Abstract
microRNAs er endogene kortkjedede nukleotid RNA som regulerer gen-funksjon ved direkte binding av målet mRNA. I denne studien undersøkte vi effekten av mikroRNA-206 (MIR-206) på utvikling av magekreft. MIR-206 ble først bekreftet å være nedregulert i magekreftprøver. Motsatt, oppregulering av c-Met ble bekreftet i vevsprøver av human magekreft, med sitt nivå omvendt korrelert med Mir-206 uttrykk. Innføring av MIR-206 hemmet celleproliferasjon ved å indusere G1 cellesyklus arrest, samt migrasjon og invasjon. Videre ble viktige spredning og /eller migrasjonsrelaterte molekyler som c-Met, CDK4, p-Rb, p-Akt og p-ERK bekreftet å være nedregulert med Western blot analyse. Målretting av c-Met også direkte berørt AGS celleproliferasjon, migrasjon og invasjon.
In vivo
, MIR-206 uttrykker tumorceller også vist vekst forsinkelse i forhold til upåvirket tumorceller. Våre resultater viser at MIR-206 trykt c-Met uttrykk i magekreft og kan fungere som en potent tumor suppressor i c-Met overekspresjon svulster. Inhibering av MIR-206 funksjon vil kunne bidra til avvikende celleproliferasjon og migrasjon, som fører til magekreft utvikling
relasjon:. Zheng Z, Yan D, Chen X, Huang H, Chen K, Li G, et al. (2015) mikroRNA-206: Effektiv Hemming av Gastric Cancer Progresjon gjennom c-Met Pathway. PLoS ONE 10 (7): e0128751. doi: 10,1371 /journal.pone.0128751
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN
mottatt: 04.02.2015; Godkjent: 01.05.2015; Publisert: 17.07.2015
Copyright: © 2015 Zheng et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Natural Science Foundation National Kina Grant 81100671 (DY), Foundation of China Grant Y2110609 Zhejiang Provincial Natural Science ( DY), og Wenzhou Science Teknologi Bureau Grant Y20080096 (DY). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreft dødsfall i verden [1]. Dens morbiditet og mortalitet er spesielt tydelig i asiatiske land på grunn av en rekke påvirkninger [1]. Siden sin presentasjon er ofte forbundet med avansert sykdom, det er et presserende behov for fremskritt i sin påvisning og til slutt sin ledelse. I dag er forståelsen av microRNAs (miRNAs) på å påvirke magekreft dannelse forekommer i et hurtig tempo.
Siden den første beskrivelsen av miRNA i nematode
C
.
elegans
tilbake i 1993, virkningen av disse små ikke-kodende RNA har overskredet flere grener av molekylærbiologi [2]. Mirnas er svært vev spesifikke biomarkører med potensial til å endre og transformere bosatt vev. Fordi overekspresjon og under-uttrykk har begge vært tilknyttet tumorigenesis [3], sine roller som onkogener og tumorsuppressorgener er begge veletablerte [4, 5]. I løpet av de siste årene, er deres innvirkning på utvikling og påvisning av organ tumorer inkludert magekreft langsomt blir belyst. Det er allerede flere mirnas identifisert i magekreft anti-apoptotiske mekanismen som MIR-21 og MIR-148a [6, 7]. Andre veier er påvirket av mirnas inkluderer cellecyklusprogresjonen bestående av MIR-222/221, MIR-106b /93/25 og Mir-24 [6, 7].
En av de andre lovende nye mirnas Solid organ svulster inkluderer MIR-206 [8]. Denne spesielle miRNA hører til en gruppe av «myomiRs» som er involvert i skjelettmuskelutvikling [9]. Etter å ha vært forbundet med en rekke andre sykdommer som hjertesykdom, kronisk obstruktiv pulmonal sykdom og Alzheimers, dets rolle i onkogenesen mottatt granskning mer nylig inkludert rhabdomyosarkom, lungekreft, tykktarmskreft, schwannom, og magekreft [8, 9]. Selv om forhøyet i noen typer kreft, inkludert eggstokkreft og Walden makroglobulinemi er MIR-206 mest undertrykte i organ svulster [9]. MIR-206 har tidligere blitt vist å hemme magekreft spredning delvis ved å undertrykke cyclin D2 [10]. I denne undersøkelsen har vi konsentrert oss om rollen til MIR-206 i magekreft onkogenese gjennom c-Met sti, som tradisjonelt har vært en innflytelsesrik signalveien for onkogenese i en rekke svulster [11]. c-Met har blitt spådd og vist seg å være målet gen av flere mirnas inkludert MIR-206 [9, 12].
Resultater
Suppression of Mir-206 førte til økt c-Met uttrykk i magekreft
real-time RT-PCR-analyse ble utført for å påvise uttrykk av MIR-206 i 40 magekreft prøver og normalt vev. MIR-206 nivåer i de fleste vevsprøver av mage tumor (34/40) ble funnet å være betydelig lavere enn normalt vev (fig 1A). MIR-206 ekspresjon var ikke-reversibelt relatert til nivået av c-Met observert i tumorprøver (figur 1B). De fleste tumorprøver, med redusert MIR-206 uttrykk, viste høy prosentandel (mer enn 50%) av c-Met-farging. Omvendt, svulster med normal ekspresjon av MIR-206 viste veldig svak eller negativ c-Met uttrykk.
(A) Real-time RT-PCR-analyse som viser uttrykket av MIR-206 i normalt vev (satt til 1 ) og den relative mengde av MIR-206 i tumorene, som gangers reduksjon. N: normalt vev; T: svulster. U6 snRNA ble anvendt som en intern kontroll. (B) MIR-206 uttrykk i cellene ble omvendt korrelert med c-Met. Representanten immunhistokjemisk farging av tre mage vevsprøver og deres respektive tilstøtende normalt vev ble presentert. Prøvenummer 2, 6 og 23 er identiske med de i Real-time RT-PCR. Tumorceller med 50% positiv farging ble ansett for å ha sterk c-Met uttrykk.
MIR-206 indusert G1 arrest og hemmet celleproliferasjon, migrasjon og invasjon av AGS magekreftceller
Som MIR -206 ekspresjon ble redusert i magekreft prøver, søkte vi å fastslå om innføring av MIR-206 hadde noen biologisk virkning på AGS-celler. AGS-celler transfektert med den MIR-206 molekyl viste inhibisjon av cellevekst sammenlignet med negativ kontroll basert på MTS-analysen (figur 2A). FACS-analyse av cellene viste G1 cellesyklus-stans (S1 Fig). Antallet kolonier ble også redusert med transfeksjon av MIR-206 (S2 figur).
(A) MTS celle proliferasjonsanalyse ble utført på dag 3 som indikert. (B) AGS celler ble vurdert med Transwell og Matrigel analyser. Antall celler som hadde migrert gjennom kulturinnsats porer (venstre) eller hadde invadert gjennom Matrigel innsats porer (til høyre) ble kvantifisert ved å telle fem uavhengige synsfelt. *: Forskjeller i cellevandring eller invasjon mellom MIR-206 og negative kontroll transfekterte celler var betydelig,
P
0.01.
MIR-206 kan hemme migrasjon og invasjon av AGS celler (figur 2B og S3 Fig). En dramatisk reduksjon av vandring mot de nedre kamrene ble observert i MIR-206 transfekterte celler (AGS 86 ± 15 vs. 165 ± 16 i AGS-celler,
P
0,01, n = 3). I tillegg celler transfektert med MIR-206 viste at HGF-indusert invasivitet ble også betydelig hemmet følgende MIR-206 transfeksjon (57 ± 12 vs. 116 ± 14 i AGS celler,
P
0,01, n = 3).
MIR-206 downregulated c-Met uttrykk og andre cellesyklusrelaterte proteiner
Vi har tidligere identifisert c-Met som et direkte mål for MIR-206 [9]. Western blot-analyse bekreftet at c-Met ekspresjon ble redusert med MIR-206 transfeksjon i AGS-celler (figur 3). Samtidig ektopisk MIR-206 også nedregulert uttrykk for CDK4, p-Rb, p-Akt og p-ERK.
MIR-206 nedregulerer også uttrykk for p-Akt og p-ERK1 /2, men ikke total Akt eller ERK1 /2.
nedregulering av c-Met hemmet magekreft celleformering, migrering og invasjon
Deretter c-Met spesifikk siRNA ble først brukt til å redusere uttrykket av c-Met i AGS celler (S4 fig). MTS analyser ble utført for å detektere proliferasjon av celler. AGS celler transfektert med c-Met siRNA viste redusert cellevekst i forhold til negative kontrollceller (fig 4A, 25,10 ± 3,81% reduksjon). Både HGF-indusert migrasjon og invasjon ble redusert når man sammenligner c-Met siRNA transfekterte celler til negative kontroll transfekterte celler. Som indikert i figur 4B og S5 Fig, reduksjon i migrasjon (88 ± 10 vs. 155 ± 15, P 0,01, n = 3) og invasjon (72 ± 7 vs. 126 ± 12, P 0,01, n = 3) var både statistisk signifikant.
(A) MTS celle proliferasjonsanalyse ble utført på dag 3 etter transfeksjon. (B) Virkningen av c-Met siRNA på AGS celler ble kvantifisert ved bruk av kultur eller Matrigel innsatser.
Innføring av MIR-206 undertrykte tumorvekst
in vivo
Vi neste undersøkt om overekspresjon av MIR-206 kan undertrykke tumorvekst
in vivo
. Etter 8 uker, de gjennomsnittlige tumorvolum var betydelig lavere fra celler infisert med lentivirus som uttrykker MIR-206, sammenlignet med kontroll (figur 5).
(A) Representative fotografier av nakne mus 8 uker etter inokulering. (B) Gjennomsnittlig volum av tumorer var statistisk signifikant. *: N = 5 hver,
P
0.01.
Diskusjoner
Magekreft har vært en betydelig helsevesenet byrden over hele verden til tross for mange års forskning [1]. Ifølge WHO, forblir magekreft en av de beste kreft etiologies med høy dødelighet [1]. Som med andre organ svulster, er det stadig klarere at bedre forståelse av svulst onkogenese er nødvendig for å bedre prognosen for disse pasientene. Å være utbredt i asiatiske land, er data dukker opp på rollen mirnas på utvikling eller undertrykkelse av magekreft [6].
mirnas har to funksjoner i form av magekreft utvikling [6, 13]. Noen mirnas er tumor suppressors og andre er oncomiRs [6]. Ueda et al. funnet 22 mirnas oppregulert og 13 nedregulert i plasma hos pasienter med magekreft [13]. Mål som er under etterforskning i tilfelle av magekreft inkluderer regulering av p16, via MIR-24, og p21 gjennom MIR-222/221 og MIR-106b /93/25 [6]. Andre, slik som MIR-21, kan oppregulert i opptil 92% av magekreft vevsprøver [14]. Kandidater som er identifisert i magekreft tjene som tumor suppressors inkluderer MIR-181b, MIR-101 og MIR-486 [6]. For eksempel er MIR-101 tenkt å målrette EZH2, Cox-2, Mcl-en og Fos [15]. MIR-486 er tenkt å påvirke OLFM4, muligens påvirker apoptose nedstrøms [16].
Etter å ha slått fast at flertallet av miRNAs tjene som tumor suppressors undersøkte vi c-Met veien i magekreft. I studere c-Met vei for rhadbomyosarcoma, fant vi viktigheten av denne veien i sarkom [9]. c-Met er kjent for å være dysregulerte i magekreft [11, 17-19]. MTT-proto-onkogenet koder for et protein som kalles hepatocytt vekstfaktor (HGF) reseptor som innehar tyrosin kinase aktivitet [18]. Vi vanligvis finner det uttrykkes bare i stamceller, men har også sett sin feilregulering i onkogenese [18]. I denne studien, var vi i stand til å bekrefte at c-Met er betydelig involvert i magekreft og dens rolle som en MIR-206 mål er sentral i onkogenese.
cellecyklusprogresjonen er dysregulerte i magekreft. Basert på tidligere rapporter, er cyclin D2 forhøyet i magekreft når MIR-206 er rammet [10]. MIR-206 har vist seg å være et potent prognostisk markør [10]. Sin nedregulering er forbundet med kortere total overlevelse. Restaurering av MIR-206 fører til G0 /G1 cellesyklus arrest, bekrefter sin rolle som en tumor suppressor. Vårt arbeid viser også cellesyklusen feilregulering med CDK4 og fosforylert-Rb blir påvirket. CDK4 er et medlem av cycline avhengig kinase familien med ser /thr-protein-kinase-aktivitet. Det fører til G1 fase progresjon. I tillegg fører den til kinase fosforylering av Rb, som er en tumor suppressor som er involvert i cellesyklusprogresjon.
Selv om lignende funn er blitt bekreftet i mage, ovarier og brystkreft, synes rollen til mir-206 å ha en motsatt effekt på tykktarmskreft [6, 20]. En invers korrelasjon ble observert mellom MIR-206 og KLF4 i et panel av humane tykktarm kreft [20]. KLF4, som har onkogene egenskaper i andre kreftformer som brystkreft, hud og lunge, fungerer som en tumor suppressor i tykktarm kreft [20]. Dens promoter er hyper-metylert med forhøyede nivåer av MIR-206 som fører til nedregulering av KLF4 [20]. Disse funnene tyder på at Mir-206 ikke kan fungere på samme måte i alle epitelceller, som fornekter en størrelse passer alle tilnærming i kjemoterapeutika.
I denne studien har vi identifisert en mekanisme for regulering av c-Met genekspresjon gjennom MIR-206 i magekreft. c-Met overekspresjon følgende MIR-206 nedregulering synes å være det felles etiologi for patogenesen av magekreft i de fleste undersøkte prøvene i denne studien. I sammendraget, viste vi at MIR-206 modulerer negativt c-Met signalveien involvert i celleproliferasjon og migrasjon. Våre studier vil forhåpentligvis ha viktige kliniske konsekvenser i behandling av magekreft. MIR-206 er en kandidat for både immunhistokjemisk påvisning av små svulster og mulig mål for biologiske behandlingsformer.
Materialer og metoder
Cell kultur
Den menneskelige magekreft cellelinje, AGS, kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia), ble dyrket i Hams F-12 Medium (Invitrogen, Carlsbad, California) supplert med 10% føtalt bovint serum. (FBS, Hyclone, Logan, UT)
Etikk uttalelse
Denne studien ble utført i henhold til de anbefalinger og godkjenning av Wenzhou Medical University Animal Care og bruk Committee (Permit Number: WZMCOPT-043011). Førti mage vevsprøver og normale giver mage vev ble innhentet fra andre tilknyttet sykehuset i Wenzhou Medical University (Wenzhou, Kina). Prøvetaking ble godkjent av Wenzhou Medical University etiske komité på forskning som omfatter mennesker, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hvert enkelt tilfelle. Alle forsøkene ble utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen og nasjonale lover.
Kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra humane mage tumorprøver og normale kontroller med Trizol reagens (Invitrogen). 10 ng av total RNA ble benyttet for cDNA-syntesen ved hjelp av Taqman mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), og MIR-206 ekspresjonsnivået ble kvantifisert ved Taqman mikroRNA Assay (Applied Biosystems). Real-time RT-PCR ble utført ved hjelp av Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems).
Immunhistokjemisk farging av c-Met
Deler av formalinfiksert parafin-embedded human gastrisk tumorprøver (5 um) ble laget og deretter de-paraffinized med xylen og etanol. Objektglassene ble behandlet med 0,3% hydrogenperoksyd og deretter inkubert over natten ved 4 ° C med c-Met-antistoff ved 1: 300 fortynning (CST, Beverly, MA). Immunhistokjemisk farging ble utført ved hjelp av EnVision HRP /DAB deteksjonssystem (Dako, Glostrup, Danmark).
celleproliferasjonsanalyse
AGS-celler ble platet ut ved 2000 celler per brønn i 96-brønners plater ( Costar, High Wycombe, UK) for hver transfeksjon. Transfeksjoner ble utført med reagens (Lipofectamine RNAiMAX; Invitrogen), in triplo. For hver brønn, 50 nM MIR-206 ligner molekyl (Ambion, Austin, TX), eller en negativ kontroll (Ambion) transfeksjon ble ansatt. Etter 72 timers dyrkning ble celleproliferasjon bestemt ved MTS-analyse (CellTiter 96 Aqueous, Promega, Madison, WI).
Transwell migrasjons assays
24 timer etter transfeksjon, AGS-celler ble høstet ved trypsinering og vasket en gang med D-Hanks oppløsning (Invitrogen). For å måle cellemigrering eller invasjon, 8-um porestørrelse kultur eller Matrigel innsatser (Transwell; Costar) ble plassert i brønnene av 24-brønners kulturplater. I det nedre kammer, 400 mL F-12 inneholdende 10% FBS og 20 ng /ml HGF ble tilsatt. Deretter ble 5×10
4 celler tilsatt til det øvre kammer. Etter 20 timers inkubering ble cellene som hadde migrert gjennom porene farget med krystallfiolett og observert under mikroskop (Zeiss, Oberkochen, Tyskland) ved anvendelse av et 20X objektiv.
Western blot-analyse
AGS-celler (1×10
5) ble sådd i 6-brønns plater og dyrket i F-12 i 24 timer før transfeksjon. 72 timer etter transfeksjon ble cellene vasket med kald PBS og underkastet en lyseringsbuffer (35 mM Tris-Cl [pH 6,8], 20 g /l natrium-dodecyl-sulfat [SDS], 100 mM ditiotreitol). Protein Lysatene (20 ug hver) ble separert ved anvendelse av 8% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese, og deretter elektro-overført på nitrocellulose filtermembraner. Membranene ble blokkert med en buffer som inneholdt 5% fettfri melk i PBS med 0,05% Tween-20 i 2 timer og inkubert over natten med antistoff ved 4 ° C. Etter en andre vasking med PBS inneholdende 0,05% Tween-20, ble membranene inkubert med peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Millipore, Darmstadt, Tyskland) og utviklet seg med en forbedret kjemiluminescens deteksjon kit (Pierce, Rockford, IL). GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. Antistoffer for CDK4, p-Rb, ERK, Akt, p-ERK, p-Akt, c-Met og GAPDH var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA).
siRNA analyser
c-Met-spesifikke siRNA (Ambion) og negativ kontroll siRNA (Ambion) ble brukt til å nedregulere c-Met ekspresjon i AGS-celler. 50 nM av c-Met-spesifikk siRNA eller negativ kontroll siRNA ble transfektert inn i celler med AGS Lipofectamine RNAiMAX. MTS-analysen ble utført 72 timer etter transfeksjon, mens Transwell og matrigel analyser ble utført 24 timer etter transfeksjon, som beskrevet ovenfor.
In vivo
tumorvekstanalyse
pre-mikroRNA uttrykk konstruerer lenti-MIR-206 og pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP kontroll vektor ble kjøpt fra System biovitenskap (Mountain View, California). AGS celler ble infisert med lentivirus uttrykker Mir-206 eller negativ kontroll. Kvinne nakne mus, 6 ukers alder, ble inokulert med AGS celler (8×10
6) uttrykker Mir-206 eller negative kontroller i flankene, og deretter avlivet etter 8 uker. Tumorstørrelse ble målt og volum ble beregnet ved hjelp av formelen: (
L
x
W
2) x 0,5, (
L
, lengde;
W
, bredde), i henhold til den fremgangsmåte som tidligere er rapportert [21]. Alle studier og prosedyrene ble godkjent av Wenzhou Medical University Animal Care og bruk komité.
Statistisk analyse
Alle data ble vist som gjennomsnitt ± SEM. Resultatene som vises, er uttrykt som middelverdi ± SEM av resultatene oppnådd fra triplikater i ett eksperiment. Resultatene representerer de som ble oppnådd i tre separate eksperimenter. Forskjeller mellom forsøksgruppene og kontrollgruppene ble analysert ved hjelp av Student
t
-test. Statistisk signifikans ble akseptert på
P
0,05.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. FACS analyse av AGS celler transfektert med MIR-206.
AGS celler ble samlet inn 48 timer etter transfeksjon med MIR-206 eller NC, farget med propidiumjodid, og analysert ved flowcytometri. Ti tusen celler ble evaluert i hver prøve. De mest representative resultater i tre uavhengige eksperimenter er avbildet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s001 plakater (TIF)
S2 Fig. Kolonidannelsesbestemmelsen.
AGS-celler transfektert med MIR-206 eller NC ble sådd ut ved lav tetthet. Etter 7 dager ble kolonidannelse bestemt ved farging med krystallfiolett. Typiske resultater i tre uavhengige eksperimenter er vist
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s002 plakater (TIF)
S3 Fig. Virkningene av MIR-206 på AGS celler ble vurdert med Transwell og Matrigel analyser.
Antall celler som hadde migrert gjennom kulturinnsats porene (opp) eller hadde invadert gjennom Matrigel innsats porene (ned) ble fotografert ved hjelp av en 20X mikroskop objektiv
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s003 plakater (TIF)
S4 fig. . Nedregulering av c-Met av siRNA
Western blot analyse ble utført for å bekrefte undertrykkelse av c-Met uttrykk etter lipofektamin transfeksjon av AGS celler med enten c-Met siRNA eller en negativ kontroll (NC)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s004 product: (TIF)
S5 fig. Virkningene av c-Met siRNA på AGS celler ble vurdert med Transwell og Matrigel analyser.
Antall celler som hadde migrert gjennom kulturinnsats porene (opp) eller hadde invadert gjennom Matrigel innsats porene (ned) ble fotografert ved hjelp en 20X mikroskop objektiv
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s005 plakater (TIF)
