Abstract
Blant de mange identifiserte androgen-regulert gener, sGCα1 (løselig guanylylcyklase α1) ser ut til å spille en sentral rolle som formidler de pro-kreft effekt av androgener og androgen reseptor. Den klassiske rolle for sGCα1 er å heterodimerize med sGCβ1 subenheten, danner SGC, det enzym som medierer nitrogenoksid signalering ved å katalysere syntesen av syklisk guanosinmonofosfat. Vår publiserte data viser at sGCα1 kan drive prostatacancer celleproliferasjon uavhengig av hormon og gir kreftcellene en pro-overlevelse funksjon, via en ny mekanisme for p53-hemming, som begge er uavhengige av sGCβ1, NO, og cGMP. Alle disse egenskapene gjør sGCα1 en viktig roman mål for prostatakreft behandling. Således peptider ble konstruert målretting sGCα1 med sikte på å forstyrre denne protein pro-canceraktiviteter. En peptid (A-8R) ble bestemt å være sterkt cytotoksisk til prostata kreftceller, og vil raskt å indusere apoptose. Cytotoksisitet ble observert i både hormonavhengig og signifikant, hormon-ildfaste prostatakreftceller, åpne mulighet for at dette peptid kan anvendes for å behandle den normalt letal kastrering resistent prostatakreft. I mus xenograft studier, Peptid A-8R var i stand til å stoppe veksten av tumor ikke bare hormonavhengige celler, men viktigst fra hormonuavhengige celler. I tillegg har mekanismen av peptid A cytotoksisitet er generering av reaktive oksygenforbindelser, som nylig har blitt anerkjent som en viktig virkningsmåte av viktige kreftlegemidler. Dermed gir dette papiret sterke bevis for at målretting en viktig AR-regulert gen er et nytt paradigme for effektiv prostatakreft behandling
Citation. Gao S, Hsieh CL, Bhansali M, Kannan A, Shemshedini L (2013) En Peptide mot Løselig guanylylcyklase α1: En ny tilnærming til behandling av prostatakreft. PLoS ONE 8 (5): e64189. doi: 10,1371 /journal.pone.0064189
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 18 januar 2013; Akseptert: 13. april 2013, Publisert: May 27, 2013
Copyright: © 2013 Gao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Et viktig mål vev av androgener og androgen reseptor (AR) er prostata. Som utvikling av normal prostata, veksten og utviklingen av prostatakreft er også avhengig av androgener og AR [1]. I både normal prostata utvikling og prostata karsinogenese, androgener og AR er viktige i regulering av proliferasjon og overlevelse av prostata-celler [2]. Androgen ablasjon ved kastrering hos rotter fører til redusert spredning og økt apoptose av prostata luminal epitelceller, noe som resulterer i regresjon av prostatakjertelen. Når fysiologiske nivåer av androgener er erstattet i en kastrerte rotter, er prostata epitelcelleproliferasjon økt og apoptose er redusert, noe som fører til omdanning av en normal prostata [3]. Nylig ble det vist at mutasjon av AR er tilstrekkelig for å forårsake prostatakreft utvikling og progresjon [4], og at overekspresjon av AR omdanner prostata kreft vekst fra androgen-avhengige til androgen-uavhengig [5]. Alle dataene akkumulert hittil tyder sterkt på at androgener, gjennom aktiviteten av AR, regulere frekvensen av cellulær proliferasjon, mens inhibering av graden av celledød i prostata [6]. Dysregulering av denne balansen mellom celleproliferasjon og celledød er utvilsomt kritisk for utvikling av prostatacancer
Vi har tidligere vist at en viktig formidler av prostatacancer celleproliferasjon er oppløselig guanylylcyklase α1 (sGCα1;.-Genet navn
GUCY1A3
) [7]. sGCα1 ble opprinnelig identifisert som en komponent i SGC, et heterodimerisk enzym, som består av sGCα1 og sGCβ1 underenheter, som formidler biologiske funksjoner av nitrogenoksid (NO) [8]. I dette fysiologisk viktige og allestedsnærværende signalveien, NO binder seg til og aktiverer SGC, som fører til dannelsen av den sekundære budbringer cGMP (3 «, 5»-cyklisk guanosinmonofosfat), som så aktiverer en rekke nedstrøms mål, også proteinkinase G [9]. Vår lab nylig identifisert sGCα1 som en roman AR-regulert gen [7]. Vi har vist at sGCα1 promoteren er et mål for AR regulering og resulterer i en vesentlig høyere proteinnivåer sGCα1 enn sGCβ1 i LNCaP-celler [7]. sGCα1 er vesentlig for vekst av både androgen-avhengige og androgen-uavhengig prostatacancerceller. Viktigere, er denne effekten uavhengig av sGCβ1, NO, og cGMP, og dermed SGC enzymaktivitet [7]. I tillegg er sGCα1 uttrykk knapt påvisbar i normale vev prostata og er markert forhøyet i prostata kreftvev, med ekspresjonsnivåer øker med økende stadium av sykdommen, og de høyeste nivåene observert i hormon ildfaste prostatakreft [7]. Nå nylig, vår lab rapportert at sGCα1 kan blokkere aktiviteten til p53 og dermed øke overlevelsen av prostatakreftceller [10].
Alle de pro-kreft funksjonene sGCα1 tyder på at dette proteinet kan være en god målrette for prostatakreft behandling. For å løse dette, brukte vi våre tidligere data som viser at sGCβ1 og SGC enzymaktiviteten ikke var involvert i sGCα1 pro-kreft funksjoner og dermed en hypotese om at sGCβ1 dimerization med sGCα1 kan forstyrre sine pro-spredning og pro-overlevelse funksjoner. Dette førte oss til å vurdere et peptid basert tilnærming for å forstyrre sGCα1 pro-kreft funksjoner, designe peptider som etterlignet sGCβ1 heterodimerisering domener. Vi antok at slike peptider ville være i stand til å binde spesifikt til sGCα1 og forstyrre dens funksjoner. Blant de fire peptidene anvendt, to av dem oppviste cytotoksisk aktivitet overfor prostata kreftceller. Ett peptid, kalt A-8R, viste den sterkeste aktivitet og således ble valgt for videre studier. Peptid A-8R var ikke bare cytotoksisk for dyrkede celler, men også hadde sterk anti-kreft-aktivitet mot kastreringsbestandig prostata-tumorer i mus xenograft studier. Videre våre data viser at peptid A-8R dreper kreftceller ved generering av reaktive oksygenarter (ROS) og induksjon av DNA-skade. Våre funn her identifisere en ny peptid som kan arrestere veksten av kastrering resistent prostatakreft (CRPC).
Materialer og metoder
Cell Kultur og siRNA Transfeksjon
LNCaP, C81, PC-3 og COS-celler ble dyrket som tidligere beskrevet [7]. CWR-22Rv1-celler ble dyrket i RMPI-1640 medium med 10% FBS og 50 ug /ml gentamicin (Gibco). Kontroll siRNA, sGCα1 siRNA og AKT siRNA (Dharmacon) på 50 nM endelig konsentrasjon ble transfektert inn i cellene ved hjelp Lipofectamine Simax (Invitrogen).
Generering av stabile cellelinjer
Generering av stabile cellelinjer ble tidligere beskrevet [11]. LNCaP-celler ble transfektert med 2 pg hver av pCI-Neo-vektor (negativ kontroll fra Promega), sGCα1 /pCI-Neo ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen), og som er valgt i RPMI 1640 komplett medium inneholdende 0,9 mg /ml neomycin (Sigma). Koloniene ble valgt ved å oppdage sGCα1 mRNA og proteinnivåer ved hjelp av PCR og Western blotting.
Peptide Synthesis
Alle peptider brukt i denne studien ble syntetisert ved ChiScientific, på ≥95% renhet, og var oppløst i 70% DMSO (ACROS Organic).
adenovirus Infection
C81-celler ble infisert med 5-50 MOI på enten en adenovirus som uttrykker Akt (SignaGen) eller en tom adenovirus som en kontroll. Etter 48 timer ble cellene underkastet behandling peptid, etterfulgt av Western blotting eller proliferasjonsanalyse.
proliferasjon og apoptose Assays
For proliferasjon, ble celler dyrket i medium inneholdende 2% FBS ekstrahert med dekstran-belagt trekull (DCC). 48 timer senere ble etanol eller 1 nM R1881 tilsatt til cellene, etterfulgt av peptid behandling. MTT-assayet (Sigma) ble anvendt som før [11] for å bestemme celleantallet. For apoptose, ble 5000-celler sådd i 96-brønners plater og behandlet med Vehicle (DMSO), Peptide A-8R (25 uM), Etoposid (50 pM) (Sigma) ved forskjellige tidspunkter. Caspase (3/7) aktivitet ble målt ved anvendelse av Apo-ONE Homogen Caspase-3/7 assay kit (Promega). PARP cleavage ble også brukt til å måle apoptose, og er beskrevet nedenfor.
Western blotting
Western blotting ble utført som beskrevet [7] med primære antistoffer mot sGCα1 (Cayman Chemical), pan-Akt (Cell Signaling Technology), fosfor-AKT (S473, T308) (Cell Signaling Technology), fosfor-PDK1 (Cell Signaling Technology), fosfor-GSK-3β (Cell Signaling Technology), PARP (Cell Signaling Technology), og β- Actin (Abcam).
Immunocytochemistry
Immunocytochemistry ble brukt til å studere den subcellulære lokalisering av sGCα1 og Biotin-merket peptid-8R i LNCaP celler. FITC-merket anti-sGCα1 antistoff (1:100 fortynning, Santa Cruz Biotechnology), anti-Biotin antistoff, ble (1:200 Santa Cruz Biotechnology) brukes for immunocytochemisty som beskrevet [12]
Immunpresipitasjon, Biotin. nedtrekk, og bindingsaffiniteten
Immunoutfelling (IP) i LNCaP-celler ble utført som beskrevet tidligere [10]. Hel-celle ekstrakter fra LNCaP cellene ble utsatt til IP ved hjelp av protein A /G pluss Agarose (Santa Cruz). IP-antistoff var mot sGCα1 (Cayman Chemical), sGCβ1 (Cayman Chemical) eller kanin IgG (Santa Cruz) som kontroll. For Biotin nedtrekk, ble 5 ug biotin-merket peptid A inkuberes med NeutrAvidin Agarose Resin (Thermo Scientific) i 3 timer ved 4 ° C, hvoretter hel-celleekstrakt fra LNCaP-celler ble tilsatt og inkubert over natten ved 4 ° C. Harpiksen ble vasket og eluert med SDS-prøvebuffer, etterfulgt av SDS-PAGE-gel-elektroforese. For konkurranseanalyse, ble det samme forsøk gjentas med følgende endring: LNCaP-celleekstrakt ble delt i 3 like deler, og hver del mottar 5 ug peptid A-8R-Biotin og kjøretøy, 150 ug peptid C-8R, eller 150 ug peptid A-8R.
for bindingsaffinitet forsøk ble hel-celleekstrakt fra C81-celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av peptid A-8R merket med FITC ved romtemperatur i 2 timer. IP-er ble utført ved anvendelse av antistoffer mot sGCα1 eller kanin IgG som kontroll. Peptid A-8R-FITC nedtrekk ble målt ved fluorescens signal ved eksitasjon og emisjonsbølgelengder av 485 og 521 nm, henholdsvis ved hjelp av en multi-brønn fluorescens plateleser.
ROS Måling og redde
intracellulær ROS nivåer ble evaluert ved bruk av det fluorescerende probe 5- (og 6-) -chloromethyl-2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetat (CM-H
2DCFDA) (Invitrogen). Etter behandling med peptid A-8R, ble C81-celler lastet med 20 uM CM-H
2DCFDA og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter i mørket. Cellene ble deretter vasket med PBS og fluorescensen ble målt ved eksitasjons- og emisjonsbølgelengder på 490 og 535 nm, henholdsvis, ved hjelp av en multi-brønn fluorescens plateleser. For NAC (N-acetyl cystein) (Sigma) redning eksperiment ble celler forbehandlet med 1 eller 5 mM NAC i 2 timer før du legger Peptide A-8R.
Comet Assay
C81 cellene behandlet med peptid A-8R i 1 time, etter en 2-timers forbehandling med 5 mM NAC eller kjøretøy, og trypsinert, og blandet med Comet LM-Agarose (CometAssay, TREVIGEN) og overført til slides. Elektroforese og SYBR-grønne flekker ble utført i henhold til produsentens protokoll.
Mus xenograft tumor Studier
2 × 10
6 C81 celler i 50 mL av vekstmedium ble blandet med 50 pl Matrigel (BD Biosciences) og injiseres i begge flankene av 4-6 uker gamle SCID hannmus. Når tumorstørrelser nådde 200 mm
3, 50 mL av peptid A-8R (40 mg peptid A-8R /kg dyr) eller bærer (DMSO) ble injisert direkte inn i tumorer annenhver dag. Injeksjoner ble stoppet etter 5 ganger og svulster ble målt hver 3. dag. Mus ble avlivet etter 3 uker og tumorer ble skåret ut. Alle prosedyrer ble godkjent av University of Toledo Division of Lab Animal resurser (DLAR). Protein ekstrakter ble utarbeidet av kokende svulstvev i 3 × SDS buffer, og evaluert av SDS-PAGE gel.
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av laboratorie dyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Toledo (Protocol Nummer: 106418). I løpet av forsøkene alle dyrene ble overvåket daglig for sykelighet og alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse. På slutten av studien alle dyrene ble avlivet ved hjelp av inhalering av karbondioksid, hvoretter operasjonen ble utført for å avgifter svulster fra alle dyr.
Resultater
Peptider Målrette sGCα1 er cytotoksiske til prostata kreft celler
Våre data viser at sGCα1 er nødvendig for overlevelsen [10] og proliferasjon [7] fra prostatakreftceller tyder på at dette protein kan være et godt mål for prostatacancerterapi. For å begynne å ta opp denne mulighet, brukte vi disse tidligere data som viser at sGCα1 pro-cancerfunksjonene er uavhengig av NO signalering og sGCβ1 [7], [10], og som sGCβ1 kan avlaste sGCα1-mediert represjon av p53 transkripsjonen aktivitet [10], som tyder på at sGCβ1 dimerization med sGCα1 kan forstyrre sGCα1 pro-kreft funksjoner. Dette førte oss til å vurdere et peptid basert tilnærming for å forstyrre sGCα1 funksjoner, ved hjelp av peptider som etterligner de fire kjente sGCβ1 heterodimerisering domener [13]. Disse peptidene, kalt peptid A, B, C og D, varierte i lengde fra 11 til 19 aminosyrer. Hvert peptid inneholdt 8 arginines ved karboksyterminalen (fig. 1A), en sekvens som er kjent for å formidle plasmamembranen translokasjon og cellulær internalisering [14]. Peptidene ble testet for aktivitet på LNCaP-celler, en cellelinje som uttrykker både AR og sGCα1 [7]. Som vist på fig. 1B, Peptid A-8R hadde en sterk, doseavhengig, cytotoksisk aktivitet, og dreper nesten alle celler ved dag 4. Peptid B-8R hadde også en negativ virkning ved å undertrykke cellevekst, men ikke å redusere celletallet som Peptid A-8R gjorde ( fig. 1B). På den annen side, Peptides C-8R og D-8R hadde liten virkning (fig. 1B). I lys av sin sterke cytotoksiske aktivitet, ble peptid A-8R valgt for videre studier.
(A) Fire peptider ble konstruert målretting sGCα1, med hvert peptid inneholdende åtte arginines ved C-terminus for membrantranslokasjon. (B) LNCaP-celler ble dyrket i 10% serum under forskjellige konsentrasjoner av de fire peptidene, som vist. Celletallet ble målt etter 0-4 dagers inkubasjon. Datapunkter representerer gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk pluss standardavvik. Stjerner indikerer statistisk signifikans (P 0,0002). Peptid A-aktivitet, i forhold til Vehicle
Peptide en Associates med Endogen sGCα1 i prostata kreft celler
Peptide A-8R er designet for å samhandle med sGCα1, som er blitt bekreftet ved hjelp av tre metoder. Peptid A-8R ble syntetisert med et biotin-kode ved den C-terminale ende, noe som gir peptid A-8R-Biotin. I den første analysen ble LNCaP-celler behandlet med peptid A-8R-Biotin og utsatt for immunocytokjemi ved hjelp av et antistoff mot Biotin å detektere merkede peptid A-8R og en annen mot sGCα1 å påvise dette proteinet (fig. 2A). Som observert tidligere, ble endogen sGCα1 funnet eksklusivt i cytoplasma av LNCaP-celler, som omgir kjernen [7]. Viktigere, Peptide A-8R-Biotin ble også funnet i cytoplasma og colocalizes med sGCα1, som vist ved de fusjonerte bilder. Disse resultater antyder at peptid A-8R-Biotin interagerer med endogent sGCα1, noe som ble bekreftet av en rullegardin eksperiment. I denne andre analyse (Fig. 2B), ble LNCaP hel-celleekstrakt ble inkubert med peptid A-8R-Biotin og underkastet streptavidin-agarose rensing, noe som fører til co-rensning av sGCα1. I kontrast til agarosekuler ikke var i stand til å trekke ned sGCα1 i fravær av peptid A-8R-Biotin. For å måle spesifisiteten av bindingen, ble rullegardin eksperimentet gjentatt under betingelser hvor overskudd av umerket peptid A-8R eller peptid C-8R ble tilsatt til reaksjonen med biotin-merket peptid A-8R. Som vist på fig. 2B, Peptid A-8R inhiberte signifikant Peptid A-8R-biotin interaksjon med sGCα1, mens Peptide C-8R ikke hadde noen virkning, som viser en spesifikk interaksjon av peptid A-8R med sGCα1. Vi benyttet immunoutfelling (IP) av sGCα1 for å bestemme dens bindingsaffinitet for peptid A-8R. Peptid A-8R merket med FITC ble anvendt for å bestemme at peptidet bindingsaffinitet (K
D) for sGCα1 var 11,6 uM (fig. 2C), som faller innenfor den aktive konsentrasjonsområde for peptid A-8R-mediert cytotoksisitet . Sammen er disse resultatene bekrefter en bestemt fysisk sammenheng mellom Peptide A-8R og sGCα1. Fig. 2D viser at tilsetning av en Biotin tag til peptid A-8R ikke påvirker dets cytotoksiske effekt.
(A) LNCaP-celler ble behandlet med 25 uM biotin-merket peptid A-8R i 2 timer og underkastet immunocytokjemi ved hjelp av anti-sGCα1 eller anti-biotin-antistoff for å måle subcellulære ko-lokalisering av endogent sGCα1 og peptid A-8R. DAPI ble anvendt for å farge kjerner. (B) LNCaP cytosoliske ekstraktene ble inkubert med peptid A-8R-Biotin og underkastet rensing ved hjelp av streptavidin-agarose. Denne rullegardin Eksperimentet ble gjentatt med konkurrerende overskudd av umerket peptid C-peptid eller 8R A-8R. I begge tilfeller Western blotting ble brukt til å måle den ko-rensning av sGCα1. (C) LNCaP-celleekstrakt ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av peptid A-8R-FITC og endogene sGCα1 ble immunoutfelt. Co-renset peptid A-8R-FITC ble kvantifisert ved å måle fluorescens-signal utslipp. Ikke-lineær regresjonsanalyse ble benyttet for å bestemme en affinitet for peptid A-8R binding til sGCα1. (D) LNCaP-celler ble dyrket i 10% serum under forskjellige konsentrasjoner av peptid A-8R eller A-8R-Biotin, som vist. Celletallet ble målt etter 0-48 timer inkubasjon. Datapunkter representerer gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk pluss standardavvik. Stjerner indikerer statistisk signifikans (P 0,02). Peptid A-aktivitet, i forhold til Vehicle
Peptide A påvirker ikke SGC enzymaktivitet
Siden Peptide A er designet for å etterligne en sGCβ1 heterodimerisering domene, er det mulig at dette peptid kan påvirke sGCα1-sGCβ1 heterodimerisering og således enzymaktivitet. For å møte den første muligheten, vi målt direkte interaksjonen mellom sGCα1 med sGCβ1 av IP ved hjelp av antistoffer mot sGCα1 og sGCβ1. Peptid A-8R hadde ingen effekt på enten sGCα1 co-IP med sGCβ1 eller sGCβ1 co-IP med sGCα1 (fig. S1 A), som klart peptid A ikke forstyrre sGCα1-sGCβ1 heterodimerisering. Bekreftelse for dette ble oppnådd fra en ELISA-forsøk som måler cGMP syntese. Som vist på fig. S1B, R1881 behandling markert forhøyet cGMP-nivåer, i tråd med våre tidligere publiserte data viser androgen induksjon av sGCα1 uttrykk og cGMP syntese [7]. Viktigere, Peptid A-8R var ikke i stand til i betydelig grad undertrykke cGMP-nivåer, enten i fravær eller nærvær av androgen (fig. S1B). Disse dataene samlet viser at Peptide A ikke forstyrre SGC enzymaktivitet og dermed tyder på at INGEN signalering ikke er involvert i sin cytotoksisitet. For å direkte teste dette, la vi 8-Br-cGMP til behandlede celler. 8-Br-cGMP hadde ingen effekt på kjøretøy- eller peptid A-8R-behandlede celler, mens det var i stand til delvis rednings celler behandlet med SGC enzyminhibitor ODQ (fig. S1C). En annen tilnærming var å legge til NO sekvestreringsmidlet C-ptio, som forbedret fremfor lettet cytotoksisitet av Peptide A-8R på 10 og 25 mikrometer, men interessant ikke 50 mikrometer (Fig. S1D). Disse dataene samlet viser at Peptide A-8R ikke forstyrrer heller ikke være avhengig av NO signalering.
Peptide A blokkerer veksten av både hormonavhengig og kastrering-resistente prostata kreft celler, men ikke sGCα1-manglende celler
for å finne ut om androgen påvirket cytotoksiske aktiviteten til Peptide A-8R, forsøket i fig. 1B ble gjentatt i nærvær av hormonet. Som fig. 3A viser, Peptide A-8R hadde samme potent cytotoksisk aktivitet med eller uten androgen, slik at alle cellene til å omkomme etter dag 6 ved behandling med 50 mikrometer peptid. Et inaktivt peptid, peptid C-8R, ikke hadde noen signifikant effekt ved samme konsentrasjon (Fig. 3A), som viser at aminosyre-sekvensen av Peptid A ble kreves for den cytotoksiske effekt og uten potensiell cytotoksisitet indusert av 8-arginin-sekvens .
kjøretøy eller forskjellige konsentrasjoner av peptid A-8R eller C-8R, som vist, ble tilsatt til (A) hormonavhengige LNCaP-celler dyrket i 2% serum uten eller med 1 nM R1881, (C) kastrerings-resistente C81 eller CWR-22Rv1 celler, eller (E) sGCα1-manglende PC-3 eller COS-celler. Celletallet ble målt etter forskjellige dagers inkubering. Datapunkter representerer gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk pluss standardavvik. Stjerner indikerer statistisk signifikans (P 0,03) av Peptide En aktivitet, i forhold til kjøretøy. Western blotting ble brukt til å overvåke ekspresjon av endogen sGCα1 i (B) C81 og CWR-22Rv1-celler, behandlet uten eller med 1 nM R1881, eller (e) PC-3 og COS-celler, sammenlignet med LNCaP-celler. Merk at β-aktin ble brukt til å kontrollere for protein lasting.
For å undersøke om membranen trans signal er nødvendig for cytotoksisitet av Peptide A-8R, analyserte vi aktiviteten til Peptide Manglende 8 arginines . Som vist på fig. S2, Peptid A uten arginines hadde liten negativ effekt, i motsetning til den sterke cytotoksiske effekt av peptid A-8R. Disse data antyder sterkt at celleinternalisering er nødvendig for peptidet cytotoksisk effekt.
Vi har tidligere vist at sGCα1 fremmer prostatakreft spredning, og dets ekspresjon økninger i høyere stadium av prostatacancer [7]. Som vist tidligere, er sGCα1 protein ekspresjon oppregulert ved androgen i androgen-avhengige celler, og konstitutiv i androgen-uavhengig C81 og CWR-22Rv1 celler, med CWR-22Rv1 celler uttrykker lavere nivåer enn C81-celler (fig. 3B). Dermed var vi interessert i å studere peptid effekt på disse hormon-refraktær prostata kreft celler. Peptid A-8R var svært effektiv på å undertrykke veksten av C81-celler (fig. 3C), samsvarer med effekt på hormonavhengige LNCaP celler. Peptid A-8R var også effektiv på et annet hormon-refraktær prostatakreft cellelinje, CWR-22Rv1 celler, som er forskjellig fra LNCaP celler (fig. 3C). Viktigere, Disse data viser at hormon ildfaste prostata kreft celler er følsomme overfor den cytotoksiske effekt av peptid A-8R som er hormonavhengige celler, hvilket antyder at dette peptid kan være effektiv mot CRPC, den dødelige formen av sykdommen.
Endogen sGCα1 er uttrykt i LNCaP, C81, og CWR-22Rv1 celler (se fig. 3B), som alle er følsomme for den cytotoksiske effekt av peptid A-8R. Disse data tyder på at peptid effekt krever endogen sGCα1 uttrykk, et forventet funn siden sGCα1 var designet målet for Peptide A-8R. For å få mer bevis for denne hypotesen, ble to kreftcellelinjer studert som ikke uttrykker endogen sGCα1 (Fig. 3D). Peptid A-8R hadde liten eller ingen virkning på PC-3 (prostatakreft) eller cos (musenyrekreft)-celler (fig. 3E). Disse dataene sterkt støtter påstanden om at den cytotoksiske aktiviteten til Peptide A-8R avhenger av endogen sGCα1 protein.
Peptide A Down-regulerer AKT i prostata kreft celler
For å forstå hvordan sGCα1 er formidling av cellen spredning, brukte vi en hemmer av enten MAPK eller PI3K-AKT signalering, to viktige signalveier som regulerer celle overlevelse og spredning. Interessant, PI3K-AKT-inhibitor LY294002 dramatisk undertrykt LNCaP-celleproliferasjon (fig. S3A). Dette førte oss til å utforske muligheten for at sGCα1 kan indusere spredning via denne signalveien. Ved hjelp av stabile LNCaP cellelinjer over-uttrykker sGCα1 (Fig. S3b), som viser forbedret androgen-indusert spredning (Fig. S3C), fant vi ved Western blotting at nivåene av total AKT og fosforylert AKT er sterkt forhøyet i disse LNα1-6 og LNα1-4 celler (fig. S3b); disse cellene uttrykte også høyere nivåer av fosforylert PDK1, en kinase opptrer på AKT, og GSK-3β, et mål om AKT [15]. For å bekrefte at de økte AKT nivåene skyldtes sGCα1 over-uttrykk, ble siRNA brukes til knockdown uttrykk for sGCα1 i LNα1-6 celler, noe som resulterer i betydelig reduserte nivåer av total og fosforylert AKT (Fig. S3D). Viktigere, sGCα1 påvirket ikke nivået av AKT-mRNA (data ikke vist), noe som tyder på at sGCα1 virker på AKT protein, kanskje påvirker dets stabilitet. Interessant, siRNA knockdown av sGCα1 (Fig. S3F) sterkt hemmet veksten av LNCaP celler (Fig. S3E), tydelig viser at endogen sGCα1 gir cellene en overlevelse og pro-vekst funksjon.
I lys av vår data over (se fig. S3b, S3D) tyder på at sGCα1 virker på AKT protein, kan Peptid A-8R binding til sGCα1 forventes å påvirke AKT. Faktisk behandling av LNCaP-celler med peptid A-8R hadde en sterk, tidsavhengig negativ effekt på AKT protein, slik at etter 50 min mesteparten av den målbare AKT er borte (fig. S4A). Som forventet, ble fosforylert AKT påvirket på samme måte (fig. S4A). Den inaktive kontroll peptid C-8R hadde ingen effekt på enten total AKT eller fosforylerte AKT nivåer (Fig. S4A). Interessant nok var det samme negativ effekt på AKT proteinnivåer (Fig. S4B) observert hos mus xenograft tumorer (se nedenfor) som ble behandlet med peptid A-8R, som observert i LNCaP-celler (fig. S4A).
Disse resultatene er i overensstemmelse med hypotesen om at peptid A-8R forstyrrer pro-cancer funksjoner av sGCα1 og tyder på at i det minste en mekanisme av den cytotoksiske virkning er via forstyrrelse av AKT-proteinet. For direkte å teste denne hypotesen, vi overuttrykt AKT ved å bruke en adenovirus-system, noe som resulterte i betydelig forhøyede nivåer av AKT i celler behandlet med 10 og 25 uM av peptid A-8R (fig. S4C). Overraskende, adenovirus-uttrykt AKT var ikke i stand til å redde celler behandlet med 10- 50 mikrometer Peptide A-8R (Fig. S4D), noe som tyder på at AKT nedregulering ikke er involvert i Peptide A-8R-mediert cytotoksisitet.
Peptide en Kills prostata kreftceller ved Generering av ROS
Siden AKT over-uttrykk klarte å redde Peptide A-behandlede celler (se fig. S4D), så vi for en annen mekanisme cytotoksisitet. Interessant nok har nylige data vist at de mest effektive cancer stoffer, inkludert cisplatin og doksorubicin, indusere tumorcelledød ved å heve nivåene av reaktive oksygenarter (ROS) [16], [17]. I lys av den raske cytotoksisiteten indusert av peptid A (data ikke vist), undersøkte vi muligheten for at ROS var involvert. Faktisk, Peptid A-8R behandlingen resulterte i signifikant ROS induksjon i LNCaP-celler i løpet av 30 minutter (Fig. 4a), mens de sGCα1-negative PC-3-celler ikke svarer (fig. S5a). Viktigere, den inaktive peptid, C-8R, ikke klarer å indusere ROS generasjon (Fig. S5b). Som forventet, ROS generering i LNCaP-celler økte når Peptid A-8R-konsentrasjonen ble øket fra 10 til 25 uM, men, overraskende, redusert med 50 uM (fig. 4A). Disse resultatene antyder at ROS-generering kan være ansvarlig for den peptid A-8R cytotoksisitet ved de lavere konsentrasjoner på 10 og 25 uM, men ikke ved 50 uM.
(a) C81-celler ble behandlet med bærer eller forskjellig umolar konsentrasjoner av peptid A-8R, og uten eller med 0-5 mM NAC og overvåkes med hensyn til ROS generasjon etter 0-30 minutter som målt ved hjelp av fluorescens-intensitet (FI). Søylediagrammer representerer gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk pluss standardavvik. Legg merke til at stjernene på søylediagrammer funnet med NAC er sammenlignet med tilsvarende data uten NAC. (B) C81-celler ble behandlet med bærer eller forskjellige konsentrasjoner av peptid A-8R, som vist, og 0-5 mM NAC, som vist, og overvåket for celletallet etter 0-6 dagers inkubasjon som målt ved MTT-analyse. Datapunkter representerer gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk pluss standardavvik. Stjerner indikerer statistisk signifikans (P 0,04). (C) C81-celler ble behandlet med bærer eller forskjellige konsentrasjoner av peptid A-8R, som vist, og med eller uten 5 mM NAC, som vist, og overvåket DNA-skade etter 1 timers inkubasjon, målt ved Comet assay.
For å møte denne muligheten, brukte vi ROS åtseldyr NAC (N-acetyl cystein) [18]. Som vist på fig. 5B, NAC var i stand til fullstendig å redde proliferasjonen av celler behandlet med 10 uM peptid A-8R eller nesten helt med 25 uM. Disse NAC virkning på proliferasjon svarer til de NAC-effekter på Peptid A-8R-mediert ROS generasjon (fig. 4A), noe som tyder sterkt på at ROS generasjon er ansvarlig for peptid A cytotoksisitet. Interessant, NAC mislyktes i å redde betydelig vekst av celler behandlet med 50 uM peptid A-8R (Fig. 4B). Dette funnet, sammen med vår tidligere resultat som viser minimal ROS induksjon med 50 mikrometer Peptide A-8R (se fig. 4A), hevder at denne høye konsentrasjonen av Peptide A-8R dreper celler via mekanismen uavhengig av ROS generasjon.
(A) LNCaP, (B) PC-3, eller (C) Cos-celler ble behandlet med kjøretøy, Peptid A-8R (10 uM), eller Etoposid (20 uM) i 0-24 timer og utsettes for en caspase assay å måle apoptose. Søylediagrammer representerer gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk pluss standardavvik. Alle aktiviteter står i forhold til den første betingelsen, og denne aktiviteten ble satt til 1. Stjernene indikere statistisk signifikans (P 0,005). (D) LNCaP-celler ble behandlet med kjøretøy, peptid C-8R, Peptid A-8R, eller Etoposid (hvert medikament ved 50 uM) i 8 timer og overvåkes for apoptose ved å måle PARP-spaltning ved hjelp av Western blotting. Legg merke til at β-aktin ble benyttet for å kontrollere for protein lasting.
ROS-indusert celledød er forbundet med DNA-skade [19], som induseres svakt ved 10 uM peptid A-8R og mye mer sterkt ved 25 uM, som målt ved hjelp av en komet analyse (figur 4C.); Viktigst er denne induksjons fullstendig blokkert av NAC, hvilket klart viser den peptid-A-8R-indusert DNA-skade krever ROS generasjon. Interessant, 50 uM peptid A-8R, som dreper de fleste av cellene, fremkaller ikke en komet signal (fig. 4C). Som vist på fig. S6, denne konsentrasjonen av peptid dreper cellene og forstyrrer deres kjerner og DNA slik at DAPI flekker gir ingen signal og NAC hadde ingen effekt.
Peptide En induserer apoptose av prostata kreft celler
Forhøyede nivåer Som vist på fig.
