Abstract
Kreft /testikler (CT) antigen familie av gener transcriptionally trykt i de fleste menneskelige vev, men er unormalt gjen uttrykt i mange ondartede krefttyper. Deres begrenset uttrykk profilen gjør CT antigener ideelle mål for kreft immunterapi. Så lite er kjent om hvorvidt CT antigener kan reguleres ved post-translasjonell behandling, undersøkte vi de mekanismene som styrer nedbrytingen av NY-ESO-1 og MAGE-C1 i utvalgte kreftcellelinjer. Hemmere proteasominhiberingens-mediert degradering indusert oppdeling av NY-ESO-1 og MAGE-C1 til et vaskemiddel uløselig fraksjon. Videre denne behandlingen også resultert i økt lokalisering av NY-ESO-1 og MAGE-C1 på sentrosomen. Til tross for deres interaksjon, kan flytting av enten NY-ESO-1 eller MAGE-C1 til sentrosomen forekomme uavhengig av hverandre. Ved hjelp av en serie av trunkerte fragmenter, regioner som tilsvarer NY-ESO-1
91-150 og MAGE-C1
900-1116 ble etablert som viktig for å kontrollere både stabilitet og lokalisering av disse CT antigener. Våre funn viser at stabile nivåer av NY-ESO-1 og MAGE-C1 er regulert av proteasomal fornedrelse og at både oppfører seg som aggregering utsatt proteiner ved akkumulering. Med proteasomhemmere blir stadig mer brukt som front-linje behandling av kreft, disse dataene reiser spørsmål om CT antigen behandling for antigen presentasjon og derfor immunogenisitet hos kreftpasienter
Citation. Pagotto A, Caballero OL, Volkmar N, Devalle S, Simpson AJG, Lu X, et al. (2013) Centrosomal Lokalisering av Kreft /testikler (CT) antigener NY-ESO-1 og MAGE-C1 er regulert av Proteasome aktivitet i Tumor celler. PLoS ONE 8 (12): e83212. doi: 10,1371 /journal.pone.0083212
Redaktør: Hiroshi Shiku, Mie Universitetet Graduate School of Medicine, Japan
mottatt: 08.08.2013; Godkjent: 31 oktober 2013; Publisert: 10.12.2013
Copyright: © 2013 Pagotto et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Ludwig Cancer Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Engasjerende immunsystemet til å gjenkjenne og eliminere svulster /kreftceller forblir et lovende terapeutisk strategi for kreftbehandling. Tilnærmingen i seg selv er avhengig av identifikasjon av molekyl signaturer i stand til effektivt og konsekvent differensiere ondartet befolkningen. Kreft /testikler (CT) antigener er en samling av mer enn 100 gener familier med flere medlemmer og skjøte varianter [1-3] som har blitt identifisert gjennom et bredt spekter av teknikker, inkludert: T-celle epitop kloning [4-7] ; serologisk analyse av cDNA uttrykk bibliotek (Serex) [1], differensial genekspresjonsanalyser [8,9]; og bioinformatikk metoder [10,11]. Deres uttrykk er vanligvis begrenset til kjønnsceller i testikkel [12-15] og noen ganger eggstokk [16] og trophoblasts [17]. Imidlertid, i ulike tumortyper (for eksempel melanom, småcellet lungekreft, sarkom, etc …) atypisk ekspresjon av en eller flere av CT-antigener kan observeres [3,18,19]. De fysiologiske konsekvensene av CT-antigen ekspresjon av progresjon av kreft er ikke fullt ut forstått, men flere CT antigener har vist seg å være modulatorer av ubiquitinering gjennom komplekser dannet med ringtypen ubiquitin-ligaser [20].
CT antigen NY-ESO-1 /CTAG1 /CT6 ble først identifisert av Serex i spiserørs plateepitelkarsinom [1,21]. NY-ESO-1 oppviser en relativt unik arkitektur, med en Pcc-1-domene i C-enden (aa 89-164) homolog til en gjær transkripsjonsfaktor involvert i cellesyklusprogresjon og polarisert vekst [22], idet dens eneste konservert trekk. En definitiv biologiske rolle for NY-ESO-1 forblir ubestemt, men det er blitt vist å interagere spesifikt med et annet CT antigen, MAGE-C1 [23]. MAGE-C1 er en del av den større
MAGE plakater (melanom Antigen Gener) familien, som består av mer enn 50 gener i flere underfamilier (
MAGE-A til -L
). Den dominerende trekk ved disse familiene er det treffende navnet MAGE homologi domene (MHD), en stor sentral region konservert over sine medlemmer [24-26]. Den MHD er til stede i de fleste metazo MAGE proteiner, men spesielt fraværende i
C. elegans
samt encellede eukaryoter. Identifisert av Serex og representerende forskjell analyse (RDA) [8], MAGE-C1 /CT7 er nesten tre ganger større enn noe annet MAGE familiemedlem (1142 aa). Sin utvidede N-terminale ende har liten eller ingen nevneverdig forutsagte domene arkitektur, bortsett fra flere repeterte sekvenser på 14, 16 og 21 aa [8]. MAGE-C1 er vanligvis uttrykt i multippelt myelom (MM) [27], så vel som sarkom, melanom og blærekreft [3,18]. En funksjon for MAGE-C1 har ennå ikke bestemt, men flere studier har knyttet det med apoptose MM [28,29].
Blant CT-genet familier, har minst 19 medlemmer vist seg å utløse humorale og /eller cellulære immunresponser hos kreftpasienter [19,30]. CT antigen proteinene bearbeides til peptider av proteasomet og presentert på celleoverflaten av MHC-molekyler, blir gjenkjent av autologt cytotoksiske T-lymfocytter. Tumor-begrensede ekspresjon og høy immunogenisitet har gjort CT antigener attraktive mål for immunterapeutiske strategier i behandlingen av utvalgte cancere [19,31-36]. NY-ESO-1 anses for å være en av de mest immunogene antigener og CT har vært fokus for undersøkelse for utformingen av terapeutiske vaksiner [37]. I motsetning til andre antigener, er det vanlig å observere samtidig antistoff og T-celle respons på NY-ESO-1, som er i stand til å utløse sterke integrert CD4
+ og CD8
+ T-celle immunrespons [38-40] . Systematisk analyse har identifisert en epitop «hot spot» for T-celle-respons i den sentrale del av den NY-ESO-1-protein mellom aminosyrene 80-110 [41-44].
Mens transkripsjonsregulering av CT antigen uttrykk har fått mye av oppmerksomheten, forstå deres post-translasjonell regulering og biologisk funksjon må også vurderes å avgrense sine roller i kreft. Som attraktive vaksine mål, bestemme cellulære mekanismene som styrer NY-ESO-1 og MAGE-C1 steady-state protein nivåer er viktig, fordi det kan gi innsikt i midler som kunne modulerer deres uttrykk eller behandling for antigen presentasjon og følgelig immunresponsen mot tumorceller som uttrykker disse CT antigener. Her gir vi bevis for at steady-state nivåer, løselighet og lokalisering av CT antigener NY-ESO-1 og MAGE-C1 er regulert av nedbrytning gjennom proteasome. De spesifikke domener av hvert protein som er involvert i regulering av disse fasetter er også identifisert og diskutert.
Resultater
proteasomhemmingen induserer insolubility og centrosomal anrikning av NY-ESO-1
For å avgjøre om degradering via ubiquitin-proteasome system (UPS) kan være involvert i post -translational CT antigen regulering, uttrykket nivåer av NY-ESO-1 og MAGE-C1 ble først bestemt i et panel av kreftcellelinjer. Vi observerte at SK-MEL-37 melanom og H146 småcellet lungekreft (SCLC) cellelinjer som uttrykker høye nivåer av NY-ESO-1 (figur 1A og S1A, henholdsvis). Begge cellelinjer ble deretter behandlet med en proteasominhibitor MG132. Cellelysater ble separert til løselige (SOL) og uoppløselige (Insol) fraksjoner i RIPA lysebuffer, oppsamlet og separert ved SDS-PAGE. Selv om det ikke er kvantitative, Western blots probet for NY-ESO-1 detektert forhøyede nivåer i RIPA-uløselige fraksjoner av begge cellelinjene følgende MG132 behandling sammenlignet med ubehandlet (figur 1B, S1B), noe som reflekterer en nedsatt oppløselighet med tap av proteosomet aktivitet . Med denne endringen i løselighet ble det mistanke om at NY-ESO-en lokalisering har kanskje også blitt endret. I begge SK-MEL-37 og H146-celler, ble NY-ESO-1 observert ved immunofluorescens til å akkumulere ved enkelt puncta følgende MG132 behandling, i tillegg til den overveiende cytoplasmisk lokalisering sett i ubehandlede celler. Minner om sentrosomen, ble NY-ESO-en tilstedeværelse på denne kroppen bekreftet av colocalisation av NY-ESO-en med pericentrin, en godt karakterisert protein som markerer denne strukturen (figur 1C, S1C). Videre ubiquitin puncta, et kjennetegn på aggresome formasjon, ble også observert å colocalise med NY-ESO-1 på denne strukturen (figur 1D). Med noen frekvens, kan sentrosomen-lokaliserte NY-ESO-en selv påvises i ubehandlede H146 celler (figur S1C, topp, 2D), øke muligheten for en bona fide fysiologiske funksjon på denne kroppen under normale forhold. Disse dataene indikerer NY-ESO-en kan lokalisere til sentrosomen og at det krever UPS for effektiv nedbrytning.
A) Påvisning av endogen MAGE-C1 og NY-ESO-1 av western blot (CT7.33 og NY-41 antistoffer, henholdsvis). Cellelysater ble fremstilt fra SK-MEL-37, U2OS og H1299 celler og separert ved SDS-PAGE. β-tubulin fungert som en lasting kontroll. B) Påvisning av NY-ESO-1 fra SK-MEL-37 celler behandlet med DMSO (negativ kontroll) og MG132 (40μM, 4t). Like mengder RIPA løselige (SOL) og -insoluble (Insol) materiale (20 ug) ble oppdaget. C) immunfluorescens mikrografer av endogen NY-ESO-1 (grønn) og pericentrin (rød) i SK-MEL-37-celler er vist, sammen med deres sammenslåtte bilder. D) immunfluorescens mikrografer av endogen NY-ESO-1 (grønn) og ubiquitin (rød) i SK-MEL-37-celler er vist, sammen med deres sammenslåtte bilder. Hvite piler indikerer centrosomes og skala barer = 20 pm.
NY-ESO-1 og MAGE-C1 colocalise på sentrosomen på proteasomhemmingen
NY-ESO-1 er ofte co-uttrykkes med MAGE-C1 i kreftceller der de er i stand til å samhandle. For å avgjøre om endringer i NY-ESO-1 løselighet og subcellulære lokalisering indusert av MG132 behandling også påvirket MAGE-C1, SK-MEL-37 celler som endogent uttrykker både MAGE-C1 og NY-ESO-1 (figur 1A) ble behandlet med MG132. Som NY-ESO-1, inhiberer proteasomet aktivitet markert forhøyet MAGE-C1 proteinnivåer i RIPA-uoppløselige fraksjon, med meget liten endring observert i RIPA-løselige fraksjon (figur 2A). Colocalisation med pericentrin vist at, som NY-ESO-1, MAGE-C1 akkumulerer på centrosomes når proteasome aktivitet er kompromittert (figur 2B) og colocalisation av MAGE-C1 og NY-ESO-1 i lignende puncta støtter deres samtidige tilstedeværelse der (figur 2C). Colocalisation med pericentrin økt betydelig i SK-MEL-37 celler behandlet med MG132, og nådde i overkant av 75% for både MAGE-C1 (p = 0,00222, 2-tailed t-test) og NY-ESO-1 (p = 0,00013) ( Figur 2D) og indikerer en robust svar på proteasomhemmingen. NY-ESO-1 colocalisation med ubiquitin puncta viste en markant forskjell i SK-MEL-37 celler (p = 0,01139), men ikke H146s, som viste mindre konsistent dannelse (figur 2E). SK-MEL-37 celler behandlet med enten epoxomicin, en mer selektiv proteasominhibitor (figur S2A), eller redusert MG132 konsentrasjoner (figur S2B) ga sammenlignbare resultater. Opphopning av enten MAGE-C1 eller NY-ESO-1 på puncta og i RIPA-uløselige fraksjoner var reversibel, reflekteres av en retur til spredt lokalisering og løselighet vaskemiddel følgende MG132 utvasking (figur S2C, S2D). Sammen indikerer disse data at både NY-ESO-1, og MAGE-C1 transient akkumuleres ved centrosomes i respons til en nedsatt nedbrytning svei.
A) Western blot av MAGE-C1 fra lysater av SK-MEL-37 celler behandlet med DMSO (negativ kontroll) og MG132 (40μM, 4t). RIPA-løselig (SOL) og -insoluble (Insol) fraksjoner vises. B) immunfluorescens mikrografer av endogen MAGE-C1 (grønn) og pericentrin (rød) i SK-MEL-37-celler. Sammenslåtte bilder er også vist. Skala barer = 20 pm C) immunfluorescens mikrografer av endogen MAGE-C1 (grønn) og NY-ESO-1 (rød) i SK-MEL-37-celler. Skala barer = 10 nm. I alle bildene, hvite piler indikerer centrosomes. D) Bar grafer presentere andelen NY-ESO-1 og MAGE-C1 puncta colocalised med pericentrin for SK-MEL-37 (MAGE-C1 /pericentrin – DMSO: 0,42 ± 0,72 og MG132: 76,94 ± 6,61, p = 0,00222; NY-ESO-1 /pericentrin – DMSO: 5,77 ± 3,74 og MG132: 75,77 ± 1,73, p = 0,00013), U2OS (MAGE-C1 /pericentrin – DMSO: 2,75 ± 1,74 og MG132: 69,28 ± 6,79, p = 0,00212), HC33 (NY-ESO-1 /pericentrin – DMSO: 21,32 ± 2,39 og MG132: 70.23 ± 6.86, p = 0,00312) og H146 (NY-ESO-1 /pericentrin – DMSO: 57,86 ± 18,53 og MG132: 80,95 ± 1,80, p = 0.16289) celler. Selv H146 celler uttrykker MAGE-C1, ble det ikke tatt med i denne analysen. E) Bar grafer presentere andelen colocalised NY-ESO-1 og ubiquitin puncta for SK-MEL-37 (DMSO: 0,65 ± 1,12 og MG132: 30,81 ± 6,09, p = 0,01139), HC33 (DMSO: 4,09 ± 2,52 og MG132 : 23,06 ± 6,70, p = 0,02739) og H146 (DMSO: 2,14 ± 1,43 og MG132: 20.00 ± 18.03, p = 0,22733) celler. Gjennomsnitt, standardavvik og betydning blir vist.
Uavhengig lokalisering av CT-antigener på sentrosomen
Siden NY-ESO-1 og MAGE-C1 kan danne komplekser, neste testet vi om samspillet var nødvendig for å gi partisjonering til en RIPA-uløselig fraksjon eller lokalisering på sentrosomen på proteasomhemmingen. U2OS osteosarkom celler uttrykker MAGE-C1, men ikke NY-ESO-1, mens HC33 SCLC celler uttrykker NY-ESO-1, men ikke MAGE-C1 (figur 1A, S1 A). Ved behandling med MG132, ble hver CT antigen som observeres for uavhengig å hope seg opp i RIPA-uoppløselige fraksjoner (figur 3A, 3C), og lokalisere til centrosomes (figur 3B, 3D). Disse dataene ble støttet av siRNA-mediert genet Slå av enten antigen i SK-MEL-37 celler, som viste at uttømming av NY-ESO-1 påvirket ikke centrosomal lokalisering av MAGE-C1 (Figur S3, til venstre) og vice versa ( Figur S3, til høyre). Både MAGE-C1 og NY-ESO-1 dannet puncta at colocalised med pericentrin i U2OS (p = 0,00212) og HC33 (p = 0,00312) celler, henholdsvis, med nivåer nær 70% og betydelig større enn DMSO-behandlede celler (figur 2D ). I likhet med de H146s, ble høyere basale nivåer av NY-ESO-1 puncta også observert i HC33 cellelinje. Til sammen indikerer disse data at NY-ESO-1, og MAGE-C1 kan akkumulere og lokalisere til den sentrosomen uavhengig av hverandre i tider med nedsatt aktivitet proteasomet.
A) Påvisning av endogen NY-ESO-1 av western blot fra HC33 SCLC celler behandlet med DMSO og MG132 (40μM, 4t). RIPA-løselig (SOL) og -insoluble (Insol) fraksjoner vises. B) immunfluorescens mikrografer av endogen NY-ESO-1 (grønn) og pericentrin (rød) i HC33 celler behandlet med DMSO og MG132, som i figur 1C C) Påvisning av endogen MAGE-C1 fra U2OS osteosarcom-celler under de samme betingelser som i Figur 2A. D) immunfluorescens mikrografer av endogen MAGE-C1 (grønn) og pericentrin (rød) i U2OS celler behandlet med DMSO og MG132, som i figur 2B. Hvite piler indikerer centrosomes. Skala barer = 20 pm.
NY-ESO-1
91-150 bidrar til stabiliteten
Vi har vist at NY-ESO-1 er et substrat for proteasome men som regioner påvirker dens nedbrytning er ikke kjent. For å identifisere hvilke domener som er ansvarlige for partisjonering i RIPA-uløselige fraksjoner og sentrosomen lokalisering, bygget vi fragmenter av NY-ESO-1 (NY-ESO-1
1-90, NY-ESO-1
91-180 og NY-ESO-1
50-150, figur 4A) og uttrykt dem individuelt sammen med full-lengde form (NY-ESO-1
FL) i mus avledet NIH3T3-celler, som uttrykker verken MAGE-C1 heller NY-ESO-1. Etter den MG132 behandling og oppløseliggjøring regime beskrevet ovenfor ble det relative uttrykk og subcellulær lokalisering analysert ved western blot og immunfluorescens, respektivt. Begge RIPA-løselig og -insoluble fraksjoner av NY-ESO-1
FL, NY-ESO-1
91-180 og NY-ESO-1
50-150 ble stabilisert av MG132, mens NY- ESO-1
1-90 akkumuleres bare i RIPA-løselige fraksjonen (figur 4B). Merket opphopning av NY-ESO-1
91-180 fragment med MG132 impliserer UPS i fragment raske omsetning og foreslår NY-ESO-1 stabilitet er avledet fra en region utenfor PCC1 domene. NY-ESO-1
1-90 fragment dukket konsentrert i kjernen, mens NY-ESO-1
91-180 og NY-ESO-1
50-150 lokalisert til både kjernekraft og cytoplasma regioner uansett om endogen NY-ESO-1, og MAGE-C1 var til stede (SK-MEL-37, figur 4C) eller ikke (NIH3T3, fig S4). Subcellulære lokalisering av enten NY-ESO-1 trunkeringer uttrykt i NIH3T3s (figur S4) eller NY-ESO-1
1-90 i SK-MEL-37s (figur 4C) ble ikke merkbart endret av MG132. Likevel som endogen NY-ESO-en, både NY-ESO-1
91-180 og NY-ESO-1
50-150 akkumulert på centrosomes i SK-MEL-37 celler (Figur 4C). Sammen utgjør disse dataene markere den regionen mellom aa 91-150 som innflytelsesrik i NY-ESO-1 stabilitet og lokalisering på sentrosomen.
A) Skjematisk fremstilling av V5 /His6 epitop tagget full lengde og trunkeringstegn konstruksjoner av NY-ESO-1. NY-ESO-1
1-90, NY-ESO-1
91-180 og NY-ESO-1
50-150 vises, sammen med konservert PCC1 domene. B) Påvisning av NY-ESO-1 konstruerer forbigående uttrykt i NIH3T3 celler ved western blot med anti-V5 og anti-β-tubulin (lasting kontroll). Celler ble behandlet med MG132 og fraksjoner oppsamlet som i figur 1B. C) immunfluorescens mikrografer av SK-MEL-37 celler (± MG132) forbigående uttrykker NY-ESO-1 fragmenter (anti-V5, grønn) og pericentrin (rød), med kjerner identifisert ved DAPI farging (blå). Hvite piler indikerer centrosomes. Skala barer = 20 pm.
Den MHD bidrar til MAGE-C1 stabilitet
Som NY-ESO-1, de aspektene som påvirker MAGE-C1 steady state nivåer ikke er godt karakterisert. For å bestemme region /s fra MAGE-C1 påvirke sin stabilitet, genererte vi en rekke fragmenter inkludert: MAGE-C1
1-138, MAGE-C1
600-901, MAGE-C1
902- 1029 og MAGE-C1
1030-1142 (figur 5A). Vi var i stand til å konstruere fragmenter som strekker seg over hele lengden av MAGE-C1, som det høye antallet GC-rik gjentar mellom aminosyrene 139 og 600 det umulig forsterkning av dette område. Når transient transfektert inn i både NIH3T3 (figur 5B) og H1299 celler (figur S5), MAGE-C1
1-138 og MAGE-C1
600-901 vises høyere steady-state nivåer av hovedsakelig enkle bånd, sammenlignet med andre trunkeringer. Videre har hver syntes å migrere ved en molekylvekt som var høyere enn ventet. Dette kan representere dannelsen av MAGE-C1 oligomerer eller kunne reflektere retardert migrasjon på grunn av polypeptid sammensetning. I kontrast, utstilt både C-terminale fragmenter (MAGE-C1
902-1029 og MAGE-C1
1030-1142) redusert RIPA-løselige likevektsnivåer der to forskjellige band ble oppdaget. De høyere enn forventet band kan gjenspeile en post-translasjonell modifikasjon (f.eks ubiquitinering) eller potensielt en oligomer arter. Fragmenter som inneholder deler av MHD (MAGE-C1
902-1029, MAGE-C1
1030-1142) akkumulert i både RIPA-løselig og -insoluble fraksjoner med tillegg av MG132. Omvendt, MAGE-C1
600-901 ble bare beskjedent stabilisert med MG132 mens det N-terminale fragment (MAGE-C1
1-138) viste seg å være stort sett upåvirket (figur 5B). I NIH3T3 celler, MAGE-C1
1-138 og MAGE-C1
600-901 dukket opp i både kjernen og cytoplasma, mens MHD-holdige fragmenter (MAGE-C1
902-1029 og MAGE- C1
1030-1142) ble helt utelukket fra kjernen (figur 5C). Lokalisering av MAGE-C1 fragmenter i NIH3T3 celler ble ikke merkbart endret ved MG132 behandling. For å avgjøre om MHD alene var tilstrekkelig for MAGE-C1 partisjonering og lokalisering, isolert domene (MAGE-C1
900-1116) ble uttrykt i H1299 celler, en human lungekarsinom cellelinje som uttrykker NY-ESO-1, men ikke MAGE-C1. I likhet med de fragmentene som inneholdt deler av MHD, MAGE-C1
900-1116 akkumulert i både RIPA-løselig og-uløselige fraksjoner med MG132 som to immunoreaktive band oppdaget av western blot (figur 5D). I samsvar med de relaterte fragmenter, MAGE-C1
900-1116 var overveiende cytoplasma i H1299 celler og MG132 ikke spesielt alter som lokalisering (figur 5E). Disse data implisere høyt konservert MAGE homologi domene i proteasome avhengige behandling og cytoplasmatiske lokalisering av MAGE-C1.
A) Skjematisk representasjon av V5 /His6 epitop tagget full lengde og trunkeringstegn konstruksjoner av MAGE-C1. MAGE-C1
1-138, MAGE-C1
600-901, MAGE-C1
902-1029, MAGE-C1
1030-1142 og MAGE-C1
900-1116 er vist og MAGE homologi domene (MHD) er indikert. B) Transient ekspresjon av MAGE-C1-fragmenter i NIH3T3-musefibroblaster påvist ved western blot med anti-V5 og anti-β-tubulin (lasting kontroll). Celler ble behandlet og lysert som i figur 1B. Stjernene indikerer mulige oligomere former. C) immunfluorescens mikrografer av NIH3T3 musefibroblastere uttrykker MAGE-C1 fragmenter (anti-V5, grønn) hvor TOPRO ble inkludert for å farge kjerner (rød). Celler ble behandlet med MG132 (40μM, 4t) eller DMSO (negativ kontroll). D) Forbigående uttrykk for MAGE-C1
900-1116 i H1299 NSCLC celler og oppdaget under de betingelser som brukes i figur 5B. Stjerne indikerer mulig oligomere form. E) immunfluorescens mikrografer av H1299 celler som uttrykker MAGE-C1
900-1116 som i figur 5C. For alle bildene, skala barer = 20 pm.
Diskusjoner
Immun strategier for kreftbehandling stole på en effektiv måte å skille mellom normale og maligne celler basert på differensial uttrykk mønstre av celleoverflateproteiner eller presenteres antigener. Kreft /Testis (CT) antigen familie av gener har over 100 forskjellige medlemmer, som normalt begrenset ekspresjon i bakterie linje celler i testis blir dysregulerte i mange kreftformer, effektivt å skille dem fra den normale, omgivende vev. CT-antigen-gener er normalt til taushet ved metylering på sine CpG-rikt promotorer og så demetylering av slike områder, så vel som histon acetylering, er delvis ansvarlig for deres avvik re-ekspresjon i kreft (oversikt i 19). Disse mekanismene er ikke i stand til fullstendig å forklare mangelen på ekspresjon av CT-antigener i visse tumortyper, kjennetegnet ved global hypometylering (for eksempel kolonkreft) [45,46] eller heterogeniteten ofte observert i tumorprøver [47]. Slike komplekse uttrykk mønstre krever flere nivåer av regulering som er usannsynlig å være knyttet utelukkende til transkripsjonsmekanismer. På grunn av dette undersøkte vi studerte post-translasjonell regulering av CT-antigener. Her presenterer vi data implicating degradering, via 26S proteasome, som en viktig regulator av CT antigen steady-state nivåer og viser at når det er kompromittert, er løselighet og subcellulære lokalisering av både NY-ESO-1 og MAGE-C1 dramatisk endret.
ubiquitin-proteasome system (UPS) er et viktig mekanisme for regulert protein nedbrytning i eukaryoter (anmeldt i 48). For å finne ut hvordan degradering via UPS påvirket steady-state nivåer av NY-ESO-1 og MAGE-C1 i kreft cellelinjer, behandlet vi cellene med proteasomhemmere mens overvåking endringer løselighet og lokalisering av hvert protein. Proteasomhemmere forårsaket endogent uttrykt NY-ESO-1 og MAGE-C1 å akkumulere, enten alene (HC33, U2OS), når begge CT antigener var tilstede (SK-MEL-37) eller når hver ble forbigående uttrykt i cellelinjer som mangler enten ( NIH3T3). Av notatet, ble opphopning hovedsakelig detektert som en økning i vaskemiddel-uoppløselige fraksjon av cellelysatet. Mens verken NY-ESO-1 eller MAGE-C1 har blitt rapportert tidligere å være aggregering utsatt, tilbøyelighet for CT antigener å bli uløselig tyder på at kapasiteten på anstand (og nedbrytning) nettverk /s er overskredet. Både MAGE-C1 og NY-ESO-1 ble observert til å samle seg på sentrosomen under de samme betingelser. Dette mønsteret minner om andre aggregering utsatt proteiner som CFTRΔF508 [49] og huntingtin [50] hvis akkumulering ved centrosomes er forverret med proteasomhemmingen (anmeldt i 51,52). Centrosomes fungere som den primære microtubule organisering sentrum (MTOC) og spiller en viktig rolle som regulator av cellesyklusprogresjon [53]. Den MTOC blir også et knutepunkt for komponenter av både cytosoliske anstand (f.eks Hsp40, Hsp70) og UPS (f.eks ubiquitin, 19S og 20S subenheter) [49,54,55], som akkumuleres i respons til misfoldede proteiner levert det ved direkte transport på mikrotubuler for å danne det intracellulære legeme referert til som aggresome [49,56,57]. I denne rollen centrosomes fungere som triage plattformer for protein kvalitetskontroll beslutninger. Det er dokumentert at de sentrosomen-lokaliserte UPS komponenter er i stand til å drive aktiv nedbrytning [54,58,59]. Den uløselige partisjonering og akkumulering ved centrosomes av både NY-ESO-1 og MAGE-C1 foreslå en tilbøyelighet til disse CT antigener å aggregere, en funksjon forverret når proteasome aktivitet er kompromittert.
Opphopning av både NY-ESO-1 og MAGE-C1 på centrosomes i fravær av proteasome aktivitet reflekterer trolig den segregering av misfoldede proteiner (muligens som uoppløselige aggregater) til et sentralt sted der de venter utbedring. Påvisningen av konsentrerte ubiquitin klynger ved centrosomes (figur 1D) og oppbygningen av polyubiquitinated materialer i Insol fraksjon (figur S2D) støtter denne modellen. Høyere nivåer av NY-ESO-1 puncta på centrosomes i ubehandlede H146 celler (og i mindre grad HC33s) versus SK-MEL-37s kan også gjenspeile forskjeller mellom deres anstand og nedbrytings nettverk, noe som gjør aggregering mer utbredt i celler med redusert kapasitet. En alternativ forklaring på dette kan være at enten NY-ESO-1 eller MAGE-C1 (eller begge) har et bona fide funksjonell rolle ved sentrosomen (dvs. NY-ESO-1 i H146-celler, fig S1C, 2D). For eksempel proteasomhemmere svekke omsetning på centrosomal proteiner, som påvirker både microtubuli nukleasjon og organisasjon [60,61]. Nærværet av enten MAGE-C1 eller NY-ESO-1 (eller begge deler) ved centrosomes kunne modulere nedbrytningshastigheter og /eller stabilitet av essensielle faktorer der. De MHDs av flere MAGE familiemedlemmer samhandle med RING-type E3 ubiquitin ligaser (f.eks TRIM28) og modulere ubiquitinering [20]. I MM, hvor MAGE-C1 og NY-ESO-1 blir ofte overuttrykt, er sentrosomen forsterkning funnet i ~ 30% av tilfellene, og har vært forbundet med overekspresjon av CT-gener fra MAGE familien [62]. Dermed kan en gevinst på funksjon effekten av NY-ESO-1 og /eller MAGE-C1 på sentrosomen ikke utelukkes.
A dokumentert kompleks mellom NY-ESO-1, og MAGE-C1 menes at lokaliseringen av hver CT antigen til centrosomes eller deres uoppløselighet kunne ha vært avhengig av interaksjon. Ennå siden cellelinjer som uttrykker enkelt CT antigener fremdeles akkumulert ved centrosomes etter MG132 behandling, betyr en interaksjon ikke synes å være en forutsetning. Dette ble bekreftet ved hjelp av SK-MEL-37 celler og CT antigen målrettede RNAi individuelt (Figur S3) og støtter en modell der både NY-ESO-1 og MAGE-C1 er egentlig i stand til selvstendig centrosomal lokalisering. Dessuten kunne de regionene som regulerer dette lokalisering tilordnes til aa 91-150 av NY-ESO-1 og aa 900-1116 av MAGE-C1. Denne regionen av NY-ESO-1 er en del av en «hot spot», identifisert omtrent mellom aminosyrene 80-110, for cellulær immunrespons mot NY-ESO-1 i kreft [37,63]. Siden disse MHC klasse I present epitoper er biprodukter av proteasomal fornedrelse, identifisere denne regionen som viktig for omsetning og lokalisering på MG132 behandling er konsekvent. Den MHD (aa 908-1106) av MAGE-C1 er bevart innenfor MAGE familien, men viser liten homologi med andre kjente domener. Selv om dens funksjon er fortsatt ikke godt forstått, den MHD for noen Mages representerer et område av protein-protein interaksjon [20,23]. Faktisk ser MAGE-C1 å binde NY-ESO-1 gjennom sin MHD [19,23,30]. To MAGE-C1-epitoper som presenteres av MHC-I molekyler på MM-celler er i stand til å indusere CD8 + T-cellerespons [64] og de peptider som er avledet fra MHD (aa 959-968 og 1083-1091). Den felles nærvær av MHD i alle MAGE familiemedlemmer tyder på at denne funksjonen av MAGE-C1 kan være relevant for å forstå den immunologiske responsen på andre MAGE familie proteiner.
Totalt våre funn markere en post-translasjonell nivå regulering av NY-ESO-1 og MAGE-C1 som kan påvirke immunrespons mot CT antigen-uttrykke tumorceller. Disse observasjonene er spesielt relevant for MM. Bruk av selektive proteasomhemmere (f.eks VELCADE /bortezomib) har vært et stort fremskritt i behandlingen av MM. Vi har vist at proteasomhemmere er sannsynlig å indusere centrosomal lokalisering og akkumulering av uoppløselige MAGE-C1 og NY-ESO-1 som en del av aggresomes i mm celler. Hva fysiologisk konsekvens CT antigen akkumulering kan ha i MM er ennå ikke klart. Både MAGE-C1 og NY-ESO-1 blir ofte uttrykt i mm (66% og 22% av tilfellene henholdsvis), med 93% av MAGE-C1-positive myelomer med å utløse en påvisbar humoral og cellulær immunrespons mot dette antigenet [65, 66]. Akkumulering av enten CT antigen (eller begge) kan være cytotoksisk og forverre den resulterende apoptotiske program som induseres av proteasomhemmere [67]. Vi observerer redusert MAGE-C1 flekker i kjernen når cellene ble behandlet med MG132. Myelomas med atom cytoplasma eller atom bare MAGE-C1 har en dårligere prognose i forhold til de med MAGE-C1 bare i cytoplasma [27]. Selv antigen presentasjon ville bli svekket, kan den begrensede CT antigen lokalisering at resultatene fra proteasomhemmingen faktisk positivt bidra til en bedre prognose. Denne potensielle nytten må imidlertid veies opp mot de veldokumenterte pleiotrope effekter på viktige cellulære funksjoner som oppstår med proteasomhemmingen. Den avgjørende rolle UPS i alle celler, inkludert kreftceller, gjør definere en terapeutisk vindu nøkkel til nytten av disse forbindelsene. Videre studier er nødvendig for å bestemme de fysiologiske rollene til CT antigener og de potensielle konsekvensene for effekten av immunterapi mot svulster som ofte uttrykker dem, for eksempel melanom, lungekreft og myelomatose.
Materialer og Metoder
Cell kultur, antistoffer og reagenser
Menneske melanom (SK-MEL-37) [1] og småcellet lungekreft (SCLC) cellelinjer (H146, HC33, H69, H209, H524, H889, og
