppet seg 24 timer etter forbehandling med en mikromol /l casticin etterfulgt av 50 ng /ml TRAIL (figur 2B). Vi neste fastslått histone /DNA-fragment nivåer av mage kreft cellelinjer BGC-823, SGC-7901 og MGC-803 ved hjelp av celle apoptose ELISA deteksjon kit. Figur 2C illustrerer at kombinert behandling av casticin og TRAIL synergi indusert histone /DNA-fragmentering. Histon /DNA fragment nivåer av BGC-823 ble hevet etter 12 timer og nådde en topp 24 h ved samtidig behandling med casticin (1 mikromol /l) og TRAIL (50 ng /ml, figur 2D).
Casticin forbedret TRAIL-fremkalt celledød ved apoptose målt ved bruk av strømningscytometrisk analyse (A og B), celle apoptose ELISA deteksjon kit (C og D) i BGC-823, SGC-7901, og MGC-803-celler (gjennomsnitt ± SD, n = 3 ).
*
P 0,05
vs. behandling med DMSO eller 0 h;
#
P 0,05
vs. behandling med en mikromol /l casticin eller TRAIL i samme konsentrasjon alene i 6 timer. De enzymatiske aktiviteter av caspase-3 (E), -8 (F), og -9 (G) ble bestemt ved inkubering av 20 mikrogram av totalt protein med 200 pM kromogent substrat (Ac-DEVD-
p
NA eller Ac-IETD-
p hoteller, NA eller Ac-LEHD-
p hoteller, NA) i 100 ul analysebuffer i 2 timer ved 37 ° C. Utgivelsen av chromophore
p
-nitroanilide (
p hoteller, NA) ble overvåket av et spektrofotometer (405 nm). Dataene som vises er gjennomsnitt ± S.D (n = 3). *
p
0,01 vs. 0,1% DMSO; #
p
0,05 vs. behandling med casticin og TRAIL alene. Spalting av PARP ble undersøkt av western blotting-analyse i BGC-823 og SGC-7901 celler (H).
Vi neste undersøkt om caspases faktisk ble aktivert under induksjon av apoptotisk celledød ved den kombinerte behandlingen med casticin og TRAIL i mage kreftceller. Behandling av gastic kreftceller med en mikromol /L casticin alene for 24 timer fremkalte ikke noen aktivitet av caspase-3, -8 og -9. Som svar på TRAIL (50 ng /ml), aktiviteter av caspase-3, -8 og -9 ble ikke endret. Men den kombinerte behandling av casticin og TRAIL-indusert aktivering av kaspase-3 og -8 og lett aktiv caspase-9 (figur 2 E, F og G).
Vi har også undersøkt som caspase ble spesielt aktivert i respons på casticin og TRAIL behandling ved hjelp av caspase hemmere, inkludert den pan-caspase inhibitor zVAD-FMK, caspase-3 hemmer zDEVD-FMK, caspase-8 inhibitor zIETD-FMK og caspase-9-hemmer zLEHD-FMK. Som vist i figur 2E, zVAD-FMK, zDEVD-FMK og zIETD-FMK betydelig redusert nivå av aktivitet av kaspase-3 indusert ved den kombinerte behandling av casticin og TRAIL, men zLEHD-FMK hadde en svak effekt. zVAD-FMK og zIETD-FMK kan samtidig fullstendig blokkere caspase-8 aktivisering, og zDEVD-FMK delvis blokkert aktivering av caspase-8; imidlertid zLEHD-FMK hadde liten innvirkning av aktiveringstilstanden av caspase-8 (figur 2F). Tilsvarende fant vi at caspase-9 ble litt aktivert i celler behandlet med casticin og TRAIL, men ikke i celler behandlet med casticin og TRAIL i nærvær av z-IETD-FMK, zVAD-FMK og zLEHD-FMK (figur 2G). Sammen er disse resultatene tyder på at casticin med tillegg av TRAIL induserer caspase-8 aktivering oppstrøms caspase-9 aktivisering [10].
Vi endelig undersøkt om casticin kunne forbedre TRAIL-indusert PARP cleavage og funnet ut at casticin forbedret TRAIL-indusert økning i PARP spalting i BGC-823 og SGC-7901 celler (figur 2 H). Disse resultatene indikerer sterkt at en subtoxic konsentrasjon av casticin forbedrer TRAIL-indusert apoptose av magekreftceller.
Casticin induserer uttrykk for DR5 i magekreftceller
apoptose av leverkreft celler indusert av casticin var involvert i DR5 oppregulering [10]. Derfor, behandlet vi BGC-823-celler med casticin i 24 timer og deretter anvendt western blot-analyse for å undersøke celler for TRAIL-reseptor-ekspresjon. Casticin øket DR5-ekspresjon i en konsentrasjonsavhengig måte, men hadde ingen virkning på ekspresjon DR4 eller DcR1 eller DcR2 induksjon (figur 3A). Induksjon av DR5 uttrykk ved casticin skjedde på 6 timer og nådde en topp på 24 timer (Figur 3B). Disse funnene tyder på at DR5 oppregulering er kandidat mekanisme som casticin forbedrer apoptotiske virkninger av TRAIL i BGC-823 celler.
Effekter av casticin på nivået av TRAIL reseptor uttrykk bestemmes ved hjelp av western blot (A og B) og celle overfladiske-DR ved flowcytometrisk analyse (C og D) i BGC-823-celler. Effekter av casticin på nivåene av DR5 protein nivåer i SGC-7901, MGC-803 og GES-1 celler ved hjelp av western blot analyse (E).
For å finne ut om DR på celleoverflaten var som er involvert i induksjon av apoptose ved casticin, ble den celleoverflate-ekspresjon av DR5 og DR4 observert ved hjelp av flow cytometri. Etter at cellen utsettes for casticin (1,0 umol /l), ble graden av DR5 på celleoverflaten øket (figur 3C). Imidlertid casticin påvirket ikke nivået av DR4 uttrykket (figur 3D). Samlet indikerer disse resultater at casticin oppregulerer ekspresjonen av DR5 på celleoverflaten.
Enten oppregulering av DR5 ved casticin er spesifikk for BGC-823-celler eller også forekommer i andre gastrisk cancer cellelinjer, ble også undersøkt. Casticin indusert DR5 uttrykk i magekreft SGC-7901 og MGC-803 cellelinjer, men ikke har åpenbare effekter på sitt uttrykk i immortalization mageslimhinnen GES-en cellelinje (Figur 3E). Sammen disse funnene tyder på at oppregulering av DR5 av casticin er ikke spesifikke for en bestemt type magekreftcelle.
DR5 induksjon casticin er nødvendig for forbedring av TRAIL-indusert apoptose i BGC-823 celler
for å finne ut hvilken rolle DR5 reseptorer i forbedring av TRAIL-indusert apoptose av casticin, brukte vi siRNA spesifikke for DR5 å nedregulere sitt uttrykk. Transfeksjon av celler med siRNA for DR5 men ikke med kontroll siRNA redusert casticin-indusert DR5 uttrykk.
For å undersøke om DR5 oppregulering innebærer casticin forbedret TRAIL gastrisk celle apoptose, flowcytometrisk analyse ble brukt for å undersøke om undertrykkelse av DR5 uttrykk av siRNA kunne dempe effekten av casticin på TRAIL-indusert apoptose. Figur 4B viser at effekten av casticin på TRAIL-fremkalt apoptose ble effektivt redusert i celler transfektert med DR5 siRNA, mens celler transfektert med kontroll-siRNA var upåvirket. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at induksjon av DR5 er kritisk for sensibilisering av tumorceller til effektene av casticin i TRAIL-indusert apoptose.
Handling av siRNA for DR5, om virkningene av casticin-indusert DR5 uttrykk nivåer (A) ved hjelp av western blot-analyse og TRAIL-mediert apoptose (B).
*
P 0,05
vs. behandling med DMSO;
#
P . 0,05
vs. behandling med en mikromol /l casticin pluss 50 ng /ml TRAIL i kontroll- og scRNA transfektert celler
Casticin-indusert DR5 oppregulering er mediert gjennom induksjon av CHOP i BGC-823 celler
CHOP-mediert oppregulering av DR5 har blitt vist [11] – [15]; Derfor neste undersøkte vi hvordan denne transkripsjonsfaktor kan være involvert i casticin-indusert DR5 oppregulering. Figur 5A viser at casticin indusert CHOP uttrykk, som skjedde parallelt med økningen i DR5 uttrykk.
Effekter av siRNA for CHOP på handlingen av casticin-indusert DR5 og hogge uttrykk (A og B) ved hjelp av western blot analyse og TRAIL-mediert apoptose (C) i BGC-823 celler (gjennomsnitt ± SD,
n
= 3).
*
P 0,05
vs. behandling med DMSO;
#
P . 0,05
vs. behandling med en mikromol /l casticin pluss 50 ng /ml TRAIL i kontroll- og scRNA transfektert celler
For å teste hvilken rolle CHOP i casticin-indusert oppregulering av DR, ble genet Slå av CHOP av siRNA brukt. Transfeksjon med CHOP siRNA undertrykte betydelig casticin-indusert DR5 oppregulering (figur 5B), mens casticin oppregulert uttrykk for DR5 i ikke-transfektert og kontroll-transfektert (kryptert RNA) celle.
neste brukte flowcytometrisk analyse for å undersøke om undertrykkelse av CHOP av siRNA dempes de sensibiliserende effekter av casticin på TRAIL-indusert apoptose. Transfeksjon med CHOP siRNA betydelig redusert effekten (fra 37,1 ± 5,3% til 13,5 ± 1,3%, gjennomsnitt ± SD,
n
= 3) på casticin pluss TRAIL-indusert apoptose (figur 5C), mens behandling med kontroll siRNA ikke hadde noen effekt (figur 5C). Disse resultatene indikerer at CHOP er involvert i DR5 oppregulering og bidrar til sensibiliserende virkning av casticin på TRAIL-indusert apoptose i vår eksperimentell modell.
Casticin indusert endoplasmatiske retikulum (ER) stress i magekreftceller
det er kjent at eR eR stress induserer markørproteiner (slik som GRP78 og fosfo-eIF2α), som oppregulerer ekspresjonen av CHOP [12], [19], [20]. I denne studien ble effekten av casticin på uttrykk for ER stress markørproteiner undersøkt. Våre resultater viser at casticin gjorde faktisk fremkalle alle disse markører for ER stress i BGC-823 celler (Figur 6A). For å avgjøre om ER stress er involvert i potensering av casticin på apoptose indusert av TRAIL, salubrinal, en hemmer av ER stress, ble brukt. Salubrinal (50 mikromol /l) betydelig beskyttet BGC-823 celler fra apoptose indusert av co-anvendelse av casticin og TRAIL (figur 6B).
Effekter av casticin på uttrykket nivåer av ER stress forbundet proteiner (A ) ved hjelp av western blot-analyse og TRAIL-mediert apoptose (B) i BGC-823-celler (gjennomsnitt ± SD,
n
= 3).
*
P 0,05
vs. behandling med DMSO;
#
P 0,05
vs. behandling med. 1 mikromol /l casticin pluss 50 ng /ml TRAIL i celler forbehandlet med 50 mikromol /l salubrinal. Effekter av tunicamycin på uttrykket nivåer av ER stress forbundet proteiner (C) ved hjelp av western blot analyse og TRAIL-mediert apoptose (D) i BGC-823 celler (gjennomsnitt ± SD,
n
= 3).
*
P 0,05
vs. behandling med DMSO;
#
P . 0,05
vs. behandling med
Vi har også testet om behandling av BGC-823 celler med det endoplasmatiske retikulum (ER) stresset indus, tunicamycin [25 ], kan heve DR5 protein nivåer og forbedre TRAIL-indusert apoptotisk celledød. Vi fant ut at tunicamycin (3,0 mikromol /l) tidsavhengig økt proteinnivå DR5, p-eIF2α, GRP78 og CHOP, i BGC-823 celler (figur 6C). Cotreatment med tunicamycin (3,0 umol /l) og TRAIL (50 ng /ml) økte signifikant prosentandelen av celler i sub-G1 fase, sammenlignet med tunicamycin eller TRAIL alene (figur 6D). Disse resultatene støtter hypotesen om at ER stress deltar i forsterkende virkningen av casticin på apoptose indusert av TRAIL.
Casticin-indusert DR5 oppregulering og apoptose potense er ROS-avhengige i BGC-823 celler
Vi har nylig vist at 5, 7-dimethoxyflavone selektivt forsterker TRAIL-indusert apoptose av ROS stimulert ER-stress utløser CHOP-mediert DR5 oppregulering i leverkreft celler [15]. Vi undersøkte derfor om casticin induserer ROS produksjon. 2 «7»-dichlorofluorescein diacetate (DFCH-DA) ble brukt som en sonde for å måle en hvilken som helst økning i ROS-nivåer i celler. Tidsforløpet eksperimenter viste at nivåene av ROS ble øket innledningsvis ved
1 time, nådde en topp på 3 timer og vedvarte i opptil 24 timer etter behandling med 1,0 umol /l casticin (figur 7A). Casticin indusert ROS produksjon i en konsentrasjonsavhengig måte (figur 7B).
Effekter av casticin på ROS generasjon (A og B) og effekter av NAC på casticin-indusert DR5 og CHOP oppregulering (C) ved hjelp av vestlig blot analyse og TRAIL-mediert apoptose (D) i BGC-823 celler (gjennomsnitt ± SD,
n
= 3).
*
P 0,05
vs. behandling med DMSO;
#
P . 0,05
vs. behandling med en mikromol /l casticin pluss 50 ng /ml TRAIL i celler forbehandlet med NAC
For å dechiffrere forholdet mellom ROS generasjon og CHOP-avhengige DR5 induksjon, undersøkte vi om ROS regulerer casticin-indusert TRAIL reseptorer og hogge i nærvær og fravær av
N
acetylcysteine (NAC), som er en gatefeier av oksygen frie radikaler. Vi fant at forbehandling av celler med NAC redusert casticin-indusert oppregulering av DR5 og hogge uttrykk (figur 7C).
Deretter undersøkte vi om ROS spiller en rolle i casticin-indusert TRAIL potensering. Som vist i figur 7D, casticin betydelig forbedret TRAIL-fremkalt apoptose in BGC-823-celler, og forbehandling av celler med NAC markert redusert casticin-indusert apoptotisk celledød forbedring fra 52,4 ± 3,3% til 8,2 ± 0,8% (gjennomsnitt ± SD, n = 3) tyder på at ROS spiller en avgjørende rolle som formidler effekten av casticin i TRAIL-indusert apoptose.
casticin nedregulerer uttrykket av ulike celleoverlevelsesproteiner i BGC-823 celler
det er blitt rapportert at en rekke anti-apoptotiske proteiner, slik som survivin, cFLIP, XIAP, Bcl-2 og Bcl-xL kan regulere TRAIL-fremkalt apoptose [25], [26]. I denne studien undersøkte vi om enkelte identifiserte celleoverlevelsesproteiner var involvert i forsterkende virkningen av casticin på apoptose indusert av TRAIL. BGC-823-celler ble utsatt for forskjellige konsentrasjoner av casticin i 24 timer og deretter undersøkt for Bcl-xL, Bcl-2, Survivin, XIAP, cFLIP, CIAP-1 (celle inhibitor av apoptose protein 1) og TRAF1 (TNF-reseptor-assosiert faktor 1) uttrykk. Casticin hemmet BCL-XL, Bcl-2, Survivin, cFLIP og XIAP uttrykk (figur 8A). Effektene av casticin på uttrykket av BCL-XL, Bcl-2, Survivin, XIAP og cFLIP var dramatisk, mens nedregulering av CIAP-en ikke var veldig uttalt. Disse resultater antyder at nedregulering av celleoverlevelse proteiner er en av de mekanismer som driver den potensierende effekten av casticin på apoptose fremkalt av TRAIL.
BGC-823-celler ble behandlet med casticin ved de angitte konsentrasjoner i 24 timer. Western blot-analyse ble brukt for å bestemme uttrykket nivåer av anti-apoptose-proteiner (cFLIP, Bcl-2, XIAP, CIAP-1 og Survivin) og pro-apoptose-proteiner (Bax og bud). β-actin ble brukt som lasting kontroll.
Vi neste undersøkt om casticin kunne modulere uttrykk for pro-apoptotiske proteiner. Vi fant at casticin dramatisk oppregulert ekspresjonen av Bax på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 8B). Casticin også øket spaltning av bud på en konsentrasjonsavhengig måte, som vist ved reduksjon av ekspresjonen av Bud-protein (figur 8B). Disse funnene tyder på at casticin samtidig kan aktivere den iboende mitokondriene-mediert sti og den ytre DR-indusert vei som gjenspeiles av den avkortede pro-apoptotiske proteiner Bud.
Diskusjoner
I denne henvendelsen, vi undersøkt muligheten for casticin, en polymethoxyflavone avledet fra
Fructus Viticis
, å modulere TRAIL signalisering i magekreftceller, og våre funn tyder på at casticin forsterker TRAIL-indusert apoptose i magekreft BGC-823, SGC-7901 og MGC-803 celler ved (1) å indusere DR5 uttrykk og (2) downregulatin celleoverlevelses proteiner knyttet til tumorcelle motstand mot TRAIL. Casticin oppregulering av DR5 synes å være mediert gjennom aktivering av ROS-ER stress-CHOP pathway (figur 9).
Casticin innledningsvis fremmer ROS generasjon og utløser ER stress induserer deretter DR5 oppregulering gjennom aktivering av CHOP hvilken deretter øker TRAIL-indusert aktivering av DR5-indusert og mitokondrier-mediert apoptose veier. Samtidig letter casticin TRAIL-indusert celledød ved apoptose ved å hemme anti-apoptose protein (cFLIP, BCL-2, Survivin og XIAP) uttrykk og aktivering av pro-apoptose proteiner.
Vi har vist at casticin indusert DR5 uttrykk i magekreftceller. Disse resultatene er i samsvar med de av våre tidligere arbeid [10] rapporterte vi at apoptotisk effekt av casticin i humane leverkreft celler er involvert i DR5 oppregulering men de gjorde ikke ta opp spørsmål om hvorvidt casticin kan forbedre TRAIL-indusert apoptose eller mekanismen for sensibilisering. Her har vi vist at DR5 oppregulering er kritisk for sensibilisering av celler til TRAIL, som genet Slå av reseptoren (DR5) svekket TRAIL-indusert apoptose. Dermed kan DR5 oppregulering sensitiv celler til TRAIL-indusert apoptose [27]. Mange mekanismer er blitt beskrevet for induksjon av DR, herunder ROS generasjon, p53 induksjon, og NF-kB, DDIT3 (DNA-skade-induserbar transkripsjon 3), peroksisomproliferator-aktivert reseptor-γ og MAPK-aktivering [27], [28] . I denne studien fant vi at casticin indusert CHOP og at genet Slå av CHOP av siRNA blokkert effekten av casticin på induksjon av DRs og på TRAIL-indusert apoptose. Våre funn er lik de andre studier som indikerte at CHOP binder til DR5-promoteren og oppregulerer denne reseptoren uttrykk [12], [29].
Det er velkjent at CHOP er en typisk ER stress-regulert protein som er involvert i ER stress-indusert apoptose [11]. Våre funn av CHOP induksjon av casticin antyder at casticin kan utløse ER stress og øke uttrykket nivåer av GRP78 og eIF2α, som er ekstra proteiner akkumulert eller økte i løpet ER stress [17]. Derfor virker det sannsynlig at casticin induserer ER stress. Salubrinal er en selektiv inhibitor av ER stress-indusert apoptose [30]. Tilstedeværelsen av salubrinal tilsynelatende beskyttet mage kreftceller fra casticin pluss TRAIL-fremkalt apoptose. Dermed virker det som casticin induserer apoptose potensering ved å involvere ER stress mekanismer.
Vi fant ut at kanskje det viktigste oppstrøms signal knyttet til casticin modulering av TRAIL reseptorer er ROS. Våre resultater viser utvetydig at casticin indusert produksjon av ROS, og at slukking av ROS av antioksidanten
N
acetylcysteine dempet effekten av casticin på induksjon av CHOP og DR5. Vi fant ut at å slukke ROS også svekket casticin potensering av TRAIL-indusert apoptose. Våre funn er i samsvar med det som er rapportert i tidligere studier med sulforaphane, zerumbone og celastrol for DR5 induksjon. Resultater av nåværende og tidligere studier indikerer sterkt at ROS spiller en stor rolle i modulering av TRAIL reseptor DR5 [31], [32]. Våre resultater er i overensstemmelse med de av tidligere arbeid, rapporterte vi at casticin skyldes opphopning av sub-G1-celler og økt ROS-produksjon i HeLa, CasKi og Siha cellelinjer, men ikke i PBMC [33]. Men vi viste at casticin redusert GSH innhold (
P 0,05
), men ikke påvirke nivået av intracellulære ROS i PLS /PRF /5 og Hep G2 celler [10]. En plausibel forklaring på den tilsynelatende data konflikten er at det er forskjeller i modalitet som regulerer handlinger i ulike celletyper.
Vi identifiserte også at den andre mekanisme for sensibilisering involverer reguleringen av anti-apoptotiske proteiner. Casticin downregulated uttrykket elevels av BCL-2, BCL-XL, XIAP og Survivin, som alle har vært knyttet til tumorcelle motstand mot TRAIL [34], [35]. Faktisk, nedregulering av XIAP, Bcl-2 og Bcl-xL ekspresjon er vist å sensibilisere tumorceller for å TRAIL [36], [37]. Wang
et al.
(2005) [8] viste at casticin redusert Bcl-2 ekspresjonsnivåer og downregulated forholdet av Bcl-2 /Bax ekspresjon i K562-celler. Våre resultater er også i samsvar med tidligere studier som viste at en etanolekstrakt av tørket moden frukt av
kyskhetstre
redusert nivået av BCL-2, Bcl-xL og Bud protein, og økte i nivå av Bax protein [7]. Rapporten fra Chen
et al. Product: (2011) nylig viste at Bax ble oppregulert, mens uttrykk nivåer av BCL-XL og XIAP ble nedregulert av casticin [33].
Kobayakawa et al. rapporterte at casticin markert hemmet veksten av KB-celler, men inhiberte ikke proliferasjonen av A431-celler, som er lik den normale cellelinjene 3T3 Swiss Albino og TIG-103 [38]. I denne studien, viste vi at casticin spesifikt indusert apoptose i humane mage kreftceller, men ikke i GES-1 celler, selv om virkningsmekanismen selektiv induksjon av apoptose er ikke fastslått. Våre funn tyder på at casticin kan være en spesifikk anti-tumor agent med lav toksisitet.
I sammendraget, våre resultater viser at casticin bidrar til følsomheten av kreftceller til sti ved å utnytte flere mekanismer. Casticin utgangspunktet fremmer ROS generasjon og utløser ER stress deretter induserer DR5 oppregulering gjennom aktivering av CHOP som dermed forbedrer TRAIL-indusert aktivering av DR5-indusert og mitokondrier-mediert apoptose veier. Samtidig letter casticin TRAIL-indusert apoptotisk celledød ved inhibering av anti-apoptose protein ekspresjon og aktivering av pro-apoptose-proteiner. Fremtidige undersøkelser bør ha som mål å realisere fullt ut potensialet av en kombinasjon av casticin og TRAIL terapi for å behandle pasienter med magekreft.
