Abstract
mikroRNA (MIR) -150 har blitt rapportert å være dramatisk nedregulert i human epitelial eggstokkreft (EOC) vev og pasientenes serum sammenlignet med normale kontroller. Denne studien hadde som mål å undersøke klinisk betydning og molekylære mekanismer av MIR-150 i EOC. I denne studien, kvantitativ real-time PCR-analyse viste at MIR-150 var signifikant nedregulert i menneskelige EOC vev sammenlignet med normale vevsprøver. Deretter viste vi de betydelige sammenslutninger av MIR-150 downregulation med aggressive clinicopathological funksjoner i EOC pasienter, inkludert høy klinisk stadium og patologisk karakter, og kortere overordnede og progresjonsfrie overlevelse. Enda viktigere, multivariat analyse identifiserte Mir-150 uttrykk som en selvstendig prognostisk biomarkør i EOC. Etter det luciferaserapportørplasmid analyser viste at sink Finger E-Box Binding Homeobox 1 (ZEB1), en viktig regulator av epitelial til mesenchymale overgang (EMT), var et direkte mål på MIR-150 i EOC celler. Videre fant vi at ektopisk uttrykk for MIR-150 kan effektivt hemme celleproliferasjon, invasjon og metastasering ved å undertrykke uttrykket av ZEB1. Videre har vi også observert en signifikant negativ korrelasjon mellom MIR-150 og ZEB1 mRNA uttrykk i EOC vev (rs = -0,45, p 0,001). I konklusjonen, disse funnene tilby overbevisende bevis for at avvikende uttrykk for MIR-150 kan spille en rolle i tumorprogresjon og prognose hos pasienter med EOC. Videre våre data viser at MIR-150 kan fungere som en tumor suppressor og modulere EOC celleproliferasjon, og invasjon av direkte og negativt regulere ZEB1, noe som tyder på gjen uttrykk for MIR-150 kan være en potensiell terapeutisk strategi for EOC.
Citation: Jin M, Yang Z, Ye W, Xu H, Hua X (2014) mikroRNA-150 Spår en gunstig prognose hos pasienter med ovarialcancer, og Hemmer Cell Invasion og metastaser ved å undertrykke Transkripsjonell Repressor ZEB1. PLoS ONE 9 (8): e103965. doi: 10,1371 /journal.pone.0103965
Redaktør: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Forskningssenter, Saudi-Arabia
mottatt: May 25, 2014; Godkjent: 09.07.2014; Publisert: 04.08.2014
Copyright: © 2014 Jin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Foundation of Shanghai Municipal Health Bureau (No. 20114y079) Natural Science; Medisin og Foundation Engineering av Shanghai Jiaotong University (No. YG2011MS33). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer (EOC) representerer den femte mest dødelige gynekologisk kreft og stammer fra eggstokkene overflaten, inkludering cyster i eggstokkene parenchyma, eller fra den nærliggende distal egglederen epitel [1]. Fordi det er få effektive biomarkører og behandlingsformer, er EOC en aggressiv sykdom som forårsaker anslagsvis 125.000 dødsfall over hele verden hvert år [2]. Fem års overlevelse av pasienter med EOC er kritisk avhengig av den kliniske scenen på pasientenes diagnose; hvis diagnostisert og behandlet mens lokalisert (stadium I og II), 5-års overlevelse kan nå over 90% [3]. Imidlertid er de fleste EOC pasienter diagnostisert avansert sykdom (trinn III og IV) hvor 5-års overlevelse er bare 30-40% [4]. Disse dataene tyder på at det kliniske resultatet av EOC pasienter kan være betydelig høyere med tidlig diagnose er imidlertid for tiden er det ingen ikke-invasiv metode for nøyaktig bestemmelse av EOC på et tidlig stadium. Gitt dette scenariet, utvikling av nye og effektive diagnostiske og prognostiske molekylære biomarkører for EOC er nødvendig.
microRNAs (mirnas), som en ny klasse av små ikke-kodende enkelt-strandet RNA, har nylig blitt vist å regulere gen uttrykket post-transkripsjonelt gjennom basepar komplementære til de bindingsseter på den 3′-UTR av mål-mRNA, som fører til mål-mRNA spalting eller translasjonsbevegelse undertrykkelse [5]. Ved å binde seg med deres målgener, blir mirnas implisert i forskjellige biologiske prosesser, inkludert celle proliferasjon, apoptose og celledifferensiering [6]. En økende bevis har rapportert at mirnas kan spille viktige roller i kreftcelle invasjon og metastasering. Spesielt i EOC, Yeh et al. [7] indikerte at nedregulering av miRNA-138 i de meget invasive cellene, og den virker som en inhibitor av cellemigrering og invasjon; Wang et al. [8] fant at MIR-182 kan fungere som en onkogen miRNA og fremme kreft celle vekst, invasjon, og chemoresistance ved å målrette PDCD4 i EOC celler; Wu et al. [9] antydet at MIR-145 kan modulere EOC vekst og invasjon ved å undertrykke p70S6K1 og MUC1, fungerer som en tumor suppressor. Disse tidligere studier gitt innledende ledetråder for bidragene fra tap eller gevinst funksjon av spesifikke miRNAs til tumorigenesis og kreft progresjon av EOC.
MiR-150, lokalisert på kromosom 19q13 har blitt antydet som en blodkreft spesifikke miRNA i malignt lymfom og har blitt observert å være vesentlig nedregulert i tumorceller sammenlignet med friske celler [10]. Den unormale ekspresjon av MIR-150 er også funnet i andre forskjellige faste tumorvev, som lungekreft, magekreft, tykktarmskreft, livmorkreft, EOC, og kreft i bukspyttkjertelen [11] – [16]. Spesielt, Vang et al. [14] fant at MIR-150 vises lav uttrykk i de fleste primære EOC vev; Shapira et al. [15] rapporterte også at MIR-150 viste minst 10 ganger reduksjon i uttrykk i pre-kirurgisk plasmaprøver fra kvinner diagnostisert med EOC sammenlignet med plasmaprøver fra kvinner uten kjent tumor i bekkenet (friske kontroller). Disse funnene antyder en mulig rolle MIR-150 i menneskelig EOC, som blir bedt oss om å identifisere og funksjonelt validere MIR-150-forbundet klinisk betydning og molekylære mekanismer i EOC.
Materialer og metoder
pasienter og vevsprøver
Kliniske prøver ble innhentet fra Xinhua sykehus, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Kina. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og studien ble godkjent av etikkomiteen av Xinhua sykehus, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Kina.
For kvantitativ real-time PCR assay, 100 EOC vevsprøver og 10 normal eggstokkvev prøvene ble snap-frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C etter operasjonen som ble utført ved Institutt for obstetrikk og gynekologi, Xinhua sykehus, Shanghai Jiaotong University School of Medicine fra desember 2006 til januar 2008. Alle 10 normal eggstokkreft vev ble oppnådd fra kvinner som gjennomgikk hysterektomier for godartet sykdom. Alle EOC pasienter ble behandlet uten preoperativ strålebehandling, kjemoterapi eller hormonbehandling. Kirurgisk iscenesettelse ble etablert i henhold til International Federation of gynekologi og fødselshjelp (FIGO) system. De kliniske funksjonene 100 EOC pasienter ble oppsummert i tabell 1.
Regelmessig oppfølging (variasjon: 2.08-119.06 måneder, 62.86 måneder i median, 62.66 måneder i gjennomsnitt) ble utført etter behandling av alle 100 EOC pasienter som deltok i studien, med sin overlevelse, dødsdato og dato for siste oppfølging blir registrert. Total overlevelse (OS) ble definert som tidsintervallet fra dato for diagnose på vårt senter til dødsdato eller siste oppfølging. Progresjonsfri overlevelse (PFS) ble definert som tidsintervallet fra diagnose på vårt senter til progressiv sykdom, død av andre årsaker enn progresjon, eller en annen primær kreft.
Cell kultur
menneskelig eggstokkene serøs cystisk adenokarsinom cellelinje OVCAR3 og menneskelig serøs papillær cystisk adenokarsinom cellelinje SKOV3 ble kjøpt fra American Tissue Type Collection (Manassas, Virginia). Begge cellelinjer er egnede verter transfeksjonsmidler. Alle celler ble dyrket i RPMI-1640 medium supplementert med 10% føtalt kalveserum (GIBCO) i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C.
RNA og miRNA ekstraksjon
for mRNA kvantifisering, total RNA fra cellelinjer og vev ble hentet ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. For miRNA kvantifisering, ble total miRNA hentet fra cellelinjer og vev ved hjelp av Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
kvantitativ real-time PCR-analyse
for mRNA og miRNA quantifications ble kvantitativ real-time PCR-analyse utføres for å henholdsvis oppdage uttrykket nivåer av MIR-150 og ZEB1 i cellelinjer og vev. I korthet ble 10 ug av små RNA og 20 ug av total-RNA ble utsatt for revers transkripsjon. CDNA ble anvendt for amplifikasjon av modne MIR-150, ZEB1 og de endogene kontroller, U6 og β-aktin, ved PCR. PCR-primere som ble anvendt var som følger: MIR-150 fremover, 5′-CAG TAT TCT CTC CCA ACC CTT GTA-3 «og revers 5′-AAT TGA GGA TCT CGT CAG TCT GTT-3′, U6 fremover, 5»- ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3 «og omvendt, 5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′; ZEB1 fremover 5»-CAG GCA GAT GAA GCA GGA TG-3 «og revers 5′-CAG CAG TGT CTT GTT GTT GTA G-3′; β-aktin fremover 5»-GGC GGC ACC ACC ATG TAC CCT-3 «og revers 5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3». PCR-betingelsene var:. Innledende denaturering ved 95 ° C i 3 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s, 62 ° C i 30 s, og 72 ° C i 30 sek
Real- time PCR ble utført ved hjelp av SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems) på en ABI 7300HT real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Standardkurver ble generert, og den relative mengde av MIR-150 eller ZEB1 var normalisert til mengden av U6 eller β-aktin, respektivt. Relativ kvantifisering av mål genekspresjon ble evaluert ved hjelp av to
-. △△ CT metode
Konstruksjon av ekspresjonsvektorer og celle transfeksjon
pcDNA_6.2-GW /EmGFP-MIR plasmid vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med en spectinomycin resistent gen ble anvendt for å konstruere en MIR-150 overekspresjon plasmid. En 62 bp DNA fragment med moden MIR-150 eller en negativ kontroll (NC) manglende samsvar sekvensen ble kjemisk syntetisert og lagt til denne vektoren ved Shanghai Shenggong Biotech (Shanghai, Kina).
EOC cellene ble høstet og sådd ut 6-brønns plater med 70-80% konfluens over natten før transfeksjon. HSA-MIR-150 vektor og NC ble transfektert med Lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i en konsentrasjon på 100 nM i 48 timer ved 37 ° C i henhold til produsentens anvisninger.
ZEB1 siRNA og celle transfeksjon
ZEB1 siRNA (siRNA-ZEB1) og kontroll siRNA (siRNA-NC) ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA) og ble transfektert inn i EOC celler i logaritmisk vekstfase ved hjelp Lipofectamine 2000 liposom (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) ved en konsentrasjon på 100 nM i 48 timer ved 37 ° C i henhold til produsentens instruksjon. Ekspresjonsnivået av ZEB1 ble påvist ved Western blot for å bestemme interferenseffekten for ZEB1.
Western blot-analyse
EOC-celler ble høstet 72 timer etter transient transfeksjon og western blot-analyse ble utført for å påvise uttrykket nivåer av ZEB1 protein. Celler ble lysert ved bruk av RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS). Proteinene ble gjenoppløst på en SDS-denaturerende polyakrylamidgel og deretter overført på en nitrocellulosemembran. Filtrene ble blokkert i PBS-Tween skummet melk og undersøkt med anti-ZEB1 antistoff (fortynning 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) eller undersøkt med anti-β-actin antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) . β-aktin ble benyttet som en intern kontroll for normalisering av kandidatgener. Membranene ble vasket og inkubert med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoffer. Proteinekspresjon ble bestemt ved forsterket kjemiluminescens og eksponering for kjemiluminescens film (Pierce Bioteknologi).
luciferase reporter-analyse
3′-UTR av ZEB1 mRNA ble klonet og innsatt i nedstrøms for luciferse gen i pGL3 /luciferase vektor (Promega, Madison, WI, USA). Mutanten 3′-UTR av ZEB1 mRNA ble klonet ved anvendelse av villtype 3′-UTR som en mal og satt inn i pGL3 /luciferase som beskrevet for villtype-3′-UTR. EOC celler ble dyrket i 24-brønners plater og var co-transfektert med Mir-150 etterligner og pGL3-ZEB1-vekt eller pGL3-ZEB1-mut. På 48 timer etter transfeksjon, ble EOC cellene høstet og luciferase aktivitet ble målt ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega, Madison, WI, USA) etter produsentens anvisninger. De Renilla luciferase-aktivitet ble anvendt som en intern kontroll. Eksperimentene ble utført i triplikat uavhengig av hverandre.
In vitro celle-proliferasjonsanalyse
in vitro celle proliferasjon av EOC-celler transfektert med HSA-MIR-150 vektoren og NC-vektoren ble bestemt ved 24, 48 og 72 timer ved hjelp av CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens protokoll. Absorbansen ved 490 nm ble målt ved anvendelse av en Microplate mQuant Universal spektrofotometer (BioTek, Winooski, VT). Data er presentert som middelverdi for triplikate eksperimenter.
In vitro-assay invasjon
invasjon evne EOC-celler transfektert med HSA-MIR-150 vektoren og NC vektor ble testet i Matrigel belagt celle kulturkamre (8 um porestørrelse, Millipore, Billerica, MA, USA). EOC-celler ble transfektert og dyrket til konfluens eller i nærheten av ( 90%) konfluens i 24-brønners skåler. Deretter ble EOC cellene resuspendert i 200 ul serumfritt medium 1640 ble plassert inn i det øvre kammer av innsatsen med Matrigel. Medium med 5% FBS ble tilsatt til de nedre kamre som et kjemotiltrekkende. Etter 24 timer inkubering ble cellene igjen på den øvre membranen forsiktig fjernet. Celler som hadde invadert gjennom membranen ble manuelt telles på 200 × forstørrelse fra ti forskjellige felt av hvert filter. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
In vitro migrasjon analysen
migrasjon evne EOC celler transfektert med HSA-MIR-150 vektor og NC vektor ble testet i Corning transwell sette kamre. I korthet, 48 timer etter transfeksjon, ble EOC cellene resuspendert i 200 ul serumfritt medium 1640 ble plassert inn i det øvre kammer av innsatsen uten Matrigel. Medium med 5% FBS ble tilsatt til de nedre kamre som et kjemotiltrekkende. Etter 24 timer inkubering ble cellene igjen på den øvre membranen forsiktig fjernet. Celler som hadde migrert gjennom membranen ble manuelt telles på 200 × forstørrelse fra ti forskjellige felt av hvert filter. Alle forsøk ble utført in triplo.
Statistisk analyse
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E. Sammenligninger mellom grupper ble utført ved hjelp av Kruskal- Wallis test for kontinuerlige variabler og χ
2 test for kategoriske variabler. Kaplan-Meier metoden ble brukt for overlevelsesanalyse, og forskjeller i overlevelse ble beregnet ved bruk av log-rank test. ble utført en multivariat overlevelsesanalyse for alle parametre som var betydelig i de univariate analysene ved hjelp av Cox regresjonsmodellen. P 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
nedregulering av MIR-150 i menneske EOC vev
Expression nivå av MIR-150 i 100 EOC vevsprøver og 10 normal eggstokkene. vevsprøver ble påvist ved QRT-PCR og normalisert til RNU6B. Som et resultat av ekspresjonsnivået av MIR-150 i EOC vev var signifikant lavere enn i normale eggstokk-vev (EOC vs. Normal: 2,38 ± 0,80 vs 3,83 ± 0,77, P 0,001, figur 1). Medianverdien (2,36) av MIR-150-ekspresjon i alle EOC vev som detekteres av QRT-PCR ble anvendt som en cutoff punkt for å klassifisert 100 EOC pasienter inn i MIR-150-lav (n = 58 58,00%) og MIR-150- . høy (n = 42, 42,00%) ekspresjonssystemer grupper
resultatene viste at ekspresjonsnivået av MIR-150 i EOC vev var signifikant lavere enn i normale eggstokk-vev (EOC vs. Normal: 2,38 ± 0,80 vs. 3,83 ± 0,77, P . 0.001)
nedregulering av MIR-150 medarbeidere med aggressiv tumorprogresjon av menneskelig EOC
Tabell 1 viser sammenhengen mellom ulike clinicopathologic variabler og MIR -150 uttrykk nivåer i vevsprøver fra EOC pasienter. EOC vev med fremskreden klinisk stadium (III~IV) viste oftere lav MIR-150 uttrykk enn de med lav klinisk stadium (I~II, p = 0,005, tabell 1). I tillegg MIR-150 uttrykk viste en trend som korrelert med patologisk Karakter (P = 0,02, tabell 1). Vi fant ut at MIR-150 ble abnormt nedregulert i tumorvev med høy patologisk klasse sammenlignet med de med lav patologisk karakter. Men MIR-150 uttrykk var ikke forbundet med andre clinicopathologic variabler, som alder, klasse, histologisk type og resttumor etter kirurgi (alle P 0,05).
nedregulering av MIR-150 medarbeidere med dårlig prognose hos pasienter med EOCs
OS og PFS kurver ble plottet i henhold til uttrykket nivået av MIR-150 i vevsprøver fra EOC pasienter ved Kaplan-Meier metoden. Som vist i figur 2, EOC pasienter med lav Mir-150 uttrykk hadde signifikant kortere ordnede (P 0.001, figur 2A) og progresjonsfri (P 0,001, figur 2B) overlevelse enn de med høy Mir-150 uttrykk gjorde
ovarialcancer pasienter med lav Mir-150 uttrykk hadde signifikant kortere samlet (P 0,001) og progresjonsfri (P 0,001) overlevelse enn de med høy Mir-150 uttrykk gjorde
.
Univariat analyse med Cox modell identifisert tre prognostiske faktorer: klinisk stadium, patologisk karakter og Mir-150 uttrykk. De andre clinicopathological funksjoner, for eksempel alder, klasse, histologisk type og resttumor etter operasjonen, var ikke statistisk signifikante prognostiske faktorer (tabell 2). En multivariat analyse av prognosefaktorer med en Cox-modell bekreftet at klinisk stadium og Mir-150 uttrykk var to signifikante uavhengige prediktorer for både OS og PFS hos pasienter med EOC (tabell 3).
miRNA-150 mål ZEB1 i EOC vev
for å finne ut hvordan downregulation i Mir-150 uttrykk kan fremme tumorprogresjon, kandidaten målgener av MIR-150 ble samlet inn fra miRTarBase (Slipp 4.5: november 1, 2013, https://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/), som har samlet mer enn femti tusen miRNA-målet interaksjoner (MTIs), som er samlet ved manuelt å kartlegge relevant litteratur etter data mining av teksten systematisk å filtrere forskningsartikler knyttet til funksjonelle studier av mirnas [17], [18]. I denne studien har vi bare valgt kandidat målgener som ble validert eksperimentelt ved reporter analysen, western blot og kvantitativ real-time PCR. Som et resultat ble tre gener som MYB, EGR2 og ZEB1, valgte kandidat målgener av MIR-150. I tillegg ble RNAhybrid (versjon 2.1, https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission.html) brukes til å beregne minimum fri energi (MFE) av duplex miRNA: mRNA [19]. Den miRNA er hybridisert til målet i en energisk optimal måte. RNAhybrid ble optimalisert for å vise hybridisering ved 3’UTR av målgener. Den duplex miRNA: mRNA med lavere MFE er mer stabil enn det med høyere MFE. Som et resultat av MFE verdiene av MIR-150: MYB, MIR-150: EGR2 og MIR-150: ZEB1 var henholdsvis -11,51 kcal /mol, -14,30 kcal /mol og -18,00 kcal /mol. Den duplex MIR-150: ZEB1 har den beste MFE derfor vi valgte ZEB1 som kandidat target gen for MIR-150 i den videre valideringsforsøk
For å verifisere at kandidaten målet for HSA-speil. 150, transfektert vi EOC celler med HSA-MIR-150 vektor, negativ vektor (NC), og blank kontroll kulturmedium (mock), henholdsvis. På 24 timer etter transfeksjon, ble western blot analyse utført og resultatene i figur 3A~B viste at tvangs uttrykk for HSA-MIR-150 førte til en markert nedgang i uttrykket nivåer av endogen ZEB1 protein i forhold til EOC celler transfektert med NC eller håne (SKOV3 og OVCAR3 cellegrupper: både P 0,001). I tillegg ble luciferase reporter-målingen ble utført ved ko-transfeksjon av MIR-150 og et luciferase reporter plasmid inneholdende 3’UTR av menneskelig ZEB1. Ifølge miRTarBase (Slipp 4,5: 1 november 2013, https://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/), er det en validert bindingssete og to spådd bindingssteder for MIR-150 i ZEB1 3’UTR . I denne studien har vi bare analysert validert bindingssetet som vist i figur 3D. For å sjekke om en direkte interaksjon er involvert mellom MIR-150 og målet onkogen ZEB1, utførte vi luciferaserapportørplasmid analyser (Figur 3E). Vi har funnet at ko-transfeksjon av MIR-150 sammen med villtype 3’UTR av ZEB1 forårsaket en signifikant nedgang i luciferase-aktivitet sammenlignet med kontroller (figur 3F og G).
(A) ekspresjonsnivåer fra Mir -150 i SKOV3 og OVCAR3 celler ved kvantitativ real-time PCR-analyse på 24 timer etter transfeksjon av MIR-150 vektor. (B~C) Den ZEB1 protein i SKOV3 og OVCAR3 celler ved western blot ved 24 timer etter transfeksjon av MIR-150 vektoren. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll lasting. «NC» refererer til negativ kontroll vektor. (D) MIR-150 bindingsseter i ZEB1 3′-UTR. (E) RNA sekvens innretting viser 3′-UTR av ZEB1 mRNA inneholder en komplementær nettstedet for frøet regionen MIR-150. ZEB1 mut er en mutant med substitusjoner i den komplementære regionen som en negativ kontroll. (F og G) Luciferase rapport analysen ble utført for å bekrefte MIR-150 bindende mål. Luciferase aktivitet ble oppdaget etter co-transfeksjon av pGL3-ZEB1-wt eller pGL3-ZEB1-mut, MIR-150 vektor eller negativ kontroll vektor (NC) i SKOV3 og OVCAR3 celler.
speil 150 hemmer celledeling av EOC celler in vitro ved å målrette ZEB1
for å evaluere effekten av MIR-150 på maligne fenotyper i EOC celler transfektert vi siRNA-ZEB1 til spesielt undertrykke endogen ZEB1 uttrykk. Som vist i figur 4, kan transfeksjon av siRNA-ZEB1 effektivt inhiberer ekspresjon av ZEB1 protein i både SKOV3 og OVCAR3 cellelinjer (både P 0,001). I tillegg observerte vi at den håndheves ekspresjon av MIR-150 signifikant inhiberte celleproliferasjon av SKOV3 og OVCAR3 cellene, men denne endring ble tilbakestilt ved transfeksjon av siRNA-ZEB1. Som vist i figur 5, håndheves uttrykk for MIR-150 betydelig hemmet celledeling av SKOV3 og OVCAR3 celler transfektert med siRNA-NC (begge P = 0,006, figur 5A og C), men ikke klarte å gjøre det i SKOV3 og OVCAR3 celler transfektert med siRNA-ZEB1 (både P 0,05, figur 5B og D).
Western blot analyse ble utført for å påvise uttrykket nivåer av ZEB1 protein i siRNA-ZEB1 transfektert, siRNA-NC transfektert og ikke-transfektert (blank ) SKOV3 (A og B) og OVCAR3 (C og D) celler. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll lasting.
(A og B) Vekstkurver av SKOV3 og OVCAR3 celler transfektert med siRNA-NC, og SKOV3 og OVCAR3 celler transfektert med siRNA-NC og MIR -150 vektor. (C og D) Vekstkurver av SKOV3 og OVCAR3 celler transfektert med siRNA-ZEB1, og SKOV3 og OVCAR3 celler transfektert med siRNA-ZEB1 og MIR-150 vektoren.
MiR-150 hemmer EOC-cellemigrering og invasjon in vitro ved å målrette ZEB1
for ytterligere å verifisere om MIR-150 hemmet celle migrasjon og invasjon av EOC cellelinjer ved å målrette ZEB1, vi også slått ned uttrykket av ZEB1 ved transfeksjon av siRNA-ZEB1 i både SKOV3 og OVCAR3 celler. Som vist i figur 6, den håndheves uttrykk for MIR-150 vesentlig hemmet celle migrasjon og invasjon av SKOV3 og OVCAR3 celler transfektert med siRNA-NC (begge P = 0,01, Figur 6A og C), men ikke klarte å gjøre det i SKOV3 og OVCAR3 celler transfektert med siRNA-ZEB1 (både P 0,05, figur 6B og D).
(A og C) Transwell migrasjonsanalysen og Matrigel invasjon bestemmelse av EOC-celler transfektert med siRNA-NC, og EOC-celler transfektert med siRNA-NC og MIR-150 vektor. (B og D) Transwell migrasjon analysen og Matrigel invasjonen assay av EOC celler transfektert med siRNA-ZEB1 og EOC celler transfektert med siRNA-ZEB1 og MIR-150 vektor.
Negativ korrelasjon mellom MIR-150 og ZEB1 mRNA uttrykk nivåer i menneske EOC vev
for å vurdere forholdet mellom MIR-150 og ZEB1 mRNA uttrykk i EOC vev, vi videre oppdaget uttrykket nivåer av ZEB1 mRNA i 100 EOC vevsprøver og 10 normal eggstokkene vevsprøver ved QRT-PCR og normalisert til p-aktin. Som vist i figur 7A, ekspresjonsnivået av ZEB1 mRNA i EOC vev var signifikant høyere enn hos normale eggstokk-vev (EOC vs. Normal: 4,49 ± 1,52 vs 2,41 ± 0,49, P 0,001, figur 7A). Mer interessant, Spearman korrelasjonsanalyse viste tydelig negativ korrelasjon mellom MIR-150 og ZEB1 mRNA uttrykk i EOC vev (rs = -0,45, p 0,001, figur 7B)
Expression nivå ZEB1 mRNA i EOC vev. var signifikant høyere enn hos normale eggstokk-vev (EOC vs. Normal: 4,49 ± 1,52 vs 2,41 ± 0,49, P 0,001, A). Mer interessant, Spearman korrelasjonsanalyse viste tydelig negativ korrelasjon mellom MIR-150 og ZEB1 mRNA uttrykk i EOC vev (rs = -0,45, p 0,001, B).
Diskusjoner
EOC er fortsatt et stort gynekologisk problem med lav 5-års overlevelse og seriøst truer menneskers helse på grunn av avstand metastaser, til tross for rutine kirurgi og kjemoterapi. Økende bevis vise feilregulering av ulike miRNAs i EOC og antyde sine viktige roller i tumorigene prosesser, herunder celleproliferasjon, apoptose og motilitet. Dermed avslører de molekylære endringer av mirnas er avgjørende for å overvinne denne dødelige sykdommen. Tidligere studier har vist at MIR-150 er dramatisk nedregulert i humane EOC vev og pasientenes serum sammenlignet med normale kontroller [14], [15]. Men rollene til Mir-150 i initiering og progresjon av EOC og nedregulering av MIR-150 uttrykk i denne kreft er fortsatt uklart. I denne studien, koblet vi MIR-150 til målet genet ZEB1, og demonstrerte sin engasjement i å regulere ondartede fenotyper av eggstokkreft celler. Vi bekreftet nøkkelrolle i MIR-150 som en tumor suppressor av direkte og negativt rettet mot ZEB1 i EOC. Bevisene for dette kommer fra følgende kilder. Først validert vi nedregulering av MIR-150 i EOC vev ved hjelp av en stor kohort av EOC pasienter, og viste at lav Mir-150 uttrykk nivået var mye lavere i svært aggressive EOC vev. For det andre ble det nedregulering av MIR-150 identifisert som en uavhengig prognostisk markør for både generelle og progresjonsfrie overlevelse av pasienter med EOC. For det tredje, overekspresjon av MIR-150 kan dramatisk inhibere celleproliferasjon og motilitet av eggstokkreft celler in vitro og i det vesentlige undertrykke protein ekspresjon av ZEB1. Forth, ZEB1 ble identifisert som et direkte mål for MIR-150, og banke ned av ZEB1 i eggstokkreft celler kan etterligne hemming av celleproliferasjon, migrasjon og invasjon av MIR-150. Videre fant vi en signifikant negativ korrelasjon mellom MIR-150 og ZEB1 mRNA uttrykk i EOC vev.
MiR-150 har vist seg å være en viktig miRNA innblandet i utvikling og progresjon av ulike menneskelige kreftformer. For eksempel, den reduserte ekspresjon av MIR-150 virker som et anti-apoptotisk faktor i human diffus magekreft og adrenokortikotropt hormon-utskillende hypofysesvulster [20]; Injeksjon av MIR-150-transduced muse lymfom celler i immundefekter mus kan gi færre svulster enn kontrollceller [21]; Tvangs ekspresjon av MIR-150 kan hemme tumorcellevekst in vitro og inhiberer tumorvekst i dyremodeller ved direkte nedregulering av DKC1 og akt2, reduksjon av fosforylerte AKTser473 /4 og en økning i tumor suppressorer som Bim og p53, som fører til telomerase aktivering og immortalisation av kreftceller [22]; MIR-150 uttrykk reduseres i ikke-småcellet lungekreft og var sterkt assosiert med tumor stadium, tumorstørrelse og pasientenes overlevelse som betydelig lav uttrykk i avansert stadium, ble i stor størrelse og dårlig prognose tumorer [13]. Redusert ekspresjon av MIR-150 er også observert i esophageal squamous cell carcinoma og er indikert til å være bidratt til maligne potensial, slik som tumor dybde, lymfeknutemetastase, lymfatisk invasjon, venøs invasjon, klinisk staging, og dårlig prognose [23]. I denne studien, våre data er i tråd med disse tidligere publiserte studier som gir bevis for endringer i Mir-150 uttrykk fremmer tumordannelse. Vi viste at MIR-150 var funksjonelt involvert i å undertrykke EOC cellevekst, migrasjon og invasjon, som ble støttet av både cellekulturstudier og kliniske data. I cellekultur eksperimenter, over-uttrykk for MIR-150 førte til nedgang på EOC celleproliferasjon og cellemotilitet. I kliniske prøver, MIR-150 var dramatisk nedregulert i EOC vev med høy klinisk stadium og høy patologisk klasse sammenlignet med EOC vev med lav klinisk stadium og lav patologisk karakter, og lav Mir-150 uttrykk i tumorer ble assosiert med dårlig overlevelse pasienter med EOC
Enda viktigere, vår identifisert Mir-150 mål var ZEB1, et medlem av sink finger familie av proteiner [24] -. [26]. ZEB1 er en av de transkripsjonelle indus i fremgangsmåten i epiteliale-mesenchymale overgang (EMT) i cancer av epitel opprinnelse, slik som brystkreft, lungekreft, øsofageal karsinomer, gastrisk karsinom, bukspyttkjertelkreft, livmorhalskreft, livmorkreft og prostatakreft kreft [23], [27] – [31]. Spesielt i EOC, Chen et al. [32] rapporterte at downregulating ZEB1 uttrykk med en ekspresjonsvektor basert liten hårnål RNA (shRNA) rettet mot ZEB1 (shZEB1) i EOC SKOV3-celler kan inhibere EMT av shZEB1-SKOV3-celler og blokkere shZEB1-SKOV3 cellemetastasering in vivo, noe som antyder dets rolle i styrke EMT i EOC celler. De observerte også at shRNA-mediert nedregule ZEB1 i SKOV3 celler kan betydelig redusere tumorvekst i xenograft mus. Våre data her viste endring av MIR-150 i eggstokkreft celler førte til motsatt endring av ZEB1, fremhever deres negativt regulering.
