Abstract
Bakgrunn
Anaplastisk Lymfom kinase (ALK) positivitet representerer en roman molekylære mål i en undergruppe av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Vi utforsker fluorescens
in situ
Hybridisering (FISH) og Immunohistochemistry (IHC) som diagnostiske metoder for ALK-positive pasienter og for å beskrive dens utbredelse og utfall i en populasjon av NSCLC.
Metoder
NSCLC pasienter som tidligere screenet for epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) ved vår institusjon ble valgt. ALK-positive pasienter ble identifisert ved FISH og verdien av IHC (D5F3) ble utforsket.
Resultater
nittini pasienter ble identifisert. Median alder var 61,5 år (35-83), alle var caucasians, åtti prosent var adenokarsinomer, femtien prosent var menn og trettiåtte prosent var nåværende røykere. Syv (7,1%) av pasientene var ALK positive ved FISH, tretten (13,1%) var EGFR mutant, og 65 (65,6%) var negative /Wild Type (WT) for både ALK og EGFR. ALK positivitet og EGFR mutasjoner var gjensidig utelukkende. ALK-positive pasienter har en tendens til å være yngre enn EGFR muterte eller wt pasienter. ALK-positive pasienter var overveiende aldri røykere (71,4%) og adenokarsinom (71,4%). ALK positive og EGFR muterte pasienter har et bedre resultat enn negative /WT. Alle pasienter med ALK FISH negative tumorer var negative for ALK IHC. Ut av 6 pasienter positive for ALK FISH med mer vev tilgjengelig, fem var positive for ALK IHC og en negativ.
Konklusjoner
ALK-positive pasienter representerer 7,1% av en befolkning på valgt NSCLC. ALK-positive pasienter har ulike kliniske funksjoner og et bedre resultat enn EGFR WT og Alk negative pasienter. IHC er en lovende metode for påvisning av ALK positiv NSCLC
Citation. Martinez P, Hernández-Losa J, M
en Ángeles Montero, CEDRES S, Castellví J, Martinez-Marti A, et al. (2013) Fluorescens
In situ
Hybridisering og Immunohistochemistry som diagnostiske metoder for ALK positiv ikke-småcellet lungekreft pasienter. PLoS ONE 8 (1): e52261. doi: 10,1371 /journal.pone.0052261
Redaktør: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, USA
mottatt: 25 juni 2012; Godkjent: 31 oktober 2012; Publisert: 24 januar 2013
Copyright: © 2013 Martinez et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den hyppigste årsaken til kreft. relaterte dødsfall på verdensbasis, og står for mer enn 1 million dødsfall per år. [1] Selv om cytostatika er fortsatt bærebjelken i behandling for de fleste pasienter med avansert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), [2] identifisering av spesifikke genetiske skader som driver spredning av kreftceller har ført til utvikling av nye target terapi i en undergruppe av pasienter med NSCLC [3], [4]. I de senere år, anaplastisk lymfom kinase (ALK) omleiring, hovedsakelig med den echinoderm mikrotubul-assosiert protein som 4 (EML4) genet, har blitt identifisert som et onkogen aktivitet i en undergruppe av pasienter med NSCLC [4]. ALK trans resulterer i konstitutiv ekspresjon av tyrosinkinasedomene av ALK-protein, noe som resulterer i tumorutvikling og vekst. Den onkogene avhengighet av denne hendelsen er demonstrert på grunnlag av at fjerning ALK kinase aktivitet reverserer ondartet mønster og vekst [5]. Nylig, resultatene i en fase 1-studie som evaluerte en ALK-hemmer, Crizotinib, hos pasienter med ALK positiv NSCLC vist oppløftende resultater [6]. Kliniske studier med Crizotinib og andre ALK-hemmere i denne undergruppe befolkning på ALK positiv NSCLC pasienter er pågående.
Innledende rapporter har vist at ALK positiv NSCLC pasienter har en tendens til å være yngre, hovedsakelig uten /lys røykere med adenokarsinom histologi enn den generelle NSCLC pasienter befolkning [7]. Disse clinicopathological funksjoner er også hyppig hos pasienter med EGFR mutasjoner, men både genetiske hendelser ser ut til å være gjensidig utelukkende [8]. I uselekterte pasienter med NSCLC utbredelsen av ALK positivitet varierer fra 1% til 7% [9], men mer enn 30% hos pasienter valgt for EGFR Wild-Type (WT), adenokarsinom og røyking historie [7]. Dens utbredelse i en valgt europeiske befolkningen av NSCLC det ennå ikke er godt kjent.
Likevel har ALK positiv NSCLC pasienter og deres spesielle characterictics blitt klarlagt, men en klar definisjon av ALK positivitet fortsatt et utfordrende problem. De første rapportene om utbredelsen av EML4-ALK rearrangements brukt RT-PCR for påvisning av pasienter, vanligvis som en retrospektiv analyse av resected prøver fra NSCLC pasienter [4], [9]. Imidlertid er denne metoden ikke kan oppdage ukjente EML4-ALK varianter eller rearrangements med andre partnere forskjellige fra EML4. Nye plattformer har blitt utviklet for å levere denne mangel [10]. For å velge pasienter i Crizotinib studier FISH med en pause fra hverandre sonde til ALK er den diagnostiske metoden. FISH testing tillater påvisning av ALK trans, ingen som teller partner eller variant, men ALK positivitet definisjon av fisk og dens begrenset bruk for å resected eller biopsier er begrensninger [11]. Inmunoshistochemistry (IHC) har også blitt utforsket. IHC analyser ved hjelp av antistoffer mot ALK protein brukes i hematologiske malignances har vist dårlig følsomhet hos pasienter med NSCLC, sannsynligvis på grunn av lavere ALK protein nivåer uttrykt i forhold til hematologiske malignances med ALK rearrangements. Den nye høy følsomhet monoklonalt antistoff D5F3 synes å ha nok nøyaktighet for å identifisere pasienter som skal reproduseres på verdensbasis måte [12], som alle pasienter der det var vev nok i fase 1 Crizotinib rettssak tidligere valgt av FISH positivitet var også positive med IHC , mens kun to av de tre delene av disse pasientene var positive ved RT-PCR. FISH negative prøver og normalt lungevev uttrykte ikke ALK protein av IHC [6]. Nylig har andre diagnostiske metoder er også utforsket [13], [14].
Formålet med denne studien er å kartlegge utbredelsen av ALK positivitet i en europeisk kohort av utvalgte NSCLC pasienter ved FISH, for bedre å definere dens kliniske funksjoner og resultater og, for å utforske IHC som diagnostisk metode testing for ALK i NSCLC.
Pasient og metoder
pasienter
Alle inkluderte pasienter hadde fått behandling eller konsultasjon fra Medical Oncology service på Vall d’Hebron universitetssykehus. Alle NSCLC pasienter som tidligere screenet for EGFR mutasjonsstatus mellom mai 2006 og januar 2010 ble valgt. EGFR mutasjonsanalyser hadde blitt utført basert på en medisinsk sak per sak indikasjon, tar hensyn til kjønn, histologi og røyking historie, men uten faste parametere. Medisinske journaler ble revidert og basal clinicopathological funksjoner, behandlinger og resultater registreres. Hvis vev var tilgjengelig for ALK analyser, pasienter ble først testet av FISH og senere av IHC. Den institusjonelle etiske komité gjennomgått og godkjent denne studien.
tumorprøver
ufargede lysbilder fra formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) viste prøver tatt ved biopsi eller celleblokker rekonstruert fra cytologi eller, fravær av dette, lysbilder fra cytologi ble deretter analysert.
EGFR mutasjonsanalyser
Utvinning DNA.
Prøver innhentet av FNA og FFPE ble fordøyd i 48 timer med proteinase K og 180 mL G2 fordøyelsen buffer ved 37
AC, deretter DNA ble ekstrahert med EZ1 DNA Tissue kit med en Biorobot EZ1 arbeidsstasjon eluere prøvene i 50 mikroliter etter produsentens anvisninger. Konsentrasjon og renhet av det ekstraherte DNA ble bestemt ved spektrofotometri og deretter ble DNA ble lagret ved -20 ° C.
PCR-amplifisering og direkte sekvensering.
PCR ble utført i 30 ul volum ved anvendelse av 50 ng av templat DNA, 0,75 U AmpliTaq Gold-DNA-polymerase (Perkin-Elmer; Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ), 3 ul PCR-buffer (Perkin-Elmer), 0,8 umol /l deoksynukleotidtrifosfat (Promega), 0,5 umol /L av hver primer, og konsentrasjoner av MgCl2, Eksoner 19 og 21 ble amplifisert ved hjelp av PCR. Primer-sekvenser ble oppnådd som beskrevet i tilleggsdata. PCR-program ble utført med 35 sykluser med denaturering ved 94 ° C i 45 s, primer-hybridisering ved 58 ° C i 30 s, og forlengelse ved 72 ° C i 30 sek. En endelig forlengelse fortsatte ved 72 ° C i 10 min. Båndene av PCR-produkter ble visualisert ved elektroforese i gel med Bret. Hver prøve ble sekvensert i to eksemplarer både forover og bakover ved hjelp av BigDye Terminator kit 3,1 (Applied Biosystems, Foster City, California) og en ABI prisme 310 (Applied Biosystems) i henhold til produsentens instruksjoner. Sekvensene ble deretter sammenlignet med GenBank-arkiverte menneskelige sekvens for
EGFR product: (tiltredelse antall AY588246) ved Chromas Pro Software.
EGFR fastsettelse av Real Time PCR.
All saker ble analysert ved hjelp av TheraScreen EGFR PCR Kit (Qiagen. Manchester Ltd) å følge produsentens instruksjoner for å påvise mutasjoner i real-time PCR reaksjoner. Real-time PCR ble utført ved hjelp av en ABI7500Fast (Applied Biosystems, Foster City, California) under følgende betingelser:. Data ble analysert ved hjelp av 7500-programvaren (versjon 2)
Fluorescence
in situ
Hybridisering (FISH)
Vi har utarbeidet 4 mikrometer parafininnstøpte histologiske snitt for FISH analyse. Den kommersielle Vysis LSI
ALK
Dual Color, Break Apart Omorganisering Probe (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Resultatene ble analysert i en fluorescerende mikroskop (Nikon 501) ved bruk av Isis fluorescens imaging system software. Et minimum av 100 kjerner ble scoret. En FISH positiv sak ble definert som å ha mer enn 15% tumorceller som viser skilt grønne og røde signaler eller enkelt røde signaler identifisert celler med omorganiseres
ALK
. FISH ble utført og analysert ved to forskjellige patologer.
Immnunohistochemistry
I korthet 3 mikrometer tykke seksjoner ble kuttet fra vevsprøver og plassert på poly-L-lysin-belagte glassplater. Alle lysbildene ble farget med ALK antistoff (klone D5F3 Cell Signalering Technology) fortynnet 1:50 ved hjelp av en Ventana Ultra DAB deteksjon kit i en Ventana BenchMark XT-prosessor (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ). Antigen gjenfinning var en standard automatisert prosess på Ventana BenchMark XT ved 37 ° C i 16 minutter. Alle lysbildene ble analysert ved to forskjellige patologer og klassifisert. Prøvene ble ansett å være IHC-positiv hvis en tumor-spesifikk farging i alle intensitet i ≥10% av tumorcellene var til stede.
Statistiske analyser
Med mindre annet er angitt, for analysene av kliniske og molekylære markører på pasientprøvene ble Fishers eksakte test brukes for å vurdere korrelasjon mellom kategoriske variabler, og Student «s t-test ble anvendt for å vurdere assosiasjon mellom de fordelinger av behandlingsresultat. Alle rapporterte p-verdiene er tosidig med mindre annet er spesifisert, og vi vurderte en test som statistisk signifikant hvis p≤0.05. Å sammenligne sammenhengen mellom fisk og IHC å oppdage ALK-positive pasienter vi brukte en kappa metode.
Resultater
Mellom mai 2006 og januar 2010 til sammen 99 pasienter som tidligere undersøkt for EGFR mutasjoner med vev tilgjengelig for ALK-analyser av fisk ble identifisert. Tilgjengeligheten av vev for fisk og IHC analyser ble vurdert som positivt ved eksistensen av en FFPE blokk eller lysbilder fra cytologi i arkivene til vår institusjon. Etter studier prosedyrer, var det ikke nok vevet for å utføre en gyldig FISH-analyse i 14 pasienter. For IHC analyse dette tallet var høyere, på 19 pasienter.
Basal kjennetegn ved pasientene er oppsummert i tabell 1 (tabell 1). Pasientene var hovedsakelig adenokarsinomer (80%) og aldri /tidligere røykere (62%) med lik fordeling for kjønn.
Av de 99 tumorprøver skjermet, 13 pasienter (13,1%) hadde en aktiverende EGFR mutasjon og 7 pasienter (7,1%) var ALK positive og 65 pasienter (65,7%) var EGFR WT og ALK negativ, og i 14 pasienter (14,1%) det var ikke nok vevet for å utføre en gyldig FISH-analyse for ALK (tabell 2). EGFR mutasjon og ALK positivitet var gjensidig utelukkende.
ALK-positive pasienter har en tendens til å være yngre (56 år) enn EGFR muterte (63 år) eller EFGR WT /ALK negative (62 år) pasienter, men disse forskjellene var ikke statistisk forskjellig. Det var ikke noen klar kjønn Prevalensen for ALK-positive pasienter (4 tisper og 3 hanner). Fem av dem var aldri-røykere (71%) og 2 var røykere på diagnosetidspunktet. Alle ALK-positive pasienter hadde en ikke plateepitel histologi, 5 av 7 pasienter var adenokarsinom og de andre 2 pasienter hadde ikke ellers spesifisert (NOS) NSCLC. Fire av de 5 ALK positiv adenokarsinom pasientene viste en solid og acinar vekstmønster og, i tillegg, fire av de fem viste et mønster med signerte ring celler var til stede. (Figur 1)
FISH analyse ved hjelp av en pause fra hverandre sonde. Positive celler viser en sammensmelting av de røde og grønne signaler som tilsvarer intakt kromosom, og de delte signaler som indikerer den ALK-omleiring (piler). Immunhistokjemi for ALK i en NSCLC hjelp D5F3 antistoff. Tumorcelle viser cytoplasmisk ekspresjon av proteinet, mens resten av cellene er fullstendig negativ (20 x).
EGFR mutante pasienter hadde også en overveiende adenokarsinom histologi (100%) og var hovedsakelig ikke-røykere (71 %), men med en klar kjønns predisposisjon for kvinner (77%).
EGFR vekt /ALK negativ gruppe, og EGFR vekt /ALK ukjent gruppe ikke skiller seg i sine basal egenskaper og var sammenlignbare med egenskapene hele kullet av 99 pasienter.
Vi har også utforsket den beste klinisk respons med en EGFR TKI eller platinumbasert kjemoterapi i metastatisk eller tilbakefall pasienter i henhold til EGFR og ALK status. Som forventet, ALK-positive pasienter behandlet med erlotinib hadde ingen objektive svar; imidlertid, er bare to ALK-positive pasienter blitt behandlet med EGFR-TKI-tallet. Ingen svar for EGFR vekt /ALK negative pasienter ble sett ble behandlet med en EGFR TKI. I motsetning til dette, ble et 75% av reaksjoner sees blant gruppen av EGFR mutante pasienter. Svar på første platinumbasert kjemoterapi var 29% for ALK-positive pasienter, 60% for EGFR muterte pasienter og 40% for EGFR WT /ALK negativ. (Tabell 3)
På tidspunktet for analyse, median oppfølging av de 65 pasienter med avansert /residiverende NSCLC var 9,5 måneder blant pasientene fortsatt i live; på den tiden, hadde 57 pasienter døde. Vi analyserte total overlevelse (OS) av pasientene i henhold til ALK og EGFR genotype. Median OS for EGFR vekt /ALK negative pasienter var 4,5 måneder, for EGFR muterte pasientene var 15,7 måneder (p = 0,018) og hadde blitt ikke nådd for ALK-positive pasienter (p = 0,103). I ALK positiv gruppen var det fire pasienter (av totalt sju) som hadde fått crizotinib som en del av sin behandling på en gang i løpet av sin sykdom. (Figur 2)
Til slutt utførte vi en ALK IHC med D5F8 antistoff på 80 pasienter der det var materialet fortsatt tilgjengelig etter EGFR og FISH analyser (figur 3). Alle 73 pasienter negative for ALK av fisk ble også negativt for IHC. Av seks ALK FISH-positive pasienter testet for IHC, fem var positiv og en negativ. Dette resulterer i en positiv prediktiv verdi for IHC med D5F8 antistoff på 100% og en global god avtale (Kappa 0,783, utvalg 0,642 til 0,924) (tabell 4).
Diskusjoner
ALK-aktivering har blitt identifisert som en sjåfør onkogen endring i en undergruppe av pasienter med NSCLC. Rearrangementer som involverer ALK-genet er et eksempel på onkogen avhengighet. ALK-positive pasienter viser hovedsakelig et adenokarsinom histologi, aldri /lys røyking historie og yngre alder ved diagnose. Utvikling av nye legemidler rettet mot denne endringen førte til imponerende tumorrespons i denne undergruppe av pasienter. Nylig, crizotinib, et lite molekyl som inhiberer tyrosin kinase aktiviteten til ALK, har blitt godkjent for behandling av pasienter med avansert ALK positiv NSCLC etter imponerende resultater i tidlige studier [6]. Samtidig har en diagnostisk molekylær FISH testen er godkjent av Food and Drug Administration for å oppdage ALK-positive pasienter. Samlet utgjør disse to fakta, viser hvor viktig er i en tid med target terapi for å identifisere og validere en biomarkør for å velge de pasientene mer egnet for å oppnå en fordel, selv siden de tidligste utvikling.
I vår rapport, velger vi en undergruppe av pasienter på grunnlag av at tidligere bestemmelse av EGFR status la oss til å identifisere en pasientpopulasjon mer egnet til å huse en ALK endring. Dette kriterier, ved hjelp av en biomarkør, ville la oss identifisere en beriket populasjon av NSCLC pasienter som molekylære funksjoner ble vurdert som klinisk relevant. I denne kohort, utbredelsen av EGFR mutasjoner var 13,1%, som er nær frekvensen rapportert av spansk Lung Cancer gruppen i en tilsvarende populasjon [15], som indirekte indikerer at vår valgt befolkning representerer den globale mengden av pasienter hvilken velger for EGFR screening i rutinemessig praksis. ALK-positive pasienter ved FISH representerer i vår studie en 7.1% av totalen, som er konkordant med publikasjoner av andre forskere i denne populasjonen av pasienter [7] – [9], [16] og er den første ALK utbredelsen rapporten i en kohort av overveiende metastatiske europeiske NSCLC pasienter.
Som tidligere rapportert, ALK-positive pasienter var overveiende adenokarsinomer, med lav tidligere røykehistorie og har en tendens til å være yngre enn mengden av NSCLC pasienter. Derfor gjorde ALK-positive pasienter ikke viser respons på EGFR-TKI-tallet, men en tilsvarende ytelse fra kjemoterapi enn ALK negative pasienter. Selv om tidligere rapporter har antyder at pemetrexed kan være den foretrukne kjemoterapeutiske middel for ALK-positive pasienter [17], [18], på grunn av den lille størrelsen av vår ALK positiv populasjonen var vi ikke i stand til å utføre denne analyse. Interessant, to av ALK-positive pasienter i vår serie var nåværende røykere i øyeblikket for diagnosen.
Nyere data tyder på at i fravær av ALK målrettede midler alk positivitet er en ugunstig prognostisk faktor for NSCLC pasienter [19 ]. Men hos pasienter med avansert, ALK-positive NSCLC er crizotinib behandling assosiert med økt overlevelse sammenlignet med den crizotinib-naive kontroller [20]. I vår studie analized vi overleve i henhold til molekylær status uavhengig av å bli behandlet med crizotinib eller annen ALK hemmer og finner ut at de ALK positiv NSCLC pasienter har en tendens til å leve lenger enn EGFR vekt /ALK negative pasienter. Vi gjorde ikke utføre en analyse av overlevelse for ALK-positive pasienter justering for crizotinib behandling på grunn av den lille størrelsen på kullet. Ikke desto mindre, fire av de ALK-positive pasienter var blitt behandlet med crizotinib i det øyeblikk den overlevelsesanalyse. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at i den tiden av ALK målet terapi, ALK positiv NSCLC pasienter har et bedre resultat enn EGFR WT /ALK negative pasienter. Imidlertid bør disse resultatene analized med forsiktighet, er en av de seleksjonsskjevhet i denne studien at pasienter med en dårligere status ytelse enn generelle lungekreftpasienter hadde blitt inkludert. Hovedårsaken til at bias er at pasienter med bedre ytelse hadde blitt rekruttert inn i kliniske studier og EGFR ble ikke testet på vår lokale laboratorium. En annen mulig skjevhet er at pasienter med dårlig ytelse o større komorbiditet EGFR mutasjonsstatus ble analysert som disse pasientene var ikke egnet til å motta annen form for behandling enn EGFR-TKI er hvis en EGFR mutasjon ble demonstrert. Begge skjevheter kan beriket vår kohort med pasienter med dårligere resultater og dermed bare 15 pasienter EGFR vekt /ALK negative pasienter ble behandlet med en platinun basert kjemoterapi.
En viktig sak for klinikere er å identifisere de pasientene egnede for behandling med crizotinib. FISH-analyse er den standard metode. Imidlertid IHC har blitt undersøkt av to forskjellige grupper i et forsøk på å identifisere en mer verdensomspennende egnet metode for screening og diagnostisering av ALK-positive pasienter. Først antistoffer, som tidligere anvendt for diagnose av haemathological malignances, viste ikke har tilstrekkelig følsomhet til å bli brukt i ALK-positive pasienter [12]. Siden dem, har to høy følsomhet strategier blitt utforsket. En av dem er å forbedre teste følsomheten og for å utvikle en IHC poengsum for utvelgelse av pasienter for FISH-analyse [21], [22]. En annen tilnærming er å utvikles høy sensitivitet og spesifisitet ALK antistoffer som førte identifisere ALK-positive pasienter i seg selv [23], [24]. I vår studie har vi brukt en ny høy sensitivitet og spesifisitet monoklonalt antistoff D5F3 i en kohort av utvalgte pasienter med NSCLC parallelt med fisk for å identifisere ALK-positive pasienter. Vi fant ut at alle ALK-positive pasienter med IHC var også positive ved FISH. Men en FISH-positiv pasient resulterte negativ med IHC. Det falske negative pasienten hadde ingen flere vev er tilgjengelig for å gjenta analysen, men tidligere har blitt rekruttert i en crizotinib studie med en annen positiv FISH-analyse i det sentrale laboratorium av studien. Til sammen kan vi konkludere med at en positiv IHC analyse med D5F3 monoklonalt antistoff bør være nok til å velge en pasient for å motta behandling med en ALK-hemmer som ingen pasienter positive for IHC ble funnet å være negativ med FISH. Når en kliniker bør vurdere å utføre en FISH analyse hos en pasient med et negativt resultat av IHC, eller omvendt, er et spørsmål som bør tas opp i fremtiden. Enda mer, hva er meningen med en FISH test positivitet i mindre enn 15% av cellene eller hva som bør gjøres med de pasienter uten samstemmige resultater med IHC og FISH er noen av de om saker som skal standardiseres i fremtiden.
for å konkludere, i vår studie viste vi at utbredelsen av ALK-positive pasienter er 7,1% i en kaukasisk valgt befolkning på NSCLC av fisk. I den æra av ALK målrettede behandlinger ALK-positive pasienter har ulike kliniske egenskaper og en bedre prognostisk enn EGFR WT og Alk negative pasienter. IHC med D5F3 monoklonalt antistoff mot ALK er en nøyaktig metode for påvisning av ALK positiv NSCLC pasienter.
