Abstract
Bakgrunn
Den kliniske nytten av guaiac fekal okkult blod tester (FOBT) er nå godt etablert for tykktarmskreft screening. Økende bevis har vist at epigenetiske modifikasjoner og fecal microbiota endringer, også kjent som dysbiosis, er forbundet med CRC patogenesen og kan bli brukt som surrogatmarkører for CRC.
Pasienter og metoder
Vi utførte en tverrsnittsstudie som inkluderte alle påfølgende fag som ble henvist (2003-2007) for screening koloskopier. Før koloskopi, ble avløpsvann (ferske avføring, sera-S og urin-U) høstet og FOBTs utført. Metylering nivåene ble målt i avføring, S og U i 3 gener (Wif1, ALX-4, og vimentin) valgt fra et panel av 63 gener; Kras mutasjoner og sju dominerende og subdominant bakteriepopulasjoner i avføring ble kvantifisert. Kalibrering ble vurdert med Hosmer-Lemeshow chi-kvadrat, og diskriminering ble bestemt ved å beregne C-statistikken (Area Under Curve) og Net Omklassifisering Forbedring indeksen.
Resultater
Det var 247 personer (gjennomsnittsalder 60,8 ± 12,4 år, 52% av menn) i studien gruppen, og 90 (36%) av disse personene var pasienter med avansert polypper eller invasive adenokarsinomer. En multivariat modell justert for alder og FOBT førte til en C-statistikk på 0,83 [0,77 til 0,88]. Etter supplerende sekvensiell (en etter en) justering, Wif-en metylering (S eller U) og avføring microbiota dysbiosis førte til økning av C-statistikken til 0,90 [0,84 til 0,94] (p = 0,02) og 0,81 [0.74- 0,86] (p = 0,49), respektivt. Når justert i fellesskap for FOBT og Wif-en metylering eller avføring microbiota dysbiosis, økningen av C-statistikken var enda mer signifikant (0,91 og 0,85, p 0,001 og p = 0,10, henholdsvis)
Konklusjon
påvisning av denaturert Wif-en i enten S eller U har en høyere ytelse nøyaktighet i forhold til guaiacum FOBT for avansert kolorektal neoplasi screening. Omvendt, fekal microbiota dysbiosis deteksjon var ikke mer nøyaktig. Blod og urin tester kan brukes i de individer motvillige til å gjennomgå krakk testing
Citation. Amiot A, Mansour H, Baumgaertner jeg, Delchier J-C, Tournigand C, Furet J-P, et al. (2014) påvisning av metylert Wif-en Gene er mer nøyaktig enn en fekal okkult blod test for tykktarmskreft Screening. PLoS ONE 9 (7): e99233. doi: 10,1371 /journal.pone.0099233
Redaktør: Anthony W. I. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 03.02.2014; Godkjent: 13 mai 2014; Publisert: 15.07.2014
Copyright: © 2014 Amiot et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Cancéropole Ile de France, CoMiCa 2007-2010 prosjekt, (Charles Debray foreningen-ACD); LNCC (fransk National League mot kreft), CCR INSERM Promotion (2004-2006). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling, dataanalyse, beslutningen om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: Konkurrerende interesser
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en betydelig finnes for I. Sobhani og Wif1 test markør (registrert patent), og for JP Carrau for FOB test (leder av laboratoriet). årsaken til sykelighet og dødelighet i utviklede land. Forekomsten av CRC har vokst med 3-4% per år siden 1970 [1], [2]. I de fleste tilfeller, naturhistorie i CRC inkluderer en progresjon fra polypper til avansert CRC som gir mulighet for tidlig påvisning hos asymptomatiske pasienter. Screeningen kolonoskopi, «gullstandard metoden», fleksibel sigmoidoskopi, og computertomografi colonography har vist seg å være effektive for CRC screening ved å vise en reduksjon i CRC forekomst og dødelighet [3], [4], [5], [ ,,,0],6]. Men i de fleste land, er ingen av disse metodene som i dag anbefales for CRC masse screening på grunn av de iboende begrensningene, som inkluderer tarm forberedelse, høy pris, lav etterlevelse priser, og sporadiske bivirkninger. I de siste tiårene har gjort forsøk på å sette opp minimalt invasive tester for CRC screening. Guaiac fekal okkult blod test (FOBT) har vist seg å redusere CRC relatert dødelighet i tre randomiserte kontrollerte studier og en populasjonsbasert studie [7], [8], [9], [10]. Imidlertid har FOBT en lav følsomhet og en svært begrenset effekt på adenom-karsinom overgang, mest sannsynlig fordi tidlige forstadier til kreft bare produsere lave konsentrasjoner av blod i avføring [11], [12]. Den kvantitative immunkjemiske FOBT har nylig vist en høyere følsomhet i deteksjon av avanserte neoplasier [13]. Det er imidlertid fremdeles et behov for en mer nøyaktig test for å forbedre ytelsen screening.
I de fleste tilfeller, arvet genetiske faktorer gjør et mindre bidrag til mottakelighet for å utvikle CRC, mens hovedbidragsyter er miljøfaktorer [14]. Faktisk har tidligere undersøkelser vist at CRC utviklingen var assosiert med aldring, men også med moderne vestlig livsstil og kosttilskudd komponenter [1], [15].
Den avvik metylering av CpG rike sekvenser (CpG øyer) er en epigenetisk endring som induserer transkripsjonen stanse av tumorsuppressorgener [16]. Disse gen endringer kan være forårsaket av kjemiske og /eller miljømessige faktorer [1]. Hypermethylation av CpG øyer i tumorsuppressorgener har blitt rapportert i det neoplastiske vev av CRC pasienter, så vel som i premaligne lesjoner [17]. Det er kjent at avvikende metylering eksisterer i sirkulerende DNA, slik som finnes i avføring, serum, urin og andre kroppsvæsker, og kan brukes som en biomarkør for kreft screening [18], [19].
Mer nylig, mikrober koloniserende mage-tarmkanalen, som er større aktører i biologiske omgivelser, har vært mistenkt for å spille roller i forekomsten av CRC [20]. Faktisk, endringer i den luminale eller tilhenger tarmfloraen, såkalte dysbiosis, har vært vist i CRC-pasienter [21], [22]. I dyremodeller, har bidraget av bakterier til etiologien av CRC blitt undersøkt, og det har vært antydet at de kan fungere gjennom inflammatoriske baner, selv om en direkte genotoksiske virkning av bakterier kan også bli mistenkt [23]. Nylig viste vi at avføringen transplantasjon fra menneskelige pasienter med CRC til bakterie-fri mus kan indusere øker tarm forstadier hendelser gjennom verts genet endring, celleproliferasjon og metabolisme i slimhinnene [24]. Derfor endringer i avførings microbiota kan brukes som biomarkører for CRC screening.
I denne studien undersøker vi ytelsen nøyaktigheten av nye screeningtester for CRC rettet mot metylering nivåer av et panel av 63 gener i avføring , blod og urin, og sammensetningen av fecal bakterieflora ble bedømt ved qPCR. De sistnevnte testene ble sammenlignet med guaiac FOBT i en sykehusbasert populasjon av individer som tilhører grupper på gjennomsnittet eller høy risiko for CRC.
Pasienter og metoder
Study befolkningen
fra 2003 til 2007 247 sammenhengende polikliniske pasienter (gjennomsnittsalder 60,8 ± 12,4, 129 menn) med en gjennomsnittlig eller høy risiko for CRC (historie av kreft i slektninger, personlig tidligere historie med polypper, eventuelle mage eller tarm relaterte symptomer, eller anemi det kreves kolonoskopi), ble inkludert i et prøve bank samling studien. For å være kvalifisert for inkludering, pasientene måtte ha noen tidligere historie med følgende: kolorektal kirurgi, sykdommer som inflammatoriske eller infeksiøse skader i tarmen, eller et behov for en nødsituasjon koloskopi. Studien foregikk i to avdelinger (gastroenterologi og onkologi) av et universitetssykehus i Paris-området i Frankrike.
To uker før koloskopi og etter skriftlig informert samtykke, pasienter ble inkludert i studien, og var bedt om å gi fersk avføring, urin og blodprøver i løpet av 2 uker, men opp til tre dager før kolonoskopi. I alle tilfeller ble avføringsprøver innsamlet før tarmen rensing for koloskopi. Noen spesielle dietter (diabetikere, vegetarianere) og medisiner (anti-diabetiker medisiner, hypocholesterolemics og avføringsmidler) i løpet av denne perioden ble registrert. Studien ble godkjent av etisk komité i Val de Marne Paris-EST område som autorisert innmelding av pasienter i alle tilknyttede sentre (nummer 2004-4 CCPPRB). Alle pasientene fikk informasjon om studien, sine mål, og prøver de ville gi. All informasjon ble gitt av et maskinskrevet brev skrevet på fransk, og formell skriftlig tillatelse er innhentet på en tre eksemplarer kopi skjema en kopi av skjemaet ble beholdt av pasienten, beholdt vi en kopi ved Institutt for klinisk forskning (CIC) og den siste kopien ble beholdt av arrangøren (Statens institutt for vitenskapelig forskning i medisin-INSERM). Således, en formell samtykke var tilgjengelige for hver pasient. Detaljerte intervjuer for medisinsk historie og fysiske undersøkelser ble utført.
Guaiac fekal okkult blod test
guaiacum Hemoccult Testen ble utført (utført i et sertifisert laboratorium av franske myndigheter i Paris) på alle fag enige til å delta i studien. For FOBT, ble en prøve pr avføring fra 3 påfølgende avføring nødvendig. I samsvar med det pågående program, en spesiell diett (meatless i 3 dager) anbefales. Fagene samlet de 3 prøvene selv hjemme (ved hjelp av kit kort Hemoccult), innspilt datoen for hver avføring involvert, og sendte testene i posten. Den Hemoccult lesing ble utført blindt av sertifiserte teknikere uten rehydrering, i henhold til protokoller som er fastsatt av den nasjonale organiserte screeningprogrammet. Screening ble positiv hvis Hemoccult testen var positiv (minst ett av de 6 sporene var positive).
Screening koloskopi
Alle individer gjennomgikk en koloskopi undersøkelse under bedøvelse. Høyre og venstre kolon områder, samt endetarmen, var fullt undersøkt hos alle pasienter. Koloskopi Resultatene ble registrert etter den vanlige prosessen for et organisert screeningprogram i Frankrike. Polypper ble helt fjernet under endoskopi undersøkelse ved hjelp mucosectomy, om nødvendig. Kolonoskopi ble ansett for å være gull standardmetoden. Koloskopi funnene ble klassifisert i henhold til de mest avanserte patologiske lesjoner funnet. Avanserte svulster inkludert avanserte adenomer (adenomer måle 10 mm eller adenomer med høygradig dysplasi eller in situ karsinom) og invasiv CRC (invasjonen av ondartede celler utover muskularis slimhinner). Hyperplasic polypper ble ikke inkludert som neoplasmer.
Kvantifisering av metylering ved kvantitativ PCR
Total DNA ble isolert fra urin, serum og avføringsprøver ved bruk av Qiamp DNA Mini Kit (Qiagen) og deretter omdannet til natriumbisulfitt og amplifisert ved anvendelse locus-spesifikke PCR-primere som flankerte en MGB sonde. Metyleringen nivået for hver pasient ble bestemt som beskrevet av Eads et al [25]. PCR-betingelsene var 94 ° C i 10 minutter for enzymaktivering, 45 sykluser ved 94 ° C i 30 sekunder og 60 ° C i 60 sekunder for glødning og forlengelse PCR. Vi bekreftet metylering resultater ved direkte bisulfite genomisk sekvensering i 5% av berørte pasienter undersøkt for sine vev for å utelukke en teknisk gjenstand. Et panel av 63 gener (data ikke vist) hentet fra litteraturen ble først undersøkt, og deretter 3 gener av interesse (Wif-1, ALX-4 og vimentin) ble valgt ut basert på deres diskrimi verdier som ble bestemt ved sammenligning mellom tumor og normale homologe intestinal vev [26]. Effektiviteten av primerne til mål-gener (Wif1, ALX4 og vimentin) og husholdningsgenet (Albumin BSP) for inngang av modifiserte DNA ble evaluert ved anvendelse av seriefortynninger av metylert modifiserte DNA-kontroller som vist i figur S1). Etter en mulighets sett med eksperimenter utført på 48 pasienter avføring, urin og serumprøver, bestemte vi oss for å måle bare Wif-1 metylering nivåer i valideringssettet i henhold til de høyere sensitivitet og spesifisitet priser av WIF-1 genet i forhold til ALX- 4 og vimentin. De primer og probe sekvenser for metylering av målgener er oppført i tabell S1.
Bakteriell analyse av fekale prøver ved hjelp av kvantitative PCR
Hele fersk avføring ble samlet i sterile bokser, og innen 4 timer , 10 g ble frosset ved -80 ° C for analyse. Bakteriell DNA ble ekstrahert fra prøver av avføring, og etter den endelige utfelling, ble DNA resuspendert i 150 ul TE-buffer og lagret ved -80 ° C for videre analyse, slik som tidligere beskrevet [26]. Vi brukte en real-time qPCR teknikk for å undersøke forskjellen i bakterietettheten innenfor microbiota mellom normal og avansert neoplasi og kreftpasienters avføring. Primerne og probene som brukes i denne undersøkelsen, er blitt beskrevet andre steder [26] og er vist i Tabell S2. Real-time qPCR ble utført ved hjelp av en ABI 7000 Sequence Detection System med programvareversjon 1.2.3 (Applied-Biosystems, Foster City, CA, USA), og totalt antall bakterier ble utledes fra de gjennomsnittlige standardkurver og uttrykt som log10 verdier, som tidligere beskrevet [26]. qPCR verdier ble oppnådd per pasient og for hver gut microbiota komponent. For å kompensere for det faktum at de fekale prøvene kan inneholde mer eller mindre vann, vil dataene for hver avføringsprøve ble normalisert slik som tidligere beskrevet [26]. Nivået funnet for hver enkelt dominant og sub-dominante bakteriepopulasjon ble subtrahert fra alle-bakterieinnhold, og resultatene er uttrykt som logaritmen av antall bakterier per gram avføring. Disse analysene ble brukt til å sammenligne sammensetningen av tarmfloraen i alle fag, og resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
KRAS mutasjonsanalyse
DNA ble forsterket på duplikater av PCR med en allel-spesifikk primer sett dekker exon 12 og 13 av den Kras-genet [27]. PCR-betingelsene var 94 ° C i 10 minutter, 45 sykluser ved 94 ° C i 30 sekunder og 60 ° C i 60 sekunder for glødning og forlengelse PCR. To sett av PCR-primere og prober ble anvendt: ett sett var spesifikk for vill allelet DNA og det andre settet representerer mutasjonen allelet. De primer og probe sekvenser er listet opp i tabell S3.
Statistisk analyse
Hver pasientens egenskaper er beskrevet som et tall (%) for kvalitative data og som en median (interkvartilt område, IQR) eller mener (± 1 standardavvik, SD) for kvantitative data i henhold til deres distribusjon. Vi sammenlignet baseline karakteristikker for pasientene i begge gruppene (avanserte neoplasi og kontrollgrupper) ved hjelp av Pearsons khikvadrattest eller Fishers eksakte test for kvalitative variabler og Wilcoxon ikke parametrisk eller Kruskal- Wallis tester for kvantitative variabler. Spearmans tosidig test ble brukt for å vurdere sammenhenger.
odds ratio (OR) og 95% konfidensintervall (CIS) for hver parameter ble estimert ved hjelp av separate logistiske regresjonsanalyser. Fekal microbiota dysbiosis resultater ble gitt for en SD av loggtransform nivåer beregnet for hver kontrollgruppe. Analysen ble systematisk alderstilpasset for å estimere uavhengig utførelsen nøyaktigheten av hver screening-tester. Alder ble håndtert i kontinuerlig etter å ha kontrollert normalitet antakelsen. Kalibrering av hver modell ble anslått av Hosmer-Lemeshow statistikk der en
p
verdi større enn 0,20 indikerer tilstrekkelig plass. Diskrimineringen av vår modell ble vurdert av C-statistikken (areal under ROC Curve), som ble beregnet ut fra multivariate logistisk regresjonsmodell. C-statistikken for modellene med og uten avanserte neoplasi ble sammenliknet med en parametrisk test utviklet av DeLong et al og hensiktsmessig for ikke-uavhengige data [28]. En resampling bootstrap analyse med 1000 reproduksjoner av baseline datasett ble utført for å beregne 95% CI’er av C-statitistics av de multivariate modellene. Diskrimineringen ble også kvantifisert ved beregning av netto Omklassifisering Improve indeks (NRI) [29].
Alle sammenligninger var to-sidig og en
p
verdi på mindre enn 0,05 indikerte en statistisk signifikant forskjell . Analysene ble utført ved hjelp av Stata programvareversjon 12,0 (Stata- Corp, College Station, TX, USA).
Resultater
Study befolkningen
To hundre førtisju pasienter ble inkludert i studien. Karakteristikken av studiepopulasjonen er oppført i Tabell 1. Alle personer gjennomgikk en koloskopi med full undersøkelse av høyre og venstre colon og rektum. Pasientene ble deretter klassifisert som følger: normale individer som er presentert med enten normal kolonoskopi (n = 123) eller små adenomer mindre enn 1 cm i diameter (n = 34) ble her ansett for å være kontroller og pasienter med neoplasi som presentert med CRC ( n = 66) eller store (mer enn 1 cm i diameter) adenomer (n = 24) ble heri betraktes til å være tilfeller. Den gjennomsnittlige tilfellet var mer enn 10 år eldre enn den gjennomsnittlige kontroll pasienten. Kontroll pasienter sjeldnere rapportert en tidligere personlig historie av polypper og tykktarmskreft i familien i forhold til sakene. De to gruppene var like balansert for BMI, komorbiditet, medisin opptak, og diett (tabell 1).
Analyse av Guaiac baserte fekal okkult blod Test Hemoccult
Hemoccult test var ikke tolkes i 2 tilfeller. Totalt var det FOBT positiv i 46 pasienter, hvorav 36 (78%) hadde avansert neoplasi, inkludert 33 (72%) CRC. Blant de 199 pasientene med negative FOBTs, 146 (73%) av pasientene hadde normale koloskopier eller små adenomer mens 53 (27%) hadde avansert neoplasi, inkludert 33 (17%) med CRC. Dermed blir sensitivitet og spesifisitet av FOBT for avanserte svulster var 40,4% og 93,6%, henholdsvis.
metylert Wif-en, ALX-4, og vimentin i serum, urin og avføring
de metylering nivåer av WIF-en, ble ALX-4 og vimentin gener først vurderes i fekale prøver. I den generelle populasjonen, ble hypermethylation av Wif-1, ALX-4 og vimentin gener observert på 7,3%, 4,5% og 0,8%, henholdsvis (tabell 2). For hvert gen (Wif-en, ALX-4 og vimentin), avvik metylering var signifikant hyppigere hvis pasienter sammenlignet med kontrollpasienter (19,3%
vs.
0,6%, 10,6%
vs.
1,3% og 32,6%
vs
. 0,0%, henholdsvis) (tabell 2). For hvert gen, spesifisiteten var over 98%, men med en lav følsomhet under 25%. For WIF-en og ALX-4 gener, men ikke vimentin genet, metylering nivået var betydelig mer forhøyet hvis pasienter sammenlignet med kontrollpersoner (figur 1).
metylering nivåer av Wif-1, ALX-4, og vimentin ble deretter vurdert i urin og serumprøver. Wif-1 viste seg å være den mest følsomme markør av avanserte neoplasier i enten urin eller serumprøver (52% og 29%) i forhold til ALX-4 og vimentin (23% og 15% sammenlignet med 4% og 8%, henholdsvis). Spesifisitet var høyere enn 93% i alle tilfeller. Kombinasjonen av urin og serum WIF-en metylering nivå førte til en høyere følsomhet sats på 60,4% [30].
metylering nivå Wif-en ble deretter vurdert i enten urin eller serumprøver for hele validering kohort, som inkluderte 247 pasienter. Hypermethylation av Wif-en ble observert i urin- og serumprøver i 26,7% og 32,6% av tilfellene, og i 1,3% og 1,3% av kontrollpersoner, henholdsvis (p 0,001 og p 0,001). Kombinasjonen av serum og urin hevet neoplasi deteksjonsfrekvensen til 47,8% i tilfeller sammenlignet med 2,5% i kontrollgruppen (tabell 2). Metyleringen nivå var signifikant forhøyet i tilfeller sammenlignet med kontroller i enten serum eller urin prøvene (figur 1). Ingen forskjell ble funnet for ulike stadier av tykktarmskreft i henhold til det amerikanske Joint Committee on Cancer klassifisering
Fecal microbiota dysbiosis i avanserte adenomer ( 10 mm). Og endetarmskreft
fecal microbiota sammensetningen var tilgjengelig for alle fag og er presentert i tabell 3. i saks pasienter, fekal microbiota dysbiosis var preget av en høyere tetthet av arter som tilhører
Bacteroides /Prevotella
gruppe vs kontroller. Tatt i betraktning alle personer sammen,
Bacteroides /Prevotella
gruppen ble ikke knyttet til alder (r = 0,09; p = 0,62) eller BMI (r = 0,20 og p = 0,24)
Kras mutasjonsanalyse i avføringsprøver
Kras mutasjoner (exon 12 og 13) i avføringsprøver ble funnet i 16 (18%) pasienter med fremskreden neoplasi, sammenlignet med 16 (10%) individer i kontrollgruppen. Sensitiviteten og spesifisiteten var 17,8% og 89,8% for b Kras mutasjoner, respektivt. Ingen korrelasjon ble funnet mellom Kras mutasjoner og microbiota endringer eller Wif-en metylering når det ble vurdert i avføring, blod eller urinprøver.
Nøyaktighet av screening tester for å identifisere avansert neoplasi
De multivariate ORS for hver parameter for tilstedeværelse av avanserte neoplasi er vist i tabell 4. i en multivariatmodell korrigert for alder, hankjønn [OR = 2,02; CI95% (1,07 til 3,82), p = 0,03], historie av polypper [OR = 0,24; CI95% (0,11 til 0,55), p = 0,001] og familiær historie med CRC [OR = 0,50; CI95% (0,27 til 0,95), p = 0,03) var uavhengig assosiert med tilstedeværelse av avansert neoplasi.
Når alder og resultatene av FOBT ble vurdert i den samme modell (modell 1) en positiv FOBT var uavhengig assosiert med avanserte neoplasi. I en lignende modell med resultatene av urin eller serum Wif-1-metyleringen test (modell 2), en positiv Wif-en metylering test var sterkt assosiert med avansert neoplasi (nedre grense på 95% CI: 18.7). Justering med både FOBT og urin eller serum Wif-en metylering test (modell 3) viste at urin eller serum Wif-en metylering test forble sterkt assosiert med avansert neoplasi (nedre grense på 95% CI: 14,41), mens FOBT var ikke lenger signifikant.
Når alder og avføring microbiota dysbiosis ble vurdert, bare
Bacteroides /Prevotella
gruppen ble assosiert med avansert neoplasi (modell 4). Når fecal microbiota dysbiosis og resultatene av FOBT ble vurdert på samme modell (modell 5), bare FOBT var assosiert med avansert neoplasi.
Bidrag av hver modell til avansert neoplasi prediksjon
den godhet anfall av prediksjon modell som bare inkluderte alder og FOBT var tilstrekkelig (
p
verdien av Hosmer Lemeshow statistikken = 0,58). Som vist i tabell 4, nøyaktighet (vurdert ved C-statistikken) av denne modellen var betydelig lavere enn urin og /eller serum Wif-1-metyleringen test (modell 2 økte C-statistikken på 8,6%). Denne forbedringen (vurdert av C-statistikken og Net Omklassifisering Forbedring Index) var signifikant høyere i modellen som kombinerte urin og /eller serum Wif-en metylering test og FOBT (modell 3 økte C-statistikken på 9,8% og NRI på 22,8%). Testing for fekal microbiota dysbiosis (modell 4) hadde nøyaktighet ligner på FOBT. Kombinere FOBT og testing for fekal microbiota dysbiosis økte ikke sistnevnte nøyaktigheten av modellen (modell 5 økte ikke C-statistikken og NRI).
Diskusjoner
CRC er en viktig årsak dødelighet og en økonomisk byrde i utviklede land. Forsøket på å redusere dødeligheten av sykdommen har ført offentlige helsesystemer for å prioritere masse screenings bruker FOBT hos asymptomatiske individer. Faktisk har det blitt demonstrert at FOBTs redusert CRC-assosiert dødelighet [7], [8], [9], [10]. Selv om immunkjemiske måling av hemoglobin har vist seg å være mer sensitive enn FOBT med lignende spesifisitet, til det store antall personer som er motvillige utføre fecal test kan begrense bruken. Effektiviteten av slike strategier avhenger i hovedsak av aksept og kostnadseffektiviteten av skjermingsmetoden. I denne innstillingen, kan blod og urin testing brukes i individer potensielt motvillige til å sende inn til avføring testing.
I denne studien sammenlignet vi den diagnostiske utførelsen av metylert Wif-en, et utskilt antagonist av Wnt signalveien , som en biomarkør av avansert kolorektal neoplasi i avføring, serum og urinprøver. Vi har også tatt med kliniske egenskaper i screening prosessen og utført potensielle FOBTs som en gullstandard. Vi fant at metylert Wif-1 hadde den høyeste diagnostiske ytelse for å forutsi avansert neoplasi i forhold til kliniske karakteristika, FOBTs og mikrobiota endringer, alene eller i kombinasjon. Dette funnet er av stor interesse, fordi et betydelig antall pasienter avslå å utføre FOBT [31].
Dermed, for FOBT resultater i denne studien, Wif-en ble brukt til å overvinne begrensninger av FOBT fordi av sin lignende diagnostisk ytelse, med 47,8% sensitivitet og 97,5% spesifisitet. Kolorektal kreft neoplastiske celler har vist seg å være en stor paradigme på grunn av heterogeniteten av de molekylære reaksjonsveier innblandet i deres utvikling [32], [33], [34], [35]. I de fleste tilfeller er den opprinnelige genomiske endring av
APC /Wnt
signalveien etterfølges av akkumulering av ytterligere mutasjoner driver [36]. Dette forholdet har ført forskere til å tro at en enkelt DNA markør ikke kan være en verdifull markør for CRC screening. I vår studie har screening for Kras mutasjoner i avføringsprøver bekreftet dette dogmet ved å vise svært spesifikke, men veldig dårlig sensitive resultater. Bruken av en fekal DNA panel av 21 genmutasjoner viste høyere følsomhet enn den FOBT, men har en stor utgiftspost begrensning [12]. Påvisning av avvikende metylering har nylig blitt vist å være mer følsom enn detektering av genmutasjoner [37]. Videre avvikende metyleringer kan også påvises i sirkulerende DNA, slik som finnes i avføring, serum, urin og andre kroppsvæsker [39]. I denne studien viser vi at det Wif-en metylering test er en nøyaktig markør av avansert kolorektal neoplasi i et første sett av evalueringer. Videre demonstrerer vi også at enten urin eller blodprøver kan anvendes for å bestemme metylering nivå. Spesielt kan dette markør brukes i individer som er uvillige til å utføre avføringsprøver. Spesielt resultatene av FOBT avslørt en lavere følsomhet enn tidligere rapportert. Denne forskjellen kan forklares ved valg av en primær utfall som har inkludert pasienter med langt fremskreden neoplasme som er mye mer relevant i klinisk praksis, og ved studiepopulasjonen som har inkludert pasienter med en midlere eller høy-risiko for CRC. Denne forskjell kunne forklare ved forlengelse av utfallet til pasienter med langt fremskreden neoplasme som er mye mer pålitelig i klinisk praksis, og ved studiepopulasjonen, inkludert pasienter med en midlere til høy risiko for CRC. Imidlertid, som strekker seg slik test til massescreeningprogrammer krever videre validering i asymptomatiske individer så vel som kostnadseffektiviteten analyser i en simuleringsmodell som tidligere rapportert [38].
I tillegg, for å forbedre nøyaktigheten av biologiske tester for prediksjon av neoplasier under koloskopier, vi undersøkt markører i bakterieflora, som blir et nytt felt for humane sykdomsstudier. Bidraget av tarmfloraen til CRC tumorigenesis er nå fullt akseptert [39]. Høy gjennomstrømning sekvenseringsteknikker for den menneskelige mikrobiomer har blitt brukt til å undersøke endringene i bakterie fylogenetisk kjernen hos normale individer og i CRC pasienter, enten i avføring eller slimhinnen forbundet bakterieflora [21], [22]. Flere bakterier grupper, dvs.
Bacteroides /Prevotella product: [21],
Fusobacterium
,
Faecalibacterium Hotell og spesielt
Coriobacteridae Hotell og
Roseburia arter
[22], har vist seg å være relatert til CRC og eksperimentelle modeller har understøttet dette årsaks hypotesen [24].
Fusobacterium nucleatum
stammer har vist seg å fremme kolorektal kreftutvikling ved invasjon av epitelceller ved å produsere genotoxin relaterte direkte DNA-skade eller ved å fremkalle inflammasjon [23], [40], [41]. I denne studien fikk vi bekreftet en bestemt dysbiosis forbundet med avansert kolorektal neoplasi preget av en høyere tetthet av arter som tilhører
Bacteroides /Prevotella
gruppe. Imidlertid gjorde dette resultatet ikke bedre screening ytelsen til FOBT eller WIF-1 testing. Fremtidige studier med dypere sekvenseringsmetoder og /eller metagenomic tilnærminger er garantert å muliggjøre en screening verktøy basert på fekal bakterieflora.
Konklusjon
I denne studien, påvisning av metylert Wif-1 i avføring, urin eller serumprøver har en høyere nøyaktighet diagnose for å detektere avanserte neoplasi i forhold til FOBT (0,90 [0,84 til 0,94] vs. 0,83 [0,77 til 0,88], p = 0,02). Videre studier er nødvendig for å undersøke om endringene i bakterieflora kan være biomarkører av avansert kolorektal neoplasi, særlig ved bruk av kandidat bakterier og metagenomic studier. Serum og urin Wif-1 metylering tester kan brukes i individer motvillige til å gjennomgå krakk testing og bør nå vurderes i sammenheng med screening.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Effektivitet av primere av målgener (Wif1, ALX-4 og vimentin) og husholdningsgenet (Albumin BSP) som brukes for metylering kvantifisering ved hjelp av serielle fortynninger av denaturert modifisert DNA kontroll. For hvert datapunkt ble utført tre uavhengige analyser. Ligningen for den lineære regresjon kurve samt korrelasjonen faktor er angitt på hver graf
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099233.s001 plakater (DOC)
Tabell S1. .
Metylert genet målrettede primere og prober
doi: 10,1371 /journal.pone.0099233.s002 plakater (docx)
Tabell S2.
Group og artsspesifikke 16S rRNA-genet målrettede primere og prober
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099233.s003 plakater (docx)
tabell S3.
Kras mutasjon primere og prober
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099233.s004 plakater (DOC)
Takk
Vi vil gjerne takke M. Goossens , K. Leroy, R. Inchitti, B. Coste, B. Ghaleh-Marzban, O. Montagne, ML. Auriault, MT. Chaumette, S. Vialette, F. Bouabbas, J. Francese, R. Jian, T. Aparicio, D. Abdelrahman, H. Hagège, A. Courillon Mallet, JL. Dupas, R. Benamouzig, M. Cavicchi, Cl. Altman, E. Zrhien, G. Tordjman, F. Venezia, F. Uzzan, D. Gilot, P. De Fleury, M. Algard, M. Prieto, M. Petit, J. Samama, D. Lucienne, JC. Delchier, M. Levy, og A. Charachon for sine nyttig bidrag til denne studien.
