Abstract
Bakgrunn
Eksistensen av kreft stamceller (cscs) eller kreft stamceller-lignende celler i en svulst masse antas å være ansvarlig for svulst tilbakefall på grunn av deres indre og ytre narkotika-motstand egenskaper. Derfor ville målrettet dreping av cscs være en nyere strategi for å forebygge tilbakefall tumor og /eller behandling ved å overvinne resistens. Vi har utviklet en ny syntetisk sammensetning-CDF, som viste større biotilgjengelighet i animalsk vev slik som bukspyttkjertelen, og også indusert hemming av cellevekst og apoptose, som ble mediert ved inaktivering av NF-kB, COX-2, og VEGF i bukspyttkjertelkreft ( PC) celler.
metodikk /hovedfunnene
i denne studien viste vi, for første gang, at CDF kan hemme sfære dannende evne (pancreatospheres) av PC-celler i samsvar med økt oppløsningen av pancreatospheres, som ble assosiert med demping av CSC markører (CD44 og EpCAM), spesielt i gemcitabin-resistente (MIAPaCa-2) PC-celler som inneholder høy andel cscs konsistente med økt MIR-21 og redusert MIR-200. I en xenograft musemodell for human PC, CDF behandling signifikant hemmet tumorvekst, som var assosiert med redusert NF-kB-DNA-bindende aktivitet, COX-2, og MIR-21 ekspresjon, og økt PTEN og MIR-200-ekspresjon i tumor rester.
Konklusjoner /Betydningen
Disse resultatene antyder sterkt at antitumoraktiviteten til CDF er forbundet med hemming av CSC funksjon via nedregulering av CSC-assosierte signalveier. Derfor CDF kan være nyttig for forhindring av tumor tilbakefall og /eller behandling av PC med bedre behandlingsresultat i fremtiden
relasjon:. Bao B, Ali S, Kong D, Sarkar SH, Wang Z, Banerjee S, et al. (2011) Anti-tumor aktivitet av en ny forbindelse-CDF er mediert av Regulering MIR-21, MIR-200, og PTEN i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 6 (3): e17850. doi: 10,1371 /journal.pone.0017850
Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA
mottatt: 13 desember 2010; Godkjent: 10 februar 2011; Publisert: 09.03.2011
Copyright: © 2011 Bao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. National Cancer Institute, NIH tilskudd 5R01CA131151, 3R01CA131151-02S1, og 5R01CA132794 (FH Sarkar). Vi takker Puschelberg og Guido grunnlaget for deres generøse økonomiske bidrag. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen (PC) er en av de mest dødelige ondartede sykdommer med verste prognosen, som er rangert som den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA [1]. I løpet av de siste to tiårene, har mange anstrengelser er gjort for å bedre behandling og overlevelse PC pasientene, men utfallet har vært skuffende. Dette skuffende resultatet skyldes mange faktorer blant som
de novo
motstand (intrinsic) og ervervet (ytre) motstand mot konvensjonell terapi (kjemoterapi og strålebehandling) inkludert gemcitabin alene eller i-kombinasjon med andre cytotoksiske eller målrettede midler . Emerging bevis tyder på at motstanden kan faktisk være på grunn av den anrikede eksistensen av tumorceller å initiere, også klassifisert som kreft stilk-lignende celler (CSC) i en tumormasse [2] – [6]. De cscs har kapasitet til selvfornyelse og muligheten for å regenerere inn i alle typer av differensierte celler som gir opphav til heterogene tumorcellepopulasjoner i en tumormasse, noe som bidrar til reduksjon av tumor aggressivitet [2] – [6]. Dermed er unnlatelse av å eliminere disse spesielle celler anses å være en av de underliggende årsakene til dårlig behandlingsresultat med konvensjonelle behandlingsformer, noe som tyder på at nyere og nye terapeutiske strategier må utvikles for målrettet drap på medikamentresistente cscs for å utrydde risikoen svulst tilbakefall for å bedre overlevelse av pasienter diagnostisert med PC.
på jakt etter ny ennå ikke-giftige stoffer, oppmerksomhet har vært fokusert på naturlige stoffer i flere år. Et slikt middel er curcumin (diferuloylmethane), som er avledet fra anlegget Curcuma longa (Linn) dyrket i tropisk Asia [7] – [9]. Curcumin har vist seg å hemme veksten av en rekke tumorceller; imidlertid den dårlige biotilgjengeligheten av curcumin begrenser dens anvendelse i klinikken. Nylig har vi utviklet en ny syntetisk analog av curcumin, 3,4-fluor-benzo-curcumin [vi kalte det som Difluorinated-Curcumin eller mangel CDF [10], [11]], som viste større biotilgjengelighet i bukspyttkjertelen vev, og også inhiberte cellevekst, DNA-bindende aktivitet av NF-kB, Akt, COX-2, og produksjon av PGE
2 og VEGF, og som skyldes induksjon av MIR-200 og inaktivering av MIR-21 i PC-celler [ ,,,0],12]. Siden MIR-200 er knyttet til oppkjøpet av epitelial til mesenchymale overgang (EMT), som også antas å være assosiert med cscs eller kreft stilk-lignende celler, her undersøkte vi effekten av CDF på CSC-funksjonen.
Her kan vi rapportere, for første gang, at CDF kunne inaktivere mange funksjoner av cscs inkludert selvfornyelse kapasitet som vist ved inhibering av kuledannende (pancreatospheres) evne til legemiddelresistente PC-celler, som var i samsvar med inaktiveringen av CSC biomarkører som CD44 og EpCAM. Vi viser også anti-tumor aktivitet av CDF alene og i kombinasjon med gemcitabin, som var i samsvar med inaktivering av MIR-21, og følgelig økt ekspresjon av PTEN, dempning av den DNA-bindende aktivitet av NF-kB-inhibering i ekspresjon av COX -2, og aktivering i ekspresjon av MIR-200 i tumor rester av en xenograft musemodell for human PC, som alle gir overbevis
in vivo
aktivitet av CDF som er i overensstemmelse med
in vitro
funn.
Resultater
ASPC-en og MIAPaCa-to cellelinjer og deres kloner ble valgt for denne studien på grunn av sin relativt motstandsdyktig natur. CSC egenskapene til disse cellelinjer ved bruk av stamcellemarkører «Lin28B og Nanog ved hjelp av RT-PCR, og EpCAM og CD44 ved western blot viste en økning i ekspresjon nivået i PC-GTR cellelinjer sammenlignet med foreldrecellelinjer (figur 1) . Derav valgte disse for å teste vår hypotese at CDF er mer effektiv enn selv curcumin i resistente cellelinjer, og også deres motstandsdyktige kloner-GTR.
Egenskapene til cscs ble ytterligere bekreftet ved protein ekspresjon av EpCAM og CD44 ( C).
CDF forhindrer sterkt clonogenicity og invasjon av PC celler sammenlignet med gemcitabin og curcumin
Vi valgte konsentrasjon på 20 nmol /L av gemcitabin og fire mikromol /L av curcumin eller CDF å gjennomføre klonogene analysen etter vår forrige publisering [12]. Resultatene viste at det var en signifikant reduksjon i clonogenicity av ASPC-1 og MIAPaCa-2-celler som ble behandlet med curcumin og CDF, men ikke med gemcitabin (figur 2A). Imidlertid hadde CDF behandling en mye større og signifikant reduksjon i kolonidannelse sammenlignet med curcumin. ASPC-1-GTR og MIAPaCa-2-GTR-celler hadde en 80% reduksjon av clonogenicity med CDF behandling, mens, var bare 20-30% reduksjon av clonogenicity observert med gemcitabin eller curcumin behandling (figur 2A). Samlet sett viste CDF behandling en betydelig reduksjon i clonogenicity av menneskelige PC celler, noe som tyder overlegenhet CDF.
Fluorescence av de invaderte celler ble lest opp ved hjelp ULTRA Multifunksjonell mikroplateleser (TECAN) ved eksitasjon /utslipp bølgelengder av 530 /590 nm. Basal nivå av ABCG2 uttrykk som viser relativt høyere uttrykk i resistente cellelinjer (C).
CDF eller curcumin behandling redusert PC celle migrasjon og invasjon. Resultatene viste at 4 umol /L av curcumin hadde minimal inhibering av invasjon, mens lignende konsentrasjon av CDF viste signifikant inhibering av invasjon (figur 2B). Basalnivået ABCG2 ekspresjon ble funnet i parencellelinjer (
de novo
medikament-resistente celler); imidlertid nivået av uttrykk for ABCG2 ble ytterligere økt i legemiddelresistente (ervervet resistente) cellelinjer (figur 2C).
CDF hemmet levedyktighet av menneskelige PC celler flere enn curcumin og gemcitabin som vurderes av MTT-analyse
å begynne med MTT-analysen ble utført for å undersøke effekten av forskjellige konsentrasjoner av gemcitabin (1 til 50 nmol /L), og curcumin eller CDF (2-6 umol /L) på celle overlevelse etter 72 timer fra behandlingen (data ikke vist). Deretter ble 4 umol /L av CDF eller curcumin, og 20 nmol /L av gemcitabin som brukes til å behandle enkeltvis så vel som i kombinasjon med gemcitabin i 72 timer. Resultatene viste at CDF behandling i kombinasjon med gemcitabin førte til en bemerkelsesverdig reduksjon i celleoverlevelse i alle fire cellelinjer sammenlignet med curcumin og gemcitabin kombinasjonsbehandling (figur 3). Videre analyse av medikamentkombinasjonsbehandling viste at kombinasjonsindeksen etter behandling med CDF i kombinasjon med gemcitabin var mindre enn 1,00 (figur 3), noe som tyder på den synergistiske virkningen av kombinasjonen CDF. I motsetning til dette kombinasjonsindeksen med curcumin og gemcitabin var mer enn 1,00 (figur 3), som viser ikke-synergistisk effekt. Samlet disse resultatene tyder på at CDF forårsaket en mye mer signifikant reduksjon i celleoverlevelse i PC-celler, sammenlignet med gemcitabin /curcumin alene eller deres kombinasjoner i forhold til CDF og gemcitabin formasjon.
MTT-analysen ble utført i alt fire celle linjer etter 72h behandling med CDF, curcumin, eller sin kombinasjon med gemcitabin. Ubehandlet kontroll er blitt tildelt en verdi på 100%. Den p-verdi vist representerer sammenligninger mellom monoterapi og deres kombinasjoner ved hjelp av paret t-test. Kombinasjonen Index (CI) 1 for CDF og gemcitabin kombinasjon indikerer synergisme
CDF bemerkelsesverdig økt pancreatosphere oppløsningen av PC-celler
For å undersøke effekten av behandlinger på kula forming. evnen til PC-celler (pancreatosphere) og oppløsningen av pancreatospheres, gjennomførte vi sfære oppløsningen assay i 10 dager for å generere dannelse av pancreatospheres, fulgt av 5 dagers behandling. Resultatene viser at det var en bemerkelsesverdig økning av sfære oppløsning av curcumin og CDF behandling, ikke av gemcitabin behandling (figur 4). Imidlertid ble den størst effekt på oppløsningen observert i respons til CDF behandling (figur 4), igjen antyder at CDF er mye mer overlegen i inhibering av funksjonene til kreft stilk-lignende celler.
P-verdier ble beregnet av paret
t
test.
CDF hemmet pancreatospheres formasjon i PC-celler
for å undersøke effekten av legemidler på CSC selvfornyelse kapasitet i PC-celler, vi gjennomførte sfære dannelse analyse for en uke og fire uker (figur 5A og B). Resultatene indikerte at CDF i kombinasjon med gemcitabin fullstendig eliminert pancreatospheres dannelse etter fire ukers behandling sammenlignet med gemcitabin og curcumin kombinasjon i PC-celler selv i gemcitabin-resistente PC-celler, noe som tyder på at CDF kan føre til at pancreatospheres mer følsom for gemcitabin enn den for curcumin behandling, og kan være nyttig for målrettet drap på cscs. Figur 5C viser effekten av forskjellige konsentrasjoner av gemcitabin og CDF på 2
nd passasje av pancreatospheres i forhåndsbehandlet primær pancreatospheres av ASPC-1-celler. CDF behandling bart inhiberes 2
nd passasje av pancreatospheres på en doseavhengig måte. Videre CDF-pre-behandlede celler viste en større effekt enn ikke-CDF-pre-behandlede celler.
En betydelig reduksjon i pancreatospheres ble observert i celler behandlet med CDF vist med stjerne
CDF redusert CD44 og EpCAM uttrykk i pancreatospheres av PC-celler
Vi undersøkte effekten av legemidler på CSC biomarkører, CD44 og EpCAM i pancreatospheres av ASPC-1 og ASPC-en-GTR celler ved konfokalmikroskopi (Figur 6). Resultatene indikerer at CDF redusert CD44 og EpCAM uttrykk i pancreatospheres, noe som tyder den hemmende effekten av CDF på pancreatosphere formasjon kan være assosiert med inhibering av CD44 og EpCAM uttrykk.
Ekspresjon i pancreatospheres av ASPC-1 og AsPC- 1-GTR celler ble vurdert av konfokal mikroskopi (forstørrelse X250).
CDF i kombinasjon med gemcitabin hemmet bukspyttkjertelen Tumor Vekst in vivo mye mer enn curcumin kombinasjon
Vi har brukt en subkutan xenograft tumor modell hvor svulsten ble indusert av MIAPaCa-2 celler i CB17-SCID mus. CDF behandling i kombinasjon med gemcitabin signifikant hemmet tumorvekst i MIAPaCa-2 svulster mye mer enn curcumin og gemcitabin kombinasjon (figur 7A), så vel som sammenlignet med enten ubehandlede kontroller eller de som ble behandlet med et enkelt medikament. Musene viste ingen vekttap i løpet av behandlingsperioden (30 dager), noe som tyder på at disse behandlings hadde ingen store negative effekter på dyr.
Anti-tumor aktivitet og endringer i tumorvekt fra hver gruppe av dyr ( EN). Pilen viser startdagen for behandling. NF-kB-DNA-bindende aktivitet av tumorvev; og NF-kB konkurranse med umerket kontrollstudie NF-kB oligonukleotid (B). Western blot-analyse av COX-2, PTEN og β-aktin-ekspresjon i tumor rester (C); MIR-21, MIR-200b og MIR-200c uttrykk i tumor restene målt ved real-time RT-PCR (D). P-verdier ble beregnet ved den sammenkoblede
t
test.
CDF med gemcitabin signifikant redusert NF-kB aktivering
in vivo
NF- kB aktivering ble bestemt i CDF eller curcumin, og /eller gemcitabin behandlet svulstrester som stammer fra MIAPaCa-2 celler indusert svulster som vist ovenfor. CDF og curcumin som monoterapi nedregulert NF-kB aktivering mens gemcitabin aktivert NF-kB nivå, som ble opphevet i kombinasjonsbehandling med CDF. Kombinasjonen behandling av CDF med gemcitabin viste en signifikant reduksjon i NF-kB nivå sammenlignet med curcumin og gemcitabin behandling (figur 7B), noe som tyder på at inaktivering av NF-kB kan være en av de molekylære mekanismer som CDF fremkaller sin anti-tumor aktivitet mot PC-svulster.
CDF effekt på protein uttrykk
in vivo
COX-2, PTEN, og β-actin ble bestemt ved Western blot. En betydelig nedregulering i ekspresjon av COX-2 ble observert både i kombinasjon, men effekten var mer uttalt i CDF kombinasjonsgruppen. Ekspresjonen av fosfatase og spenning homolog (PTEN), ble et tumorsuppressorgen funnet å være redusert i MIAPaCa-2-celler; imidlertid ekspresjon av PTEN ble oppregulert ved behandling med CDF (figur 7C). Disse resultater antyder at CDF er mye mer effektiv enn curcumin. Siden PTEN er et kjent mål for MIR-21, som har blitt rapportert å være oppregulert i PC [13] – [15], vi vurdert uttrykket nivåer av MIR-21 i tumor restene som vist nedenfor
Modulation i uttrykket av MIR-21 og MIR-200 familien
in vivo
Vi bestemte uttrykket nivåer av MIR-21, MIR-200b og MIR-200c i MIAPaCa-2 svulster med real time RT-PCR. Over-ekspresjon av MIR-21 ble observert i MIAPaCa-2 svulster, mens vi har funnet en signifikant reduksjon i ekspresjonen av MIR-21 i tumorer behandlet med enten CDF alene eller i kombinasjon med gemcitabin og CDF (figur 7D). Vi videre bestemmes uttrykket nivåer av miRNA-200B og MIR-200c i tumorvev som er kjent regulatorer av EMT og funnet å være betydelig lav i MIAPaCa-2 celler (figur 7D). I kontrast, fant vi at CDF behandling med eller uten gemcitabin kombinasjonen viste økt uttrykk av både MIR-200B, og MIR-200C, men effekten med curcumin eller kombinasjonen var minimal, noe som tyder overlegenhet CDF undertrykke uttrykket av MIR -21, noe som resulterer i re-uttrykk for PTEN, og re-uttrykk for MIR-200 som kan være ansvarlig for reversering av EMT fenotype i celler behandlet med CDF. Samlet disse resultatene tyder på at de fenotypiske karakteristika for MIAPaCa-2 tumorer er i overensstemmelse med anriket populasjon av cscs og EMT egenskaper, og disse medikament-resistente celler kan drepes enten ved CDF alene eller i kombinasjon med gemcitabin.
Pancreatospheres forbedret tumorvekst
in vivo
Under tradisjonelle eksperimentelle forhold, vi vanligvis injiserer en million celler for å vurdere tumorvekst; Men for å undersøke større potensial av tumorvekst ved pancreatospheres, injisert vi bare 5000 celler i mus som en proof-of-concept studie. Svulsten vekt ble bemerkelsesverdig økt som dagene kommet (figur 8A). Nivået på MIR-21 ble økt mellom svulster implantert med millioner av foreldreceller sammenlignet med pancreatospheres (figur 8b). Dyret ble avlivet etter 30 dager på grunn av tumorbyrde, og grove tumorer er vist i figur 8C indikerer større svulster samt lokoregionalt lymfeknutemetastase, mens tumorer avledet fra parentale celler ikke viser noen metastasering over en periode på 30 dager. De tumor-avledede celler viste signifikant inhibering av pancreatospheres når de behandles med CDF (figur 8D). Samlet disse resultatene tyder på at cscs (pancreatospheres) kan dyrkes i mus og CDF kan være nyttig for å drepe disse medikament-resistente celler (fig. 8).
(A). 5000 pancreatospheres ble inokulert i mus ved bruk av 1:01 matrigel, progressiv tumorvekst over en periode på 30 dager. Moderat økning i uttrykket av MIR-21 målt ved real-time RT-PCR ble observert i tumorer avledet fra pancreatospheres forhold til svulster som stammer fra foreldreceller ved å injisere en million celler og tumor ble vurdert i forhold til samme periode (B) . Fotografier som viser tumorvekst, pilen peker mot svulsten og stjerne (*) viser til lokoregionalt lymfeknutemetastaser, mens vi ikke fant noen metastaser når en million foreldre celler ble injisert (C). Tumorceller høstet fra svulstene som stammer fra pancreatospheres ble behandlet med CDF viste signifikant hemming i dannelsen av pancreatospheres (D).
Diskusjoner
I denne studien har vi vist at en syntetisk analog av curcumin, CDF, er betydelig mer effektiv sammenlignet med curcumin i drap av gemcitabin-resistent kreft i bukspyttkjertelen (PC) -celler som består høy andel av celler med kreft stamceller (cscs) eller kreft stilk-lignende celler egenskaper. Hemmingen av cellevekst kan delvis skyldes bedre cellulært opptak, oppbevaring og redusert metabolsk inaktivering av CDF av PC-celler, som er i overensstemmelse med våre publiserte funn ved cellulære og dyre farmakokinetikk data [10], [11]. Våre tidligere rapporter tyder på at CDF hemmer NF-kB og COX-2 aktivitet i PC-celler
in vitro product: [12]. Her bekrefter vi disse observasjonene
in vivo
bruker en mus xenograft modell. Således er dreping av gemcitabin-resistente PC-celler ved CDF forbundet med inaktivering av NF-kB og COX-2-signalveien som er meget viktig fordi disse banene er kjent for å bidra til medikamentresistens av PC-celler overfor kjemoterapeutiske midler [16] -. [18]
cscs omfatter bare en meget liten andel av celler i en tumormasse, og besitter evnen til å fornye seg selv og gi opphav til differensierte tumorceller [3] – [5], [19] . CSC teorien har grunnleggende kliniske implikasjoner spesielt fordi CSC har blitt identifisert i mange ondartet svulst vev inkludert bukspyttkjertel kreft og anses å være svært motstandsdyktig mot kjemoterapi-strålebehandling enn differensierte datterceller [3] – [5], [20]; Men cscs isolert fra humane svulster er vanligvis tilstrekkelig for videre mekanistiske studier. Eksistensen av cscs gir en forklaring på klinisk observasjon at tumor regresjon alene ikke kan relatere til pasientens overlevelse [21] på grunn av svulst tilbakefall, som er delvis på grunn av tilstedeværelsen av cscs. Derfor rettet mot selvfornyelse stier og drapet på cscs kan gi mer konkret tilnærming for å eliminere celler som er roten til tumorresidiv. En potensiell utfordring i denne henseende er utviklingen av terapier som selektivt påvirker cscs skåner normale stamceller som kan stole på lignende mekanismer for selvfornyelse. I denne studien, har vi vist at CDF ikke bare inhibere cellevekst av PC-celler, men også inhiberer CSC selvfornyelse kapasitet som bestemt ved sfære formasjon (pancreatospheres) analyser. Derfor CDF kunne ha et større potensial for å hemme kreft vekst som dokumentert av våre xenograft mus modell av gemcitabin resistente PC celler, som synes å være formidlet via hemming av CSC selvfornyelse kapasitet.
Emerging tyder rollen av mikroRNA (miRNA) i mange biologiske prosesser [22] – [25]. Blant mange mirnas, MIR-21, som vanligvis betraktes som et oncogen, er overuttrykt i mange faste tumorer, inkludert PC, og har blitt rapportert å være assosiert med tumorprogresjon, dårlig overlevelse og medikamentresistens [13], [14], [26 ], [27]. I vår forrige rapport, har vi vist at uttrykket av MIR-21 er oppregulert i gemcitabin-resistente PC celler og at dens uttrykk kan være betydelig nedregulert av CDF behandling
in vitro product: [12]. Den økte ekspresjon av MIR-21 er kjent for å være forbundet med inaktivering av PTEN, a vet tumorsuppressorgen, noe som resulterer i aktivering av PI3K /Akt /mTOR signalveien, hvilket fører til aggressiv tumorvekst [15], [28]. I dette studiet bekreftet vi at CDF behandling kan resulterer i nedregulering av MIR-21, noe som resulterer i opp-regulering av PTEN
in vivo
, hvilket antyder at anti-tumoraktiviteten til CDF er forbundet med oppregulering av PTEN som følge av inaktivering av MIR-21 ekspresjon.
i motsetning til MIR-21, er MIR-200 familie kjent som tumor-suppressor og de er vanligvis nedregulert i noen tumorer, inkludert PC og tap av uttrykk for MIR-200 familien bidra til oppkjøpet av EMT fenotype og narkotika motstand. Nedregulering av MIR-200 ved siRNA teknikk er blitt vist å være assosiert med EMT fenotype når den gjenn ekspresjon av MIR-200 kan resultere i en reversering av EMT fenotype [29], [30]. I vår forrige publisering [12], viste vi at CDF behandling kan gjen uttrykke MIR-200 i PC-celler. Her viste vi, for første gang, at CDF kan oppregulerer MIR-200B og MIR-200c i tumor restene
in vivo
, i samsvar med betydelig større hemning av tumorvekst i en xenograft musemodell ved CDF var anvendes i kombinasjon med gemcitabin. Disse resultatene tyder på at anti-tumoraktiviteten til CDF medieres via re-ekspresjon av MIR-200 som kan potensielt resulterer i reversering av EMT fenotype, og kan også føre til å overvinne resistens i PC.
I konklusjonen viste CDF mye mer uttalt veksthemmende virkning, hemmet CSC selvfornyelse i samsvar med inaktivering av CSC biomarkører (CD44 og EpCAM) i PC-celler spesielt i gemcitabin-resistente PC celler sammenlignet med curcumin. I xenograft musemodell av humane PC tumorer indusert av MIAPaCa-2-celler, CDF utviser antitumoraktivitet ved å regulere COX-2, PTEN, MIR-21, MIR-200, og NF-kB
in vivo
. Disse resultatene antyder sterkt at CDF kan være en roman middel for behandling av PC generelt, men gemcitabin-resistente PC særlig ved å dempe oppførselen cscs.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Noen dyr funnet usunn eller syk ble raskt avlivet. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Wayne State University institusjonelle Brukere Animal Care komité (Permit Number: A-10-03-08).
Cell Culture, narkotika og reagenser
menneske~~POS=TRUNC cellelinjer ASPC-en, og MIAPaCa-2 ble kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia). Disse to cellelinjer ASPC-en og MIAPaCa-2 ble utsatt for 200 nmol /L av gemcitabin og 5 pmol /L av Tarceva (erlotinib) annenhver uke i ca 6 måneder for å skape gemcitabin og Tarceva resistente (GTR) cellelinjer, heter som ASPC-en-GTR og MIAPaCa-to-GTR, henholdsvis. Som et resultat, ASPC-1, ASPC-1-GTR, MIAPaCa-2, og MIAPaCa-2-GTR ble valgt for dette studium basert på deres differensielle følsomheter til gemcitabin. Alle cellelinjene har blitt godkjent (Applied Genomics Technology Center ved Wayne State University) den 13. mars 2009, og disse autentiserte cellene ble frosset for senere bruk. Den brukes til testing metoden var kort tandem repeat profilering bruker PowerPlex 16 System fra Promega. Gemcitabin og curcumin ble kjøpt fra Eli Lilly (Indianapolis, IN) og Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), henholdsvis. CDF ble syntetisert som beskrevet i vår tidligere publikasjon [10], [11]. Gemcitabin ble oppløst i vann, mens CDF og curcumin ble oppløst i DMSO til en sluttkonsentrasjon på 0.1% DMSO i ferdig medium.
Antistoffer
Antistoffer mot ABCG2 og PTEN ble anskaffet fra Santa Cruz ( Santa Cruz, CA). Antistoff mot COX-2 og β-aktin ble kjøpt fra Cayman Chemicals (Ann Arbor, Michigan), og Sigma Chemicals (St. Louis, MO).
klonogene analysen
klonogene Analysen ble gjennomført for å undersøke effekten av medikamenter på cellevekst i PC-celler, som tidligere beskrevet [12]. 5 x 10
4 celler ble sådd ut i en seks-brønns plate. Etter 72 timer eksponering til 20 nmol /L av gemcitabin, 4 umol /L av CDF eller curcumin ble cellene trypsinert, og 1000 enkeltlevedyktige celler ble sådd ut i 100 mm petriskåler. Cellene ble deretter inkubert i 10 til 12 dager ved 37 ° C i en 5% CO
2/5% O
2/90% N
2 inkubator. Koloniene ble farget med 2% krystallfiolett og telles.
Invasion analysen
invasiv aktivitet av celler ble testet ved hjelp av BD BioCoat Tumor Invasion analysesystem (BD Biosciences, Bedford, MA) i henhold til produsentens protokoll som tidligere beskrevet [31]. I korthet 5 x 10
4 celler ble sådd med serumfritt medium supplert med curcumin eller CDF inn i det øvre kammer og nedre brønnene ble fylt med komplett medium i systemet. Den, fluorescens ble lest ved hjelp av mikroplateleser (TECAN) ved 530/590 nm og ble fotografert.
Cell overlevelse analyse
MTT analysen ble utført ved bruk av ASPC-en, ASPC-en-GTR, MIAPaCa-2, og MIAPaCa-2-GTR som tidligere beskrevet [12] etter 72 timers behandling. Kombinasjon indeks og isobologram for kombinasjonsbehandling ble også beregnet og plottet ved hjelp CalcuSyn programvare (Biosoft, Cambridge, Storbritannia) for å bestemme synergi basert på metoden for Chou og Talalay [32].
Sphere dannelse /oppløsning analyse
Enkeltcellesuspensjoner celle~~POS=TRUNC suspen~~POS=TRUNC av celler ble sådd ut på ultralave adherente brønner i 6-brønn plate med 1000 celler /brønn i formasjonen sfære medium [33]. Etter 7 dager ble kulene betegnes som «pancreatospheres» oppsamlet ved sentrifugering og tellet [33]. For sfære desintegrering assay, 1000 celler /brønn ble inkubert i 10 dager, etter 5 dagers behandling, som undersøkte effekten av behandling på oppløsningen av pancreatospheres som tidligere beskrevet [33]. De pancreatospheres ble oppsamlet ved sentrifugering og tellet under et mikroskop.
Konfokalmikroskopi
Enkeltcellesuspensjoner av ASPC-1 og ASPC-1-GTR celler ble sådd ut ved hjelp av ultra lav adherente brønnene av 6- brønn plate med 3000 celler /brønn i formasjonen sfære medium. Etter 7 dagers behandling ble de pancreatospheres oppsamlet ved sentrifugering, vasket med 1 x PBS og fiksert med 3,7% parformaldehyde. CD44 og EpCAM-antistoffer ble brukt til farging assay som tidligere beskrevet [29]. De CD44 eller EpCAM-merkede pancreatospheres ble fotografert av konfokalmikroskopi (Leica TCS SP5) ved hjelp av programvare LAS AF 1.2.0 Build 4316.
Protein utvinning og Western blot analyse
Proteiner ble hentet fra alle fire cellelinjer og også fra animalsk tumorvev som tidligere beskrevet [12]. Relative nivået av ABCG2 ble evaluert for alle fire cellelinjer. Effektene på COX-2, PTEN og β-aktin ekspresjon ble evaluert på tumorvev ved hjelp av Western blot-analyse. som beskrevet tidligere [12].
Animal Experiments
Dyret protokollen ble godkjent av Investigation Committee Animal, Wayne State University, Detroit, MI. Kvinne CB17 SCID-mus 4 uker gamle ble kjøpt fra Taconic Farms (Germantown, New York) og matet Lab Diet 5021 (Purina Mills, Inc., Richmond, IN). Små fragmenter av MIAPaCa-2 xenograft ble implantert subkutant og bilateralt i mus for narkotika-effektstudiene de. Når musene håndgripelig tumorer, ble de tilfeldig valgt inn i følgende behandlingsgrupper (n = 5 /gruppe): (1) ubehandlet kontroll; (2) CDF (5 mg /mus /dag), intragastrisk en gang daglig i 12 dager; (3) curcumin (5 mg /mus /dag), intragastrisk en gang daglig i 12 dager; (4) gemcitabin (1 mg /mus /dag), intravenøst hver tredje dag for en total av tre doser; (5) CDF og gemcitabin ved bruk av doser som er angitt ovenfor; (6) curcumin og gemcitabin ved bruk av doser som er angitt ovenfor. Tumormålinger og vektendring ble utført og vev ble lagret ved -70 ° C for RNA og proteinutvinning.
Elektroforetisk mobilitet skift analyse (EMSA) assay for vurdering av DNA-bindende aktivitet av NF-kB kB
kjerneproteiner ble fremstilt fra tumorer vev ved hjelp av en Dounce homogenisator med 400 ul iskald lyseringsbuffer utvunnet som tidligere beskrevet [34]. EMSA ble utført ved hjelp av Odyssey Infrared Imaging System med NF-kB IRDye merket oligonukleotid fra LI-COR, Inc. (Lincoln, Nebraska). Ti ug av det kjerneproteinekstrakt ble anvendt som tidligere beskrevet [34]. NF-kB konkurranse kontrollstudie ble utført ved bruk av umerket NF-kB konsensus oligonukleotid. Prøvene ble påført og kjørt ved 30 mA i en time. Gelen ble skannet ved hjelp av Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR, Inc.).
TaqMan miRNA Real-Time revers transkriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
For å bestemme uttrykket av miRNAs (miRNA-200b, MIR-200c, og MIR-21) i MIAPaCa-2 svulster, brukte vi TaqMan mikroRNA Assay kit (Applied Biosystems) etter produsentens protokoll. 5 ng av total RNA ble revers transkribert og real-time PCR reaksjoner ble utført som beskrevet tidligere [30], ved hjelp av Smart Cycler II (Cepheid).
