Abstract
Bakgrunn
Flere behandlinger i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er histologi-avhengige, og behovet for histologiske messige markører er økende. MicroRNAs (mirnas) er lovende molekylære markører i flere kreftformer og viser forskjeller i uttrykk avhengig av histologisk subtype. MiRNA familie MIR-200 har vært knyttet til regulering av epitel-mesenchymale (EMT) /mesenchymale-epitel overgang (MET). EMT innebærer dype fenotypiske endringer som inkluderer tap av celle-celle adhesjon, tap av celle polaritet, og oppkjøpet av trekkende og invasive egenskaper som forenkler metastasering. En dobbeltrolle for Mir-200 familie i prognosen av flere svulster har vært knyttet til tumorcelle opprinnelse. Men den prognostiske rolle og funksjon MIR-200 familie i tidlig stadium NSCLC adenokarsinom og plateepitelkarsinom (SCC) har ikke blitt godt etablert.
Metoder
miRNA uttrykket ble bestemt ved bruk av TaqMan analyser i 155 svulster fra resected NSCLC pasienter. Funksjonelle studier ble utført i tre NSCLC cellelinjer:. H23, A-549 og HCC-44
Resultater
Høy MIR-200c uttrykk var assosiert med kortere total overlevelse (OS) i hele kohort (p = 0,024). Høy MIR-200c (p = 0,0004) og Mir-141 (p = 0,009) uttrykk korrelert med kortere OS i adenokarsinom – men ikke i SCC. I multivariat analyse, en risikoscore basert på MIR-141 og MIR-200c uttrykk dukket opp som en uavhengig prognostisk faktor for OS i hele kullet (OR, 2,787, p = 0,033) og i adenokarsinom pasienter (OR, 10,649; p = 0,002). Funksjonelle analyser viste at MIR-200c, var knyttet til mesenchymale-epitelial overgang (MET) og berørte celle migrasjon og E-cadherin nivåer, mens overekspresjon av MIR-141 redusert
KLF6
protein nivåer og produsert en økning av sekresjon av
VEGFA in vitro plakater (H23, p = 0,04, A-549, p = 0,03; HCC-44, p = 0,02) og er assosiert med høyere blod microvessel tetthet i pasienttumorprøver (p 0,001) .
Konklusjon
Høy MIR-141 og MIR-200c uttrykk er forbundet med kortere OS i NSCLC pasienter med adenokarsinom gjennom MET og angiogenese
Citation. Tejero R, Navarro A, Campayo M, Viñolas N, Marrades RM, Cordeiro A, et al. (2014) MIR-141 og MIR-200c som markører for total overlevelse i Early Stage Ikke-småcellet lungekreft Adenocarcinoma. PLoS ONE 9 (7): e101899. doi: 10,1371 /journal.pone.0101899
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 28 februar 2014; Godkjent: 12 juni 2014; Publisert: 08.07.2014
Copyright: © 2014 Tejero et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Instituto de Salud Carlos III (FIS-PI0900547), SDCSD av University of Barcelona og AECC-Catalunya 2013. Rut Tejero, Anna Cordeiro, Marc Ruiz-Martinez er APIF karer fra University of Barcelona. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den vanligste årsaken til kreftdød, med mer enn 226.000 nye tilfeller i USA i 2012 [1]. Åtti prosent av lungekrefttilfellene er ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [2], som har en 5-års overlevelse på bare 10% totalt og 60-70% i stadium I pasienter, fremhever behovet for nye diagnostiske og terapeutiske strategier. Kirurgisk reseksjon, når det er mulig, er fortsatt den eneste kurative behandling for tidlig stadium NSCLC. Men nesten 50% av resected pasientene opplever tilbakefall og har en forferdelig kamp prognose [2]. Flere nye behandlinger i NSCLC er histologi avhengige, og plateepitelkarsinom (SCC) reagerer noe annerledes enn adenokarsinom til visse behandlingsregimer [3], [4] [5]. Men få histologi avhengige prognostiske biomarkører er tilgjengelig for rutinemessig bruk i klinisk praksis, spesielt i resektable pasienter.
I de senere årene, microRNAs (mirnas) har dukket opp som lovende molekylære markører i flere krefttyper, inkludert NSCLC [6 ]. Spesifikke mirnas har blitt beskrevet som histologi spesifikke prognostiske markører for SCC (MIR-146b og MIR-155) [7] eller adenokarsinom (MIR-21) [8].
Den MIR-200 familien er sammensatt av fem medlemmer som befinner seg i to ulike grupper: Mir-200a, MIR-200b og MIR-429 består cluster 1 (kromosom 1), og MIR-200c og MIR-141 består klyngen 2 (kromosom 12). Alle fem mirnas har vært forbundet med reguleringen av epiteliale-mesenchymale (EMT) /mesenchymale-epitelial overgang (MET) [9]. EMT innebærer dype fenotypiske endringer som inkluderer tap av celle-celle adhesjon, tap av celle polaritet, og oppkjøpet av trekkende og invasive egenskaper [10]. Denne prosessen er grunnleggende for embryoutvikling og er også involvert i tumorinvasjon og metastase [11]. Mir-200 familie handling gjennom deres mål ZEB1 og ZEB2 [9] og TGF-β2 [12]. De mirnas er således i stand til å fremtvinge den epiteliale fenotype gjennom post-transkripsjonell undertrykkelse av disse genene, slik at ekspresjon av E-cadherin og av polaritet faktorene som er nødvendige for dannelsen av celle-celle kryss. Mir-200 familien ser ut til å ha en dobbel rolle i pasientens prognose. Overekspresjon av MIR-200 familie fungerer som en markør for bedre resultat i mage- og eggstokk-kreft [13], [14], [15]. I brystkreft [16] og NSCLC [17] I motsetning er høyt uttrykk av MIR-200 familien assosiert med kortere overlevelse. I brystkreft, fremmer MIR-200 familien metastase gjennom en ikke-E-cadherin-relatert mekanisme, målretting
SEC23A
, som formidler sekresjon av metastase undertrykkende proteiner [16]. Men rollen som høye MIR-200 nivåer i NSCLC er ennå ikke klarlagt.
I dette arbeidet har vi analysert rollen som medlemmer av MIR-200 familie i svulster fra resected NSCLC pasienter og korrelert våre funn med total overlevelse (OS) etter operasjonen, både i hele kullet, og i henhold til histologiske subtyper. I tillegg har vi studert de funksjonelle konsekvensene av de prognostiske markører hos NSCLC cellelinjer.
Resultater
Pasienter
Tabell 1 viser de viktigste kliniske kjennetegn for alle 155 pasienter. Median alder var 65 år (fra 35-85) og 87% var menn. Tjueen (13,6%) av pasientene hadde Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) performance status (PS) 0 og 132 (85,2%) hadde PS 1. Ninety-fire (60,6%) av pasientene hadde stadium I sykdom. Sytti-tre (47,1%) av pasientene hadde adenokarsinom og 70 (45,1%) SCC. Ett hundre og trettiåtte (89%) av pasientene var nåværende eller tidligere røykere. Tjue (12,9%) pasienter fikk adjuvant kjemoterapi (16 for stadium II eller III sykdom og fire for stadium I sykdom med T 4 cm). Median oppfølgingstid på 43 måneder (spredning, 2-160). Etter en oppfølging på 160 måneder, hadde 70 (45,2%) av pasientene tilbakefall.
MIR-200 familie uttrykk og kliniske kjennetegn
Paret tumor og normal vevsprøver ble oppnådd fra 155 NSCLC pasienter. De fem medlemmene av MIR-200 finnes i to klynger: Mir-200a /b, og MIR-429 (cluster 1) og Mir-200c og MIR-141 (cluster 2). Alle medlemmer av MIR-200 familien, bortsett fra MIR-141, ble nedregulert i tumor i forhold til normalt vev (MIR-200a, p = 0,043, MIR-200b, p 0,001; MIR-429, p = 0,003, MIR-200c , p. 0,001) (figur S1)
Pasienter med PS 1-2 viste høyere nivåer av MIR-429 (p = 0,039) enn de med PS 0. røykere hadde lavere nivåer av MIR-200A ( p = 0,027) og Mir-429 (p = 0,032) enn aldri-røykere eller tidligere røykere.
MIR-141 og MIR-200c som markører for OS
Bruke tidsavgrensninger definert av Maxstat pakke med R, klassifisert vi pasienter som har høye eller lave nivåer av de fem miRNAs. Av de 155 pasienter i hele kullet, de med høye nivåer av MIR-200c viste en kortere OS (p = 0,024; figur 1A). Blant de 94 pasienter med stadium I sykdom, høye nivåer av MIR-200c (p = 0,019; figur 1B) og MIR-141 (p = 0,03; figur 1C) ble begge assosiert med kortere OS. Ingen signifikante forskjeller i OS ble identifisert i henhold til uttrykket nivåer av de gjenværende mirnas
OS ifølge (A) MIR-200c uttrykk nivåer i hele kullet (N = 155).; (B) MIR-200c uttrykk nivåer i stadium I pasienter (N = 94); og (C) MIR-141 uttrykk nivåer i stadium I pasienter (N = 94).
MIR-141 og MIR-200c i adenokarsinom
ble observert
Ingen forskjeller i OS henhold til uttrykket nivåer av enten MIR-141 eller MIR-200c hos pasienter med SCC (figur 2A og 2B). Men blant pasienter med adenokarsinom, de mirnas identifisert to godt differensierte grupper. Mean OS for adenokarsinom pasienter med høyt MIR-200c uttrykk var 61,2 måneder (95% KI = 42,9 til 79,5), mens det var 145,5 måneder (95% KI = 134,4 til 156,6) for de med lave nivåer (P 0,001; figur 2C ). Mean OS for adenokarsinom pasienter med høyt Mir-141 uttrykk var 71,7 måneder (95% KI = 44,9 til 81,6), mens det var 136,9 måneder (95% KI = 110,9 til 1162,9) for de med lave nivåer (p = 0,009; figur 2D )
Total overlevelse i henhold til (A) MIR-200c uttrykk nivåer hos pasienter med SCC (N = 70).; (B) MIR-141 uttrykk nivåer hos pasienter med SCC (N = 70); (C) MIR-200c uttrykk nivåer hos pasienter med adenokarsinom (N = 73); og (D) MIR-141 uttrykk nivåer hos pasienter med adenokarsinom (N = 73).
Vi analyserte deretter combinatory effekten av MIR-141 og MIR-200c ved å generere en risikoscore basert på uttrykket nivåer av både miRNAs. Pasienter med høye nivåer av både mirnas ble klassifisert som høy risiko, de med lave nivåer av både mirnas som lav-risiko, og de med andre kombinasjoner som middels risiko. Fem år OS var 49,4% for høyrisikopasienter, 66,7% for middels risiko pasienter, og 100% for lav-risiko pasienter (p = 0,002; figur 3).
MIR-200c har en større innvirkning på cellemigrasjon enn MIR-141
Cell migrasjon ble målt med
in vitro
scratch analysen etter transfeksjon med pre-MIR-200c, pre-MIR-141 eller pre-miRNA negative kontroll. Høye nivåer av MIR-200c redusert celle migrasjon sammenlignet med kontrollen i H23 cellelinje (p = 0,005), A-549 (p = 0,0085) og HCC-44 (p = 0,013) (figur 4A). Ingen signifikante forskjeller ble observert for MIR-141, bortsett fra i A-549 (p = 0,043). Etter transfeksjon ble E-cadherin nivåer analysert ved immunhistokjemi (figur 4B) og økte nivåer ble observert i celler transfektert med pre-MIR-200c.
(A) etter 36 eller 48 timer av transfeksjon med pre-mirnas i NSCLC cellelinjer, cellemigrering ble målt ved
in vitro
bunnen av analysen. Høye nivåer av MIR-200c redusert celle migrasjon sammenlignet med kontroll i alle cellelinjer (H23, p = 0,005, A-549, p = 0,0085; HCC-44, p = 0,013), mens høye nivåer av MIR-141 reduserte celle migrering bare i A-549 (p = 0,04). (B) E-cadherin nivåer ble evaluert ved immunhistokjemi og økte nivåer ble observert i celler transfektert med forhånds MIR-200c i sammenligning med de transfektert med pre-MIR-141 eller pre-MIR-kontroll i alle tre cellelinjer.
MIR-141 regulerer negativt KLF6, som fører til økt VEGFA nivåer
in vitro
, og er relatert til høyere microvessel tetthet i pasientprøver
Siden Mir-141 overekspresjon hadde tidligere vært knyttet til høyere blodkardannelse i eggstokkene svulster i musemodeller [18] undersøkte vi den potensielle effekten av denne mekanismen på prognostisk rolle MIR-141 i NSCLC. Ved hjelp TargetScan 6,2 identifiserte vi KLF6 som en antatt mål av MIR-141, men ikke fra MIR-200c. Immunoblotting av KLF6 i H23 celler transfektert med pre-MIR-141or pre-MIR-200c viste at bare MIR-141 betydelig redusert de KLF6 protein nivåer på 24 timer (figur 5A). Siden KLF6 regulerer uttrykket og sekresjon av VEGFA, en kritisk angiogen faktor [19] undersøkte vi effekten av å øke Mir-141 uttrykk nivåer på
VEGFA
nivåer. Vi overexpressed både MIR-141 og MIR-200C i H23, A-549 og HCC-44 NSCLC cellelinjer og behandles cellene med DFX å produsere hypoksi. Etter 48 timer vi analyserte proteinnivåer VEGFA i supernatanten av disse cellene. Overekspresjon av MIR-141 ga en gjennomsnittlig økning på 28% i utslipp av VEGFA (H23, p = 0,04, A-549, p = 0,03, HCC-44, p = 0,02), mens ingen signifikante forskjeller ble observert for speil 200C, bortsett fra i den HCC-44-cellelinjen (p = 0,04) (figur 5B).
(A) Immunoblotting av KLF6 i celler transfektert med forhånds MIR-negativ kontroll eller pre-MIR-141 /200c . MIR-141 signifikant redusert KLF6 proteinnivå i de tre cellelinjer. (B) Etter 48 timer med transfeksjon med pre-mirnas i hypoksiske betingelser ble VEGFA konsentrasjonen i kultursupernatanten målt ved hjelp av ELISA. Alle resultater representerer gjennomsnittet ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter. (C) En total av 29 adenokarsinom tumor vevssnitt ble analysert ved hjelp av immunhistokjemi med CD34 + som kar markør; to representative tilfeller med høye /lave nivåer av MIR-141 vises. (D) ble observert signifikante forskjeller i blodmicrovessel tetthet mellom adenokarsinomer med høye nivåer av MIR-141 og de med lave nivåer av MIR-141 (p 0,001).
Vi ønsket å finne ut om det eksisterer en sammenheng mellom MIR-141 ekspresjonsnivåer og antall blodårer i pasientprøver. Etter bestemmelse av antall blodårer i tumorprøver fra 29 pasienter ved immunhistokjemi, ved hjelp av et antistoff mot CD34 +, som er en markør i blodåren endotelet (figur 5C), klassifisert vi tumorprøvene i to grupper: høye eller lave nivåer av MIR-141. Gjennomsnittlig antall blodkar i svulster med høye nivåer var 22% høyere enn gjennomsnittet i tumorer med lave nivåer (P 0,001; figur 5D)
Multivariate analyser
I den multivariate analysen. i hele kullet, vi inkludert alle kliniske og biologiske faktorer med univariate P≤0.1 og risikoen poengsum basert på MIR-141 og MIR-200c uttrykk. Mir-141 /MIR-200c risikoscore (høy-risiko vs andre) dukket opp som en uavhengig prognostisk markør for kortere OS (OR, 2,787, 95% KI = 1,087 til 7,148; p = 0,033), sammen med scene Jeg og alder . 65 (tabell 2)
I den multivariate analysen inkludert kun adenokarsinom pasienter, Mir-141 /MIR-200c risikoscore var også en uavhengig prognostisk faktor for OS (OR, 10,649; 95% CI = 2,433 til 46,608; p = 0,002) sammen med alderen . 65 (tabell 2)
Diskusjoner
i dette arbeidet, har vi funnet ut at høy speil 141 og MIR-200c uttrykk er forbundet med kortere overlevelse i resected NSCLC adenokarsinom pasienter, inkludert de med tidlig stadium sykdommen. Videre er combinatory effekten av de to mirnas var et uavhengig prognostisk faktor for OS. Forskjellige mekanismer som er involvert i virkningen av disse miRNAs; mens MIR-141 ser ut til å handle gjennom angiogenese ved å hemme
KLF6 Hotell og økende
VEGFA
nivåer, spiller MIR-200c en rolle i reguleringen av MET.
Nylig ble en fenotypisk plastisitet er postulert for transient EMT-MET prosesser [20]. Induksjon av MET ved overekspresjon av MIR-200 familiemedlemmer er viktig på et senere tidspunkt i metastaseprosessen. Mens EMT gjør det mulig for cellen å migrere fra det primære tumor, MET gjør det mulig å kolonisere og produsere metastaser i fjerntliggende organer [10], [11]. Dermed både nedregulering og overekspresjon av MIR-200 familiemedlemmer har vært relatert til dårligere prognose. For å undersøke om regulering av MET av MIR-141 og MIR-200c var histologi avhengig, undersøkte vi deres prognostisk verdi i de to store histologiske subtyper og fant både MIR-141 og MIR-200c var knyttet til OS bare i adenokarsinom pasienter. Det har blitt observert at NSCLC adenokarsinom er et mer mesenchymale lignende tumortypen, siden det har blitt observert at vimentin, en markør for mesenchymale celler, ble overuttrykt i godt differensierte adenokarsinomer og i H23, A-549 og HCC-44 cellelinjer , men ikke oppdaget i SCC vev [21], [22]. I tråd med våre resultater, MIR-200c overekspresjon som en markør for dårlig prognose ble tidligere rapportert i en kohort av 70 NSCLC pasienter som består av både adenokarsinom og SCC histologier [17], men prognostisk verdi ble ikke undersøkt i undergruppen av pasienter med adenokarsinom. Med andre tumormodeller, for eksempel brystkreft, overekspresjon av MIR-200 familiemedlemmer ført til økt metastase [23] og er assosiert med dårlig prognose [16]. I tillegg har høye serumnivåer av MIR-141 vært assosiert med dårlig prognose i tykktarmskreft [24] og høye nivåer av MIR-200c med dårlig prognose i magekreft [25]. I motsetning til et arbeid med data fra en online TCGA database rapporterte at lave nivåer av MIR-200b *, MIR-200A og MIR-429 var knyttet til kortere OS i et heterogent kohort av NSCLC pasienter som inkluderte de med metastatisk sykdom [26] .
Siden mirnas modulere nivåene av flere mål proteiner avhengig av rekkefølgen, er effekten avhengig av proteiner uttrykt i hver celletype [27]. Både MIR-141 og MIR-200c er plassert i samme kromosom region (12p13.31) og har samme transkripsjon start stedet [28], men hvis vi gruppere mirnas av MIR-200 familie i henhold til likheten av sine frø sekvens, kan vi identifisere to ulike klynger – MIR-200BC /429 og MIR-200a /141 – som er differensiert etter en enkelt nukleotid endring [29]. Selv MIR-141 og MIR-200c er transcriptionally regulert på samme måte skiller de seg i sine mål. Når vi analyserte rollen MIR-141 og MIR-200c i EMT /MET i H23, A-549 og HCC-44 cellelinjer, bare MIR-200c påvirket EMT i alle tre cellelinjer. Overekspresjon av MIR-200c økte protein nivåer av E-cadherin og redusert migrering kapasiteten av tumorcellene, som tidligere ble vist ved Ceppi
et al
i et annet panel av NSCLC-cellelinjer. Ceppi
et al
undersøkt uttrykk for MIR-200c
in vitro Hotell og
in vivo
og en sterk invers korrelasjon med invasjonen ble oppdaget. Gjeninnføring av MIR-200c i svært invasive /aggressive NSCLC celler indusert tap av mesenchymale fenotype ved å gjenopprette e-cadherin og redusere N-cadherin uttrykk, og hemmet
in vitro
celle invasjon samt
i vivo
metastasedannelsen [30]. Videre Pacurari et al. fant at MIR-200c downregulation i SCC lungetumorprøver ble korrelert med økte nivåer av DCL1, ATRX og HFE -. biomarkører knyttet til EMT [31]
Selv om MIR-141 er en mir-200 familiemedlem, det var ikke involvert i EMT /MET.
in vitro
overekspresjon av MIR-141 var knyttet til reduksjon av
KLF6
protein nivåer, produsere en økning i utskillelsen av
VEGFA
. Videre tumorer med høye nivåer av MIR-141 hadde et høyere antall blodkar. Det er blitt vist at kreftassosiert fibroblaster (kafeer) isolert fra murine lunge adenokarsinomer utskilte tallrike VEGFA og økt tumorcelle-invasjon i coculture studier [32]. Når vi analyserte uttrykk for MIR-141 i tumor og paret normalt vev, gjorde vi ikke observere signifikante forskjeller i uttrykk nivåer, som fører oss til å spekulere i at den prognostiske rollen MIR-141 kan være relatert til uttrykk i CAF celler i stedet for i tumorceller. Overekspresjon av MIR-141 ville føre til overproduksjon av VEGFA og økt neoangiogenesis, som tidligere har vært knyttet til prognosen i NSCLC [33].
Materialer og metoder
Studier befolkning og etikk uttalelse
Ett hundre og femti-fem voksne pasienter diagnostisert med NSCLC som gjennomgikk komplett kirurgisk reseksjon ved Hospital Clinic i Barcelona, Spania mellom mars 1996 og desember 2009 ble inkludert i studien. Godkjenning for studien ble hentet fra senterets Institutional Review Board, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver deltaker i samsvar med Helsinkideklarasjonen.
RNA ekstraksjon og miRNA analyse
Total RNA og miRNA påvisning ble utført fra FFPE-tumorvev som tidligere beskrevet [34]. Mirna påvisning ble utført ved hjelp av kommersielle tester (TaqMan mikroRNA analyser, Appplied Biosystems)
Western Blot analyse
Western Blot analyse ble utført som tidligere beskrevet [35] ved hjelp av følgende primære antistoffer. KLF6 sc -7158 (Santa Cruz Biotechonology) og α-tubulin (Sigma).
Immunohistochemistry
immunhistokjemiske analysen ble utført som tidligere beskrevet [36] med en Flex monoklonale Mouse Anti-human CD34 Class II klone QBend 10 Ready-to-Use (Dako) og monoklonale Mouse Anti-human E-cadherin Clone NCH-38 (Dako).
Blodkar kvantifisering
Fire uavhengige områder ble valgt under en 40X-feltet, og et 200X-feltet (0,785 mm
2 per felt) og brukes til å telle CD34-positive skip i hvert av disse områdene. To uavhengige patologer undersøkt lysbildene, og gjennomsnittet av fire 200X felt tellinger av CD34-positive fartøy ble registrert.
Cellelinjer, miRNA transfeksjon og VEGF kvantifisering
H23 (American Type Culture Collection) og HCC-44 (DSMZ) celler ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen) inneholdende 10% føtalt kalveserum (Invitrogen). A-549 (DSMZ) celler ble dyrket i DMEM (Invitrogen) inneholdende 10% føtalt kalveserum.
En dag før transfeksjon, 7 x 10
4 celler ble sådd i 6-brønns plater. Dagen etter ble cellene transfektert med 100 nM pre-MIR-141 /200c eller pre-MIR-negativ kontroll # 2 bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Ved 24 timer etter transfeksjon, ble cellene behandlet med 400 uM desferrioksamin å indusere hypoksiske betingelser. Etter 24 timers inkubering ble VEGF konsentrasjon i supernatanter målt i tre eksemplarer med VEGF Menneskelig Elisa Kit (ab100662, Abcam).
Cell migrasjon analyse
Cell migrasjon ble målt med
in vitro
scratch analyse [37]. 5 * 10
5-celler ble sådd i en 12-brønns plate én dag før transfeksjon med pre-mirnas. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellemonolaget skrapet i en rett linje for å skape en «scratch» med en p100 pipettespiss. Migrasjonen avstand (mikrometer) ble vurdert ved 36 h (HCC-44) eller 48 timer (H23 og A-549) etter transfeksjon hjelp cellSense Entry 1.7 programvare (Olympus).
Statistiske analyser
OS ble beregnet fra tidspunktet for operasjonen til dødsdato eller siste oppfølging. Kaplan-Meier kurver for OS, med sine 95% konfidensintervall (CIS), ble trukket og sammenlignet ved hjelp av en log-rank test. Alle faktorer med en p-verdi under 0,1 i univariate analysen ble inkludert i Cox multivariate regresjonsanalyser for OS
Paret t-test ble brukt for å sammenligne uttrykk nivåer av miRNAs mellom svulstvev og paret normalt vev.. Non-paret t-test ble brukt for å sammenligne forskjeller mellom to grupper. Optimale cutoffs av miRNA uttrykk data for OS ble vurdert ved hjelp av maksimalt utvalgte log-rang statistikk ved hjelp av Maxstat pakken (R pakken). Anvendeligheten av disse tidsavgrensninger ble bekreftet av Kaplan-Meier test. Alle statistiske analyser ble utført med PASW Statistikk v18 (SPSS) og R v2.8.1. Signifikansnivået ble satt til ≤0.05.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Expression nivåer av MIR-200 familiemedlemmer hentet fra 155 NSCLC tumor og paret normalt vev. (A) Cluster 1: MIR-200A, MIR-200b, og MIR-429. (B) Cluster. 2: MIR-141 og MIR-200c
doi: 10,1371 /journal.pone.0101899.s001 plakater (TIF)
