Abstract
hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet og understreker behovet for sikker og effektiv chemopreventive strategier. Målretting av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) er attraktivt ved at det er en tidlig kritisk hendelse i patogenesen HNSCC. Men dagens agenter mangler effekt eller har uakseptabel toksisitet. Flere grupper har vist at over-the-counter medisiner, polyetylenglykol (PEG) har bemerkelsesverdig chemopreventive effekt mot tykktarmskreftutvikling. Viktigere, rapporterte vi at denne effekten er mediert gjennom EGFR intern /degradering. I denne studien undersøkte vi Kjemopreventivt effekten av dette middel mot HNSCC, ved å bruke både vel validert dyremodellen 4-NQO (4-nitrokinolin 1-oksyd) rottemodell, og cellekultur med det menneskelige HNSCC cellelinje SCC-25. Vi demonstrerte at daglig topisk applikasjon av 10% PEG-8000 i munnhulen (tunge og hulromsveggen) etter 4NQO initiering resulterte i en signifikant reduksjon av tumorbyrden (begge, tumorstørrelse og tumorer /tumorbærende rotte) uten noe tegn på toksisitet . Immunhistokjemiske studier avbildet redusert proliferasjon (antall Ki67-positive celler) og redusert ekspresjon av EGFR og dens nedstrøms effektorer cyklin D1 i tungen slimhinnene i 4NQO-rotter behandlet med PEG. Vi viste at EGFR ble også markert nedregulert i SCC-25 celler ved PEG-8000 med en samtidig induksjon av G1-S-fasen cellesyklus arrest, som ble potensielt formidlet gjennom oppregulert p21
cip1 /waf1. I konklusjonen, vi demonstrere, for første gang, at PEG har lovende effekt og sikkerhet som en chemopreventive effekt mot oral kreft
Citation. Wali RK, Kunte DP, De La Cruz M, Tiwari AK, Brasky J , Weber CR, et al. (2012) Aktuelt polyetylenglykol som en Novel chemopreventive Agent for Oral Cancer via målretting av epidermal vekstfaktor Response. PLoS ONE 7 (6): e38047. doi: 10,1371 /journal.pone.0038047
Editor: David L. McCormick, IIT Research Institute, USA
mottatt: 26 september 2011; Godkjent: 02.05.2012; Publisert: 04.06.2012
Copyright: © 2012 Wali et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Bevilgninger gitt av National Institute of Health U01CA111257, R21CA141112, 1R21CA156944-01, RO3CA139528, RO1CA156186. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. RKW, SS og HKR er co-grunnleggerne av Pegasus Biosolutions LLC. Det er en ventende foreløpig USA patent. Det er ingen produkter i utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Plateepitelkarsinom i hode og nakkeregionen (HNSCC) er den sjette mest utbredte kreft i verden, sto for 3% av alle krefttilfeller [1]. I 2010, i USA alene var det anslagsvis 49.000 nye HNSCC tilfeller og 11 500 HNSCC relaterte-dødsfall [2]. Viktigere, disse tallene ikke tar hensyn til alvorlig sykelighet fra ansikts skjemmende og aerodigestive dysfunksjon forbundet med kirurgi /strålebehandling. Forebygging av denne malignitet, derfor representerer et stort helse imperativ. Modifikasjoner av visse livsstil risikofaktorer ville være ideelt, men vanskelig å få til tross for store folkehelsearbeid mot tobakksbruk (både røykte og tygde), mutter tygge, alkoholforbruk og HPV (infeksjon) status.
Derfor , interessen har fokusert på chemoprevention gitt at de utsatte gruppene er godt definert for primærforebyggende arbeid; de med tidlig neoplastisk transformasjon (oral leukoplaki) som kan identifiseres ved en standard fysisk eksamen. En like viktig søknad ville være sekundær chemoprevention (hindrer andre primær HNSCC hos pasienter med en tidligere historie av kreft)
Det har blitt bemerket at selv etter vellykket tumorreseksjon (histopathologically klare marginer.); ~ 20% av pasientene fortsatt kan ha tilbakefall av HNSCC på et annet område (ca 2% per år) [3]. Dette har i stor grad vært knyttet til «-feltet cancerization» et [4]. Faktisk har klassiske studier antydet at flere mutasjons hendelser i mikroskopisk normal slimhinne kan være forutsigbare for tilbakevendende HNSCC og total overlevelse [5]. Denne «fordømt slimhinne» konseptet er robust, ikke bare for forebygging av tilbakefall (sekundærforebygging), men også presenterer et potensielt mål for primær chemoprevention (pasienter uten kreft, men å ha premaligne lesjoner).
Dermed finne molekylære mål i premaligne slimhinner har vært et overordnet tema i HNSCC forebygging med epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) som fikk litt oppmerksomhet. EGFR er en kritisk tidlig hendelse i HNSCC og er overuttrykt i 80% av HNSCC. EGFR overekspresjon og økt kopiantall i orale premaligne lesjoner er en utmerket indikator for risikoen for utvikling for å HNSCC [6]. I tillegg har EGFR overekspresjon blitt funnet i histologisk normal slimhinne fra HNSCC pasienter indikerer at forandres EGFR-signalering bidrar til feltet cancerization sett hos disse pasientene [7]. Viktigere, rettet mot EGFR er en trofast for anti-HNSCC terapier som understreker viktigheten av denne veien. Men som med de fleste andre molekylære målrettede medikamenter, de store spørsmålene om bruk av anti-EGFR midler (monoklonale antistoffer, små molekyl hemmere, etc) for chemoprevention er deres høye kostnader for langvarig bruk og tilhørende toksisitet, spesielt på grunn av at de fleste av pasientene tilbys chemopreventive agenter ikke har kreft. Derfor, å finne en billig, godt tolerert mekanisme for å målrette EGFR i munnslimhinnen vil være et stort skritt fremover i HNSCC chemoprevention innsats.
Vår gruppe har vært å utforske den over-the-counter avføringsmiddel polyetylenglykol (PEG) for sin bemerkelsesverdige potens ved downregulating EGFR og dermed gi en mulig forklaring på sin tykktarmskreft Kjemopreventivt effekt (dokumentert ved flere grupper i flere prekliniske modeller) [8], [9], [10], [11], [12 ], [1. 3]. Fra et mekanistisk synspunkt, observerte vi at PEG resulterte i hurtig internalisering av membranbundne EGFR med samtidig proteosomal degradering. Dette fører til redusert cyklin D1 og brev (implisert i både kolorektal kreft og HNSCC) således overførende anti-neoplastiske effekt av PEG [13].
Vi har derfor en hypotese om at topisk PEG kan være et effektivt middel mot Kjemopreventivt HNSCC . For disse studiene brukte vi en godt validert kreftfremkallende, 4-nitrokinolin 1-oksid (4-NQO) -behandlet rottemodellen HNSCC og plateepitel kreft cellelinje, SCC25 celler. Gitt bekymring for at PEG kan forvirre effekten med en direkte kreftfremkall-munnslimhinnen interaksjon, brukte vi en post-initiering design ved hjelp av tumorstørrelse og mangfold som våre primære endepunktene og godt validerte mellom biomarkører for spredning som et sekundært endepunkt. Vi, heri for første gang viser at daglig topisk oral anvendelse av PEG-8000 for et kort intervall betydelig redusert oral tumorbelastning (både tumorstørrelse og antall).
Materialer og metoder
Dyr studier og Tumor Induction
Alle dyr protokoller ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Northshore Universitetet Health (IACUC Assurance # A3444-01 -protokollen # 07-230). Tjue-fire hannrotter (Fisher F 344, 150-200 g, Harlan, Indianapolis, IN) ble huset i et klimakontrollert miljø (25 ° C temperatur, 60% fuktighet, og en 12 timers lys /dagers syklus). Seksten dyr ble gitt
ad libitum
rottemat og drikkevann supplert med fire-nitrokinolin 1-oksid (4NQO, 20 ppm, Sigma Chemicals). Nylaget 4NQO supplert vann ble utlevert til rotter i lyse, ugjennomsiktige flasker som var etterfylles to ganger i uken. De resterende 8 rotter ble gitt rent drikkevann (kontrollgruppen). Etter 14 uker ble det 4NQO supplert vannet erstattes med vanlig vann, og rottene ble tilfeldig delt inn i to behandlingsgrupper. Den første gruppen (8 rotter) mottok en daglig topisk applikasjon av 10% (vekt /volum) PEG-8000 (den dose /formuleringen effektivt i tykktarmskreft chemoprevention) ved å male kinn gulv /tak av rotte munnhulen ved hjelp av en sobel børste (# 4) i opp til 3-4 minutter. For disse behandlingene ble rottene bedøvet mildt i en godt regulert isofluran /oksygen bedøvelse kammer. Den andre gruppe (8 rotter), som tjener som kontroll, ble simulert malt med børsten dyppet i saltoppløsning bare. Dette regimet ble fortsatt i 14 flere uker. Ved obduksjon ble rotte tunger skåret ut, og utsatt for makroskopisk tumorvurdering. Tunge seksjonene var skiver, formalinfiksert, parafininnebygd, seksjonert og utsatt for histologisk og immunhistokjemisk behandling.
Tumor Count og Volume
dissekert tunger ble undersøkt for forekomst av utilslørt svulster. Totale antall tumorer ( 0,2 cm) på hver tunge ble tellet og tumorvolumet (størrelse) ble målt i henhold til formelen bredde x lengde x høyde x π /6 [14]. Histologiske evalueringer for tilstedeværelsen av epiteliale atypia og dysplasi i uninvolved tungen vev ble utført etter farging med hematoxylin og eosin.
Immunhistokjemisk (IHC) Analyse
De tunge seksjoner ble utsatt for IHC analyse for å bestemme effekten av PEG på ekspresjonen av spredning markører Ki67, EGFR og syklin D1. Fire mikron parafininnstøpte snitt ble montert på Superfrost
+ bakker (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og deparaffinized først ved baking ved 55-60 ° C i 1 time og deretter underkaste til to 5-minutters vaskinger i xylen. Vevssnittene ble deretter hydrert i graderte serier av etanol skyllinger. Den epitop gjenfinning ble utført ved å utsette vevet lysbilder til press microwaving (NordicWare, Minneapolis, MN) i antigen avsløring løsning (Vector Laboratories). Endogen peroksyd aktivitet ble stoppet ved behandling med 3% H
2o
2 i metanol i 10 min, og den ikke-spesifikke binding ble blokkert ved å inkubere vevssnittene med 5% hesteserum i 1 time ved romtemperatur. Delene ble deretter inkubert ved 4 ° C i 4-6 timer med primære antistoffer [anti-Ki67 (1:250; Abcam, Cambridge, MA), anti-EGFR (1:200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) og anti-Cyclin D1 (1:100; Cell Signaling Technology, Danvers, MA)], etterfulgt av passende biotinylerte sekundære antistoffer. De antigen-antistoff-komplekser ble påvist med den Vectastatin Elite ABC-kit (Vector Laboratories) ved bruk av 3, 3 «-diaminobenzidine (DAB) som chromagen (Vector Laboratories). For negative kontroller ble snittene behandlet i fravær av de primære antistoffer. Prøvene ble motfarget i hematoksylin Gill-løsning og den blå fargen stabilisert ved hjelp av en 20 sekunders vask i (1 g /100 ml), mettet litiumkarbonat. IHC ble scoret av patologen (CW) uten forutgående kunnskap om behandlingsplan. En semi-kvantitativ skala ble anvendt for å evaluere immunoreaktiviteten til basal squamous epitelceller. Omfanget av farging ble gradert og scoret som 0, negativ farging; 1+, 10% reaktivitet, 2 + 10-50% reaktivt, og 3+ for . 50% positive reaktivitet [15]
Cell Kultur
SCC-25 celler innhentet fra American Type Tissue Culture (ATCC), Rockville, MD. Dette er dårlig differensierte squamous celler hentet fra menneskelig tungen. Identiteten og kvaliteten av disse cellene ble bekreftet ved ATCC. Cellene ble dyrket i DMEM /F-12 media (inneholdende 2,5 mM L-glutamin, 15 mM HEPES, 0,5 mM natriumpyruvat, og 1200 mg /l natriumbikarbonat) supplert med 400 ng /ml hydrokortison (Sigma /Aldrich), 10% FBS (ATCC), og 0,5% Pen /Strep (ATCC). For å vurdere effekten av PEG, ble disse celler behandlet med enten PEG-8000 eller bærer (PBS) i 24 timer. Cellene ble deretter høstet og underkastet Western blot og flowcytometrisk analyse.
Cell Proliferation Assay
Celletallet ble bestemt ved WST-1 (4- [3- (4-jodfenyl) -2 – (4-nitrofenyl) -2H-5-tetrazolio] -1, 3-benzen disulfonat) analyse i henhold til produsentens instruksjoner (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Kort sagt ble SCC-25-celler dyrket i 96-brønners plater i et endelig volum på 100 ul og deretter inkubert med 10 ul av WST-1 reagens ved 37 ° C i 30 minutter i et fuktig 5% CO
2 inkubator. Omdannelse av tetrazoliumsalt til formazan ble bestemt spektrofotometrisk ved 440 nm absorbansen (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)
Cell Cycle Analysis
SCC-25-celler ble inkubert med bærer (fosfatbufret saltvann.; PBS) eller 10% PEG i en fuktet 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C i 24 timer. Cellene ble deretter vasket i PBS /bovint serumalbumin (BSA), trypsinert, resuspendert i fersk PBS /BSA og fiksert i 70% etanol ved -20 ° C i 30 minutter. Etter 2 vaskinger ble cellene inkubert i 3 timer (ved værelsestemperatur) i PBS /BSA-oppløsning inneholdende propidiumjodid (PI, 40-ug /ml, Sigma) og RNase A (200 ug /ml; Sigma). Cellene ble underkastet DNA-innhold måling ved hjelp av strømningscytometri (Becton Dickinson Labware). Dataene ble uttrykt som prosentandelen av celler i G
o-G
1 til og med G
2-M-populasjoner og Cellquest 3,1 software program ble anvendt for utvikling av DNA-innhold frekvenshistogrammene.
Western blot analyse
Western blotting ble påført ved bruk av standard teknikker. I korthet, ble 30 ug protein underkastet SDS-PAGE, overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ), blokkert med 5% blotto og probet med spesifikke antistoffer inkludert prolifererende cell nuclear antigen (PCNA), P21
cip1 /waf1, Cyclin D1, epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR). Xerograms ble utviklet med forbedret chemiluminescence (Santa Cruz Biotechnology). Bilder ble kjøpt via UVP Bio-Imaging Systems og analysert ved hjelp av Labworks 4.6 software. Ensartethet i protein lasting ble oppnådd ved normalisering etter sondering membraner med anti-β-aktin (1:1000).
statistiske metoder
Verdier ble uttrykt som gjennomsnitt + SE som angitt. Kvantitative densitometry verdier ble sammenlignet med paret Student test. Forskjeller med p 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
Resultater
PEG hemmer 4NQO-indusert Oral startfasen og Progresjon
rotte 4NQO-induced oral kreft modellen er en rutinemessig. brukt modell for HNSCC chemoprevention studier som deler en rekke egenskaper med menneskelig HNSCC carcinogenesen, i form av flere trinn molekylære hendelser og sekvensielle endringer i histopatologiske funksjonene i munnhulen slimhinnen [16], [17]. En av de andre fordelene ved denne modellen er den forholdsvis høye spesifisitet mot hode og nakke tumorer, samt minimal ødeleggende virkning på den generelle helsen til rotter. Som vist i figur 1 (A), ved nekropsi (14 uker etter avsluttet behandling carcinogen), 4NQO-behandlede rotter utviklet flere store tumorer i munnhulen, for det meste stammer fra tunge og noen fra den i munn og svelg mucosa. Administrasjon av PEG-8000 i 14 uker etter fullført 4NQO behandling viste to vesentlige endringer: 1) PEG-8000 behandlede rotter utviklet betydelig mindre svulster (tumor volum) enn sine alders- og 4NQO behandlings matchet kolleger (~58% reduksjon, p = 0,02); 2) det totale antall tumor (tumorer /tumorbærende rotte) i PEG-8000 behandlede rotter var også lavere enn alders- og 4NQO behandlings-matchet rotter som ikke mottok PEG-8000 på et punkt (-25% reduksjon; p = 0,05 ) (figur 1B). Disse resultatene antyder at PEG-8000 søknad effektivt kan redusere dannelsen av nye tumorer (hemming av initiering) samt stoppe progresjonen av pre-eksisterende tumorer mot avansert HNSCC (inhibering av progresjon).
Den første gruppen mottok en daglig (3-4 minutter) topisk applikasjon av 10% PEG-8000 via oral maleri og den andre gruppen ble malt sham (PEG-kontrollgruppe). Dette regimet ble fortsatt i 14 flere uker før euthanization. Rottene ble avlivet etter 14 uker og i munnhulen underkastet makroskopisk tumorvurdering av de samlede tumorer (≥0.2 cm). Som vist, 4NQO-behandlede rotter utviklet flere store tumorer i munnhulen for det meste stammer fra tunge og få fra veggen i munnhulen. PEG redusert den totale tumornummer (tumorer /tumorbærende rotte) (p = 0,05) og veksten av tumorer (tumorvolum) i forhold til sine alderstilpassede motstykker (p = 0,02). Svulsten volum (størrelse) ble målt i henhold til formelen bredde x lengde x høyde x π /6
PEG undertrykker premaligne Epitelial hyper
En presis tidsmessige og romlige regulering av. diffuse celleproliferasjon er et viktig kjennetegn ved tidlig stadium HNSCC kreftutvikling, og fungerer som et viktig verktøy for å vurdere chemopreventive effektiviteten av agenter. I 4NQO-behandlet rotte-modell av HNSCC carcinogenese, har generell cellulær hyperproliferasjon i tungen epitelet tidligere blitt rapportert [18]. Mikroskopisk vurdering av slimhinnen i 4NQO-behandlede rotter avdekket mange lokaliserte regioner av mild til moderat epitelial dysplasi i morfologisk normal tungen og munnslimhinnen som ble normalisert ved PEG (figur 2A). For ytterligere å studere effekter av PEG-8000-programmet på spredning i tungen /munnslimhinnen av 4NQO-behandlede rotter, undersøkte vi immunhistokjemisk uttrykk for kjernefysisk antigen Ki67, en veldefinert markør for spredning. For dette ble totalt 1000 epitelceller evaluert i 6-7 felt på 400 × forstørrelse og alle verdiene ble brukt til merking indeksene. Som vist i figur 2A og B, 4NQO-behandling betydelig økt proliferasjon i morfologisk normale tunge slimhinne som vist (antall Ki67-merkede epitelceller /per optisk felt: 30 + 8 i 4NQO-behandlingsgruppen sammenlignet med 14 + 6 i matchet funksjon; p 0,01). Topisk applikasjon av PEG-8000 dramatisk normaliserte spredningsindekser i 4NQO-behandlede rotter (antall Ki67-merkede epitelceller /per optisk felt: 30 + 8 i rotter behandlet med 4NQO stående vs. 17 + 4 i 4NQO-behandlede rotter behandlet med PEG-8000; ~43% reduksjon; p 0,01). I den mukosale epitel 4NQO-behandlede rotter, i motsetning til vanlig skjellepitel hvor proliferasjon er begrenset til basalrommet, spredning sone utvidet til den supra-basal rommet i stratifisert plateepitel tungen epitel. Men PEG-8000 søknaden inneholdt proliferativ sonen tilbake til basalrommet i stratifisert plateepitel epitel, som indikerer sterke anti-proliferative effekter av denne aktuell agent
Som vist (øverst Panel, figur 2A)., 4NQO- behandlede rotte seksjoner avdekket mange lokaliserte regioner av mild til moderat epitelial dysplasi i morfologisk normale vises slimhinne som ble normalisert ved PEG [høyere forstørrelse (63 ×, beskåret bilde) innfellinger påvise mitotiske tall i fire NQO-behandlede gruppen alene]. For ytterligere å studere effekter av PEG på slimhinnene hyper-spredning, utførte vi immunhistokjemisk analyse av kjernefysisk antigen Ki67, en veldefinert markør for spredning. Totalt 1000 epitelceller ble evaluert fra 6-7 felt. Som vist (nederst Panel, figur 2A-B), økt 4NQO-behandling spredning i morfologisk normal tunge slimhinne som avbildet ved økt antall Ki67-merkede epitelceller /per optisk felt i forhold til alder matchet kreftfremkallende frie kontroller. (P 0,01). Lokal applikasjon av PEG derimot dramatisk redusert antall Ki67-merkede epitelceller /per optisk felt (p 0,01).
PEG nedregulerer Tongue slimhinner EGFR og cyclin D1 Expression i fire NQO- behandlede rotter
EGFR overekspresjon i premaligne hode og nakke lesjoner er korrelert med økt risiko for progresjon til HNSCC og dårlig overlevelse [19], [20]. Moduler EGFR uttrykk kan derfor tjene som nøkkelelement i en chemopreventive strategi. Flere grupper, inkludert våre har tidligere vist at anti-proliferative og kjemopreventive virkninger av PEG mot tykktarmskreftutvikling er EGFR-mediert, som administrering av PEG-gavages i kreftfremkallende behandlede rotter betydelig redusert spredning i kolon mukosa gjennom nedregulering av EGFR-ekspresjon [13]. Vi derfor undersøkt om en lignende mekanisme ble innblandet i chemopreventive handlingene til aktuell PEG-8000 mot HNSCC. Tunge Seksjonene ble formalin-fiksert og undersøkt ved farging for å vurdere endringer i uttrykket nivåer av EGFR. Som vist i figur 3A og B, lokal applikasjon av PEG-8000 i betydelig grad reduserte intensitet, så vel som antall områder overekspresjon av EGFR i 4NQO-behandlede rotter hvor grunnlinjen EGFR-ekspresjon var mye høyere enn den tunge /orale mukosa av sunne kontrollrotter. Dette impliserer at nedregulering av EGFR som en av de mulige mekanismer for PEG-indusert chemoprevention av HNSCC. Vi har videre demonstrert at PEG betydelig redusert ekspresjon av Cyclin D1, en nedstrøms effektor av EGFR som blir overuttrykt i HNSCC [21] og er involvert i å forårsake resistens mot terapeutiske legemidler slik som cisplatin, [22] og gefitinib [23].
som vist (venstre panel – figur 3A og 3B), baseline EGFR-ekspresjon i tungen slimhinnene i 4NQO-rotter som var høyere enn for kontrollrottene (p 0,00001). Lokal applikasjon av PEG imidlertid forårsaket en betydelig nedgang i uttrykket av EGFR (p 0,005). Videre aktuell PEG søknad til 4-NQO rotter forårsaket lignende virkninger på uttrykk for cyclin D1, en av nedstrøms effektorer av EGFR. (Høyre Panel – figur 3A og 3B)
PEG hemmer celleformering og induserer cellesyklus arrest i SCC-25 Cells
for å forstå mekanismen av PEG handling på celleproliferasjon i HNSCC; benyttet en
in vitro
cellekulturmodell (plateepitel carcinom cellelinje; SCC-25) for å undersøke effekten av PEG på proliferasjon og cellesyklusfordeling. Som vist på figur 4A, av WST-1 proliferasjonsanalyse viste en doseavhengig reduksjon i SCC-25 cellevekst når de ble behandlet med PEG i 24 timer, med maksimal reduksjon på 43% oppnådd i 10% PEG-8000. Derfor, for senere eksperimenter 24 h behandlinger av 10% PEG-8000 ble benyttet. Immunoavtrykket Resultatene viste at PEG også forårsaket ~ 50% reduksjon av markør, PCNA (figur 4B) proliferasjon. Cellesyklus-stans er en av de viktige mekanismer for kjemopreventive midler. For å undersøke effekten av PEG-8000 på det cellulære fordeling vi utført strømningscytometrisk analyse av PI merkede celler. Våre resultater viser at 24 timers behandling av SCC-25-celler med 10% PEG-8000 resulterte i en markert reduksjon i S-fase (proliferative) celler (62% av bærerkontrollen, p 0,002) og en signifikant økning i G2-M fase celler (138% av kjøretøy kontroll; p 0,001) (Figur 4C). Disse resultatene indikerer klart at PEG behandling induserer cellesyklusarrest i hyperproliferative celler, og kan derfor bidra til å gjenopprette celle homeostase ved å endre de endrede forekomst av kreft cellevekst og død.
Som vist (figur 4A), det var en doseavhengig nedgang i cellevekst, med maksimal reduksjon på 43% oppnådd i 10% PEG-8000. Figur 4B viser en -50% nedgang på uttrykk for markør spredning PCNA av PEG. Figur 4C viser effekten av PEG på cellesyklusfordeling. Den 24 h PEG-behandlede celler ble farget med propidiumjodid og analysert ved strømningscytometri. PEG blokkerte celler i S-fase (ved 62%), og tilsvarende øker celler i G2-M fase (med 38%).
Behandling av SCC-25 Celler med PEG Minker EGFR og syklin D1 og modulerer Expression of Cell Cycle Regulatory Protein p21
cip1 /waf1
fra vår
in vivo
4NQO rotteforsøk, EGFR og cyclin D1 var de to viktige mål nedregulert av PEG; Vi ønsket å undersøke om tilsvarende effekter ble observert i HNSCC cellelinjer. Vi urfremført Immunoblotanalyse eksperimenter for å vurdere uttrykket av EGFR og cyclin D1 på 24 h behandling av PEG-8000 i SCC25 celler. Konsonant med
in vivo
eksperimenter fant vi at behandling av SCC25 celler med PEG-8000 forårsaket en betydelig nedgang EGFR (~45% sammenlignet med kjøretøy kontroll; p 002) og cyclin D1 (~57% sammenlignet med kontroll kjøretøy; p 0,005) uttrykk (Figur 5 A). I PEG-indusert tykktarmskreft chemoprevention har vi tidligere vist at cellesyklus arrest indusert av PEG-8000 impliserer en EGFR-medierte oppregulering av en cyclin-avhengig kinase inhibitor, p21
cip1 /waf1 [24]. På en lignende forsøksprotokoll, har vi funnet at PEG-8000 faktisk forårsaket en ~54% økning i p21-ekspresjon (p 0,001) i SCC25 celler (Figur 5B). Videre studier er i gang for å karakterisere oppstrøms trasé innblandet i modulering av disse cellesyklus regulatorer i SCC25 celler ved PEG-behandling.
Som vist i figur 5A, konsonant med
in vivo
eksperimenter Peg forårsaket en betydelig reduksjon EGFR (~45% sammenlignet med kjøretøy kontroll; p 002) og cyclin D1 (~57% sammenlignet med kontroll kjøretøy; p 0,005) uttrykk. På lignende forsøksprotokoll (figur 5B), PEG-8000 forårsaket ~54% økning i p21-ekspresjon (p 0,001).
diskusjon
heri viser, for den første tid, at lokal applikasjon av PEG-8000 tilbudt effektiv beskyttelse mot kreft i munnhulen utvikling. Våre cellekultur data som viser anti-proliferative effekter av PEG i SCC-25 celler kompletteres av redusert tumorbyrde i godt validert 4-NQO-rotte HNSCC modell (når gitt i etter initieringsfasen). Fra et mekanistisk perspektiv, demonstrerer vi nedregulering av EGFR med samtidig hemming av cyclin D1-spredning aksen.
HNSCC bør være utpreget chemopreventable fordi utsatte grupper er lett identifiserbare for både primærforebygging (tobakk tygge, alkohol, HPV etc) og sekundærforebygging. Dette er fordi HNSCC pasienter med bare en enkelt primærtumor har en betydelig risiko for å utvikle andre primærsvulster i løpet av de neste tiårene. Dessuten kan pasienter med oral leukoplaki (prevalens av ~0.5%) at skape en ondartet transformasjon sats på ~ 5% per år ha nytte av denne chemoprevention [25]. Således PEG for HNSCC forebyggelse representerer et potensielt klinisk levedyktig strategi.
I denne forbindelse en rekke kjemopreventive midler, så som NSAIDs [26], vitamin E [27] og retinsyre [28] har blitt testet mot HNSCC men har ikke klart enten skyldes manglende effekt eller bivirkninger [29]. For eksempel ble en fersk randomisert fase II-studie, celecoxib 100 eller 200 mg to ganger daglig funnet å være ineffektive i å kontrollere muntlig premaligne lesjoner og hadde betydelig systemisk toksisitet som kardiovaskulære bivirkninger [30]. På samme måte, retinoider ble funnet å gi bare moderat beskyttelse mot utvikling av SCC i leukoplaki pasienter, og med et uakseptabelt bivirkningsprofil [31]. Den eneste andre middel som har vist lovende resultater til hittil har vært grønn te ekstrakt (GTE), som, mens ikke å oppnå statistisk signifikans i klinisk responsrate for orale premaligne lesjoner, fortsatt økte median lengde på progresjon (27,5 til 46,4 måneder ) [32].
mangelen på overbevisende resultater med standard chemopreventive midler har ført til interesse i å utnytte et molekylært definert kandidat agenten tilnærming [33]. Det har vært to nye omfattende studier som evaluerer mutasjons landskapet HNSCC [34], [35]. Disse studiene viste en rekke gener som vanligvis endres i HNSCC. Imidlertid har de fleste av de antatte tidlige hendelser (for eksempel p53 og NOTCH1) synes å være tumorsuppressorgener som generelt ikke er «druggable» (hemming mer sannsynlig å være gunstig for proto-onkogener). Derfor, for å forebygge kreft, ikke bare gjøre kandidatens mål må være proto-onkogener men disse lesjoner må være diffust stede i munnslimhinnen hos risikopasienter, spesielt i orale premaligne lesjoner (OPLS, hovedsakelig bestående av leukoplaki). EGFR har vist seg å være et mål ved behandling av HNSCC med både monoklonale antistoffer og lavmolekylære inhibitorer som viktige komponenter av den terapeutiske armamentarium. Dessuten våre data viser tydelig en dyp oppregulering i EGFR i histologisk normal oral /tunge slimhinne i 4NQO-behandlede rotter. Betydningen av EGFR tidlig i kreftutvikling understrekes av en fersk klinisk studie som viste at i de fleste av OPLS, EGFR oppregulering (begge med kopi nummer og uttrykk) korrelert med høy risiko for progresjon til frank malignitet [36], [37]. Fra en chemopreventive perspektiv EGFR kan være en viktig målgruppe som avslørt av mekanistiske evaluering av grønn te ekstrakt for kreft chemoprevention.
Våre data indikerer at PEG kan føre til en dramatisk nedregulering av EGFR både i cellekultur og i premaligne munnslimhinnen, i tråd med vår omfattende data fra PEG i kolorektal kreftutvikling. Faktisk er PEG en av de mest potente Kjemopreventivt middel mot tykktarmskreft [8], [38]. Effekten av PEG i tykktarmskreft har vært støttet av foreløpige epidemiologiske data [39]. Fra et mekanistisk perspektiv, har vårt laboratorium tidligere vist at EGFR ble nedregulert av PEG i cellekultur og i kolon kreftfremkallende (azoxymethane) -behandlet rottemodellen, [13]. Denne effekten syntes å være via membran intern med påfølgende proteosomal degradering. Nedstrøms konsekvensene ser ut til å følge paradigmet av EGFR → SNAIL → E-cadherin → β-catenin → Tcf transkripsjonsregulering [13]. Viktigere var integralet arten av EGFR vist ved den demonstrasjon at EGFR knockdown (via shRNA) avstumpet den Kjemopreventivt effekten av PEG i denne modellen av tykktarmskreft. Studier pågår for å fastslå den eksakte mekanisme som PEG internalizes EGFR. Videre, i samsvar med våre nåværende data i HNSCC, vi har tidligere vist, både i cellekultur og dyremodeller av tykktarmskreft, som PEG-indusert EGFR downregulation trykkes spredning potensielt gjennom cyclin D1. Videre kan G1 → S-fasen cellesyklus-stans observert være mediert, i det minste delvis, gjennom induksjon av p21
cip1 /waf1, en cyklinavhengig kinaseinhibitor, som kan gi en annen modalitet til å undertrykke proliferasjon [24].
