Abstract
Bakgrunn
Tumor-stroma reaksjon er forbundet med aktivering av fibroblaster. Nemosis er en ny type av fibroblast aktivering. Det fører til en øket produksjon av vekstfaktorer og proinflammatoriske og proteolytiske proteiner, mens på samme tid cytoskeletal proteiner er degradert. Her brukte vi paret normal hud fibroblaster og kreft-assosiert fibroblaster (CAF) og primære og tilbakevendende muntlig plateepitelkarsinom (SCC) celler for å studere nemosis respons.
hovedfunnene
fibroblast nemosis var analysert ved hjelp av protein og gen-ekspresjon og parakrin regulering med kolonidannelse analysen. En av de vanlige fibroblast stammer, FB-43, oppregulert COX-2 i nemosis, men FB-74 celler ikke. I motsetning til dette, CAF-74 klumper uttrykt COX-2, men CAF-43-celler ikke. Alfa-SMA-protein ble uttrykt i både CAF-stammer, og i FB-74-celler, men ikke i FB-43 fibroblaster. Dens mRNA nivåer ble nedregulert i nemosis, men kafeer begynte å gjenvinne uttrykket. FSP1 mRNA ble nedregulert i normale fibroblaster og CAF-74-celler, men ikke i CAF-43 fibroblaster. Serinprotease FAP ble oppregulert i alle fibroblaster, mer i nemotic kafeer. VEGF, HGF /SF og FGF7 mRNA nivåer ble oppregulert til varierende grad i nemosis. Kafeer økt kolonien dannelsen av primære tumorcellelinjer UT-SCC-43A og UT-SCC-74A, men normale fibroblaster hemmet forankringsuavhengig vekst av tilbakevendende UT-SCC-43B og UT-SCC-74B celler.
Konklusjoner
Nemosis respons, som observert av COX-2 og vekstfaktor induksjon, og uttrykk for CAF markører a-SMA, FSP1 og FAP, varierer mellom fibroblast populasjoner. Uttrykket av CAF markører skiller mellom normale fibroblaster og kafeer i nemosis. Disse resultatene understreker heterogenitet av fibroblaster og utviklende tumor-fremme egenskaper kafeer
Citation. Räsänen K, Virtanen jeg, Salmenperä P, Grenman R, Vaheri A (2009) Forskjeller i Nemosis Response av Normal og kreft-Associated fibroblaster fra pasienter med oral plateepitelkarsinom. PLoS ONE 4 (9): e6879. doi: 10,1371 /journal.pone.0006879
Redaktør: Immo A. Hansen, New Mexico State University, USA
mottatt: 9. juni 2009: Godkjent: 06.08.2009; Publisert: 01.09.2009
Copyright: © 2009 Räsänen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra finsk kulturfond, Magnus Ehrnrooth Foundation, den finske Diabetes Research Foundation, EVO stipend, finsk Cancer Organisasjoner og Academy of Finland. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tumor mikromiljøet spiller en stor rolle i kreft progresjon og fibroblaster er kjent for å være sentrale deler av svulsten stroma. Nylig har det blitt foreslått at stromale fibroblaster innledning hemme tidlige stadier av karsinogenese og senere under parakrin påvirkning av den transformerte epitel blir aktivert som fører til fremme av kreft vekst. Avhengigheten av karsinomer på stromale fibroblaster avtar når kreft utvikler seg, dels gjennom en bryter i epitelceller fra parakrin regulering til autokrin [1], [2]. Blant de aktiverte fibroblaster er kreft-assosiert fibroblaster (CAF), som er karakterisert ved øket mitotisk indeks, mutasjoner i tumorsuppressorgener slik som p53 og ved økt sekresjon av vekstfaktorer, kjemokiner og komponenter av ekstracellulær matriks (ECM) [2], [3], endringer som alle er involvert i invasjon og tumorvekst [4] .Widely anvendes CAF markører inkluderer α-glattmuskel aktin (α-SMA), fibroblast-spesifikt protein 1 (FSP1, også kjent som S100A4) og fibroblast aktiveringsprotein (FAP, også kjent som seprase) [5]. a-SMA, en komponent av cytoskjelettet, er det som oftest brukt markør for aktiverte fibroblaster. Den blir innlemmet i spennings fibre for derved å forsterke den kontraktile aktivitet av fibroblaster [6]. FSP1 tilhører S100 super-familien av kalsiumbindende proteiner. Det fremmer tumorvekst ved å regulere cellesyklusprogresjon og cytoskeletal integritet [7]. FAP er en serin protease som ikke uttrykkes i normale voksne vev, men dens ekspresjon induseres i aktiverte fibroblaster som svarer på sårheling og tumor-stroma reaksjon [8]. Imidlertid er det vel etablert at fibroblaster er heterogene [9], [10], og at en annen måte å uttrykke kafeer disse markørene [11], [12].
Nemosis, et fenomen av fibroblast aktivering (for oversikt se Vaheri et al., 2009 [13]), er tidligere blitt undersøkt ved bruk av vanlige dermale fibroblaster [14] – [19]. Dannelse av en fibroblast spheroid fører myriade av gener for å bli uttrykt forskjellig i disse aktiverte fibroblaster. To forskjellige mønstre kan bli funnet i uttrykket: i) ekspresjon av vekstfaktorer og proteolytiske og pro-inflammatoriske proteiner øker og ii) ekspresjon av cytoskeletal komponenter reduseres. Basert på tidligere publiserte resultater, syklooksygenase-2 (COX-2), som er kjent for å være assosiert med inflammasjon og tidlige stadier av karsinogenese, og hepatocytt-vekstfaktor /spredningsfaktor (HGF /SF), som har vist seg å fremme tumorcelle invasivitet, har vært ansett kjennetegn proteiner av nemosis. Spontan clustering av fibroblaster inn kuler kan også være forårsaket av svulst celle kondisjonert medium [14], [15]. Vi har tidligere vist at dyrking av fibroblastcellene sfæroidene under påvirkning av benigne HaCaT keratinocytter hemmer nemosis, sett fra undertrykket ekspresjon av COX-2, mens ondartede HaCaT-celler har en nemosis fremmende effekt på normale fibroblaster, manifestert som forbedret oppregulering på COX-2- , HGF /SF og VEGF (vaskulær endotelial vekstfaktor) [17].
hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) er den sjette vanligste kreftformen i verden og den generelle pasientoverlevelse er dårlig. Dette er hovedsakelig på grunn av høy forekomst av kreft tilbakefall og lokal utbredelse, delvis forårsaket av p53 genmutasjoner, som kan finnes i mer enn 70% av HNSCCs [20], [21]. Kirurgi og strålebehandling er de mest brukte behandlingslinjer og for tiden den eneste godkjente molekylær målrettet terapi for hode og nakke kreft er cetuximab (Erbitux; Imclone Systems Inc., New York, New York), et monoklonalt antistoff hemmer av epidermal vekstfaktor reseptor ( EGFR). Men ikke alle HNSCC pasienter har nytte av EGFR-målrettet terapi, siden overekspresjon, men ikke mutasjon synes å bestemme behandlingsrespons. Fase 3-studier for HNSCC Det pågår for målretting VEGF (Bevacizumab, monoklonalt antistoff hemmer) og for p53 (INGN 201, genterapi) [22], [23]. Et annet potensielt mål er COX-2 som er blitt funnet å være forhøyet i oral squamous cell carcinoma (OSCC) og har blitt vist å minke tumor Radiosensitivity [24]. Studier ved hjelp av matchede pasienter cellestammer har vist at det er en korrelasjon i radiosensitivities mellom OSCC celler, dermale fibroblaster og kreft-assosiert fibroblaster oppsamlet fra det samme individ, og at disse individuelle forskjeller i Radiosensitivity kan forutsi utfallet av stråleterapi [25], [ ,,,0],26].
Basert på tidligere resultater som under påvirkning av ondartede celler normale nemotic fibroblaster begynner å ligne kafeer, målet med dette arbeidet var å studere nemosis responsen av autolog hud og kreft-assosiert fibroblaster, til sammenligne uttrykket av CAF markører mellom disse fibroblaster stammer og deres skjebne i nemosis og å undersøke hvordan disse ulike fibroblast populasjoner påvirke pasient matchet muntlige SCC celler. Vår studie viser at både normale og kreft-assosiert fibroblaster viser variasjon mellom individer, sett på som varierende basal CAF uttrykk nivåer og ulike vekstfaktor reaksjoner i nemosis, og har en differensial innvirkning på SCC celler. Oppførselen til de studerte CAF markører i nemosis fulgt den generelle nemosis svar: cytoskeletal α-SMA og FSP1 ble nedregulert og proteolytiske FAP ble oppregulert. Det eneste unntaket var en av CAF stammer som oppregulert FSP1 i nemosis. Store systematiske forskjeller mellom normale og kreft-assosiert fibroblaster ble redusert basale nivåer av vekstfaktorer i kafeer og evnen til nemotic kafeer å begynne å gjenvinne α-SMA uttrykk og den økte FAP uttrykk i nemosis forhold til sine normale kolleger.
Resultater
Ulike fibroblast populasjoner viser forskjeller i respons til nemosis
Først ønsket vi å undersøke uttrykk for den tidligere brukte nemosis markør COX-2 i de fire fibroblast befolkninger. Det var ingen basal ekspresjon av COX-2 i en hvilken som helst av de fibroblast-stammer, og det ble ikke indusert i monolagskultur. Men når dyrket som kuler normale fibroblaster FB-43 startet å uttrykke COX-2 etter 48 timer (Figur 1a), men dette ble ikke sett i de andre normale fibroblaster press FB-74 (figur 1C). Motsatte resultater ble sett med kreft-assosiert fibroblaster, der ingen COX-2 ble uttrykt i CAF-43 fibroblast kuler (Figur 1b), men CAF-74 cellene begynte å uttrykke COX-2 etter 24 timer (figur 1D). Disse resultatene skiller seg fra tidligere utgitt og indikerer at COX-2 ikke skal utelukkende brukes til å måle nemosis respons.
Fibroblaster ble dyrket som kuler eller enkeltlag for tiden angitt. (A) FB-43 kuler begynte å produsere COX-2 etter 48 timer og ingen α-SMA ble produsert, mens CAF-43-celler (B) ikke indusere COX-2, men uttrykte α-SMA. Både FB-74 (C) og CAF-74 (D) fremstilt α-SMA, men COX-2 ble bare indusert i CAF-74 klumper. Alle fibroblaster typer uttrykt like mengder vimentin. (E) Alle UT-SCC cellene uttrykte COX-2, men bare 74A og 74B viste indusert p53 nivåer.
Vi har også sett på proteinnivå vimentin og α-SMA i disse cellene. Alle fire fibroblast populasjoner uttrykt vimentin i like mengder, som forventet, siden fibroblaster
in vitro
anses å være i en tilstand som ligner sårheling. Begge CAF stammer uttrykte α-SMA, CAF-74 litt mer enn CAF-43. Interessant nok også de normale FB-74-celler uttrykte α-SMA, men ingen protein ekspresjon ble påvist i de andre normale fibroblast cellestamme FB-43. Tidsavhengig nedregulering av α-SMA ble sett i sfæroider, men ikke i monolagskulturer, forårsaket av degradering av cytoskjelettet i disse fibroblaster går gjennom nemosis. Dette er i tråd med tidligere resultater etter Bizik et al. [14], hvor synkende actin nivåer ble anvendt som en markør for sfæroide degradering. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting.
Figur 1E er et immunoblot av de fire UT-SCC carcinom cellelinjer. Alle av dem uttrykt COX-2, men bare interessant UT-SCC 74A og 74B hadde en indusert p53-protein-nivå, noe som tyder på en p53 mutasjon. Vi kunne ikke oppdage p53 i noen av fibroblast populasjoner, en forestilling om at sammenfallende med rapport fra Qiu et al. [27] der de ikke kunne oppdage somatiske genetiske endringer i kafeer.
Ulike uttrykk for CAF markører i fibroblast stammer
Siden protein nivåer av α-SMA varierte mellom ulike fibroblast populasjoner, vi bestemte seg for å undersøke også uttrykk for andre mye brukt CAF markører FSP1 og FAP. Genuttrykksmønstrene av disse tre genene i fibroblastene dyrket som sfæroider for 0, 24, 48 og 72 timer ble analysert ved hjelp av kvantitativ real-time PCR. Q-PCR ble valgt som metoden i løpet av immunblotting på grunn av dens høyere følsomhet. GAPDH ble brukt som en referanse gen at ekspresjon av målgener ble normalisert til, hvoretter relative fold uttrykk forhold ble beregnet. Basal ekspresjon nivået av α-SMA, FSP1 og FAP var signifikant lavere (P 0,01) i CAF-43-celler enn i normale FB-43 fibroblaster (figur 2A). Imidlertid, som vist i figur 2B, dette var ikke tilfellet med CAF-74 fibroblaster, hvor i forhold til FB-74-celler α-SMA uttrykk forholdet var lik, FSP1 1,4 ganger høyere og FAP uttrykk forholdet overraskende 10 ganger høyere (P 0,01) i CAF-43 celler i forhold til FB-43 celler, men lik eller høyere i CAF-74 fibroblaster. (B) Når vokst som kuler alle fibroblaster downregulated α-SMA uttrykk, men kafeer begynte å gjenvinne uttrykk ved 72 h (P 0,05 i FB-43 vs. CAF-43 og i FB-74 vs. CAF-74) ( C) FSP1 ble nedregulert i normale fibroblaster og i CAF-74 celler, men ikke i CAF-43 celler, (D) og FAP ble oppregulert i alle cellelinjene går gjennom nemosis, mer i kafeer (P 0,05 i 72 timer CAF -43 sammenlignet med 72 h FB-43). Kolonner: gjennomsnitt; feilfelt; SEM.
Nemosis respons av CAF markører mellom disse fibroblast populasjonene viste også variasjon. Den α-SMA nivået ble drastisk nedregulert i kulene, reflekterer protein nivåer og indikerer nedbrytning av cytoskjelettet i disse kulene. Dette gjaldt også for FB-43 celler, som vi ikke kunne oppdage protein uttrykk. Til forskjell fra de normale fibroblaster, i kafeer begynte å gjenvinne den α-SMA-ekspresjon etter 72 timer; når sammenlignet med normale fibroblaster økningen var statistisk signifikant (P 0,05) (figur 2C). FSP1 mRNA ble redusert, som forventet, i både normale fibroblast cellestammer og i CAF-74-celler, men overraskende økning i CAF-43 kuler (figur 2D). Den tredje CAF markør FAP ble indusert i nemosis i alle fibroblast populasjoner, som følge av generell nemosis fingeravtrykk. Denne induksjon var høyere i CAF kuler enn i normale fibroblast kuler (P 0,05 i CAF-43 vs. FB-43, ikke statistisk signifikant på 73 celler på grunn av høy variasjon mellom prøvene) (figur 2E)
. Differential uttrykk for vekstfaktorer i normale og kreft-assosiert fibroblaster
den andre kjennetegn på nemosis er økt produksjon av flere vekstfaktorer, inkludert VEGF, HGF /SF og FGF7 (KGF). Derfor brukte vi Q-PCR for å studere uttrykket nivåer av disse genene i de fire fibroblast-populasjonene. Begge CAF stammer hadde lavere basal uttrykk nivåer av VEGF, HGF /SF (P 0,05) og FGF7 (P 0,01) mRNA i forhold til tilknyttede normale fibroblaster (figur 3A og 3B). Når vokst som kuler alle fire fibroblast populasjonene viste oppregulert VEGF, HGF /SF og FGF7 mRNA uttrykk. VEGF induksjon var høyest i CAF-74 celler (over 15 ganger) (Figur 3C), mens høyeste HGF /SF induksjon ble sett i CAF-43 celler (over 30 ganger) (Figur 3D). FGF7 nivåer ble regulert litt annerledes; over 6 gangers induksjon ble observert i FB-43-celler, på andre celler som hadde et gjennomsnitt på 5-ganger induksjon, og interessant i CAF-74 celler ved 72-timers tidspunktet denne induksjon hadde kommet ned til 2,5 ganger (figur 3E) .
Vekst faktor genuttrykk ble undersøkt ved hjelp av Q-PCR. (A og B) Både CAF-cellelinjer hadde redusert ekspresjon av HGF /SF (P 0,05) og FGF7 (P 0,01) og alle tre vekstfaktorer ble oppregulert i varierende grad i nemosis (C – VEGF, D – HGF /SF og E – FGF7). Kolonner: gjennomsnitt; feilfelt; SEM.
parakrint regulering mellom fibroblaster og SCC celler
Anchorage uavhengig vekst av UT-SCC carcinoma cellelinjer ble testet ved hjelp av soft-agarose analysen. I løpet av tre ukers observasjonsperioden alle fire kreft cellelinjer dannet kolonier, men klar forskjell mellom primære og tilbakevendtumorcellelinjer ble sett (figur 4). Når dyrket alene, begge tilbakevendende tumorcellelinjer UT-SCC-43B og UT-SCC-74B dannet dobbelt så mye kolonier i forhold til primærtumorcellelinjer UT-SCC-43A og UT-SCC-74A; forskjellen var statistisk signifikant i begge tilfeller (P 0,05). Den underliggende monolag av normale fibroblaster FB-43 og FB-74 økte svakt antall 43A og 74A carcinoma cellekolonier, respektivt. Økning i antall kolonier ble ytterligere forsterket når 43A og 74A SCC-celler ble dyrket under påvirkning av CAF-43 og CAF 74-(P 0,05) henholdsvis. Interessant, da dyrkning de mer invasive 43B og 74B SCC celler med FB-43 og FB-74 fibroblaster, ble en nedgang i koloni antall sett; Denne effekten var mer uttalt med 74B-celler (P 0,05 i FB-74 sammenlignet med kontroll). CAF-43 og CAF-74 fibroblaster restaurert antall kolonier til samme nivå som kontroll, men ikke ytterligere styrke koloni dannelsen av tilbakevendende SCC celler.
UT-SCC kolonidannelse ble studert med soft-agarose assay . Alle UT-SCC celler dannet kolonier i myk agarose, tilbakevendende SCC (B og D) dobbelt så mange som primær SCC celler (A og C) (P 0,05). Normale fibroblaster økt antall kolonier av primære karsinomer celler, og dette ble ytterligere forsterket med CAF-celler (P 0,05) (A og C). Tilbakevendende SCC celle kolonidannelse ble hemme med normale fibroblaster (P 0,05 i FB-74 sammenlignet med kontroll) og gjenopprettes til å kontrollere nivået av kafeer (B og C). Kolonner: gjennomsnitt; feilfelt; SEM
UT-SCC kolonidannelse resultatene var på linje mellom celler hentet fra de to individer.; Det var imidlertid variasjon mellom individer når observere tett underliggende enkeltlag fibroblast kulturer. Spontan spheroid dannelse ble sett i den underliggende enlagskultur av FB-43 og CAF-43 fibroblaster ved samtidig dyrket med både 43A og 43B SCC celler (Figur 5A-D). FB-74 og CAF-74 ikke spontant danne kuler under noen av de ovennevnte forhold, men de vokser fortere ved samtidig dyrket med flere ondartede 74B celler (Figur 5G-H). Figurene 5I-J presenterer den spontane spheroid dannelsen av 43 fibroblaster med 43A og 43B SCC celler. Med både UT-SCC cellelinjer, CAF-43 celler dannet signifikant flere kuler enn FB-43 fibroblaster (P 0,05). De to forskjellige SCC cellelinjer påvirket ikke signifikant fibroblast spheroid formasjonen; selv om en svak økning ble sett i CAF-43 kuler med tilbakevendende 43B SCC celler. Ingen av fibroblast typer (FB-43, CAF-43, FB-74 og CAF-74) dannet kolonier i myk agarose.
Representative bilder av underliggende fibroblast monolagkulturer. Spontan clustering (piler) er sett i FB-43 og CAF-43-celler under påvirkning av parede SCC-celler 43A (A og B) og 43B (C og D). I motsetning til dette, FB-74 (E og G) og CAF-74 (F og H) ikke danner kuler. Scale bar 60 mikrometer. Antallet dannede kuler ble beregnet fra de monolag fibroblastkulturer (I og J). CAF-43 celler dannet betydelig flere kuler enn FB-43 celler (P 0,05). Kolonner: gjennomsnitt; feilfelt; SEM.
For å belyse årsaken til ulik atferd av fibroblast påkjenningene på monolagkulturer, og spesielt den langsomme veksten av CAF-74 celler, vi utførte senescence-forbundet beta-galaktosidase (SA- p-gal) farging. SA-β-gal-aktivitet er den mest brukte markeringen for cellulær begynnende alderdom. Prematur stress-fremkalt senescens er forårsaket av oksidativt stress, DNA-skade og onkogen aktivering [28]. Som forventet, CAF-74 celler viste sterk SA-β-gal farging. CAF-43 fibroblaster var også positive, men CAF-74 hadde signifikant mer (P 0,01). Senescent-celler (figur 6)
Representative bilder av fibroblast-monolagskulturer farget for SA-β-gal-aktivitet. FB-43 (A) og FB-74 (C) viser liten eller ingen farging; Kafeer er positive (B og D). Scale bar 200 mikrometer. CAF-74 hadde signifikant mer (P 0,01) SA-β-gal-celler sammenlignet med CAF-43 (E). Kolonner: gjennomsnitt; feilfelt; SEM.
Diskusjoner
Primær karsinom anses å være uorganiserte organer som er sammensatt av ulike celletyper, inkludert kreftceller, fibroblaster og andre mesenchymale celler, og celler knyttet til immunitet og blodkar. Den tumor-mikromiljøet stroma fører til fibroblast aktiverings og parakrin signalering mellom fibroblaster og kreftceller [29]. I nemosis, aktiverte fibroblaster begynne å produsere proteiner som er involvert i inflammasjon, proteolyse og progresjon av kreft og samtidig nedregulere ekspresjon av proteiner cytoskeletal [14] -. [19]
Formålet med dette arbeidet var å undersøke den nemosis responsen fra pasient-matchet normal og kreft-assosiert fibroblaster, og å studere uttrykket mønster av CAF markører og deres atferd i nemosis. Kun en av de normale fibroblast-stammer (FB-43) og en av de kafeer (FB-74) som induseres COX-2 i nemosis. Dette er i motsetning til tidligere publiserte resultater, hvor COX-2 induksjon har blitt betraktet som en karakteristiske særtrekket nemosis. Men i disse studiene fibroblaster har vært fra neonatal opprinnelse og her har vi brukt fibroblaster hentet fra voksne. Dette motstridende resultat indikerer derfor at COX-2 ikke bør utelukkende brukes til å måle nemosis reaksjon, men andre markører, så som profilen av utskilte proteiner, bør undersøkes også.
Den andre viktige trekk ved nemosis er tidsavhengig nedbryting av cytoskjelettet. På proteinnivå tre av fibroblast stammer uttrykte α-SMA, overraskende også normal hud fibroblaster FB-74. Den andre normale fibroblaststamme FB-43 uttrykte ikke α-SMA på proteinnivået. Imidlertid, ved måling av mRNA-nivåer med de mer følsomme Q-PCR-metoden, alle fire fibroblast populasjonene viste α-SMA-ekspresjon, og dette ble nedregulert i nemosis. Den tidsavhengige nedregulering av både protein og mRNA-nivå er på linje med tidligere resultater på nemosis, noe som indikerer nedbryting av cytoskjelettet. Interessant kafeer begynte å gjenvinne den α-SMA-mRNA-ekspresjon etter 72 timer var forskjellen signifikant sammenlignet med deres normale motstykker. I motsetning til våre resultater, en studie av Shannon et al. [30] har vist at normal hud-fibroblaster, men ikke p-fibroblaster uttrykt α-SMA. Imidlertid viste nyere resultater, i tråd med resultatene, at normale fibroblaster orale hurtig α-SMA og dette uttrykket øket når disse cellene ble dyrket i kondisjonert medium oppnådd fra OSCC celler [31]. Disse motstridende resultater kan komme delvis fra den metode som ble anvendt for å måle α-SMA-ekspresjon; i den første en immunoblotting ble anvendt i den andre fremgangsmåten var litt mer følsom immunhistokjemi.
Vi undersøkte også mRNA-nivåene av to andre CAF markører, FSP1 og FAP. I nemosis FSP1 nivåer redusert i FB-43, FB-74 og CAF-74 kuler, men økte i CAF-43 celler. Den tredje undersøkte CAF markør FAP ble oppregulert i nemosis, mer i kafeer enn i normale fibroblaster, forskjellen var signifikant med 43 fibroblast stammer. Med alle tre CAF markører den nemosis respons fulgte mønsteret av redusert uttrykk for cytoskeletal gener (α-SMA og FSP1) og økning i proteolytisk genekspresjon (FAP). Tydelig forskjellig respons ble sett med CAF-43 cellene der, i stedet for nedregulering av FSP1 økte nivåene i nemosis.The heterogenitet av fibroblaster blir tydelig når man ser på de basale nivåer av CAF markør uttrykk; CAF-43 celler hadde lavere nivåer av alle tre markører, CAF-74 hadde mindre α-SMA, litt mer FSP1 og over 10 ganger mer FAP. Disse resultatene understreker også at α-SMA, den mest brukte CAF /myofibroblast markør, bør ikke bare brukes til å definere aktiverte fibroblaster.
En annen kjennetegn på nemosis er dannelse av vekstfaktorer. Det er blitt vist at p-fibroblaster produsere betydelig mer FGF7 og HGF /SF sammenlignet med hudfibroblaster [30]. Disse to vekstfaktorer, sammen med VEGF, er kjent for å være viktig i sårheling og progresjon av kreft [32], [33]. Basal ekspresjon av VEGF, HGF /SF og FGF7 mRNA var lavere i kafeer enn i normale fibroblaster, og dette er i motsetning til tidligere resultater [30]. Men veksten av disse cellene var tregere enn for deres normale kolleger, som kanskje gjenspeiler deres redusert produksjon av vekstfaktorer. SA-β-gal aktivitet av kafeer støtter denne teorien, noe som indikerer at disse cellene er senescent. Behovet for disse vekstfaktorer for å bli utskilt av fibroblaster kan bli redusert i kafeer fordi tumorcellene selv, sammen med infiltreres makrofager og endotelceller, er i stand til å produsere disse faktorene. Som forventet, VEGF, HGF /SF og FGF7 mRNA ble oppregulert i fibroblast nemosis, og graden av induksjon variert mellom fibroblast-populasjonene. VEGF induksjon var høyest i CAF-74 kuler, HGF /SF i CAF-43 kuler og FGF7 i FB-43 kuler.
Basert på disse resultatene ser det ut til at evnen til normale og kreft-assosiert fibroblaster å produsere disse vekstfaktorer i nemosis er noe relatert til den grad det er behov for i kreft progresjon. Avhengigheten av svulster på stromale fibroblaster, og spesielt på de vekstfaktorer som de produserer, avtar i løpet av tumorprogresjon. Epitelceller krever FGF7 for å bryte den epiteliale polarisasjon. FGF7 blir bare uttrykt av stromale celler og dens reseptor FGFR2IIb bare av epitelceller, som indikerer den rolle FGF7 i begynnelsen av tumorprogresjon [34]. Av de studerte fibroblast populasjoner av FB-43 celler, som synes å være mest vanlige av de studerte stammer (basert på induksjon av COX-2 og mangel på α-SMA), hadde den høyeste FGF7 induksjon i nemosis. HGF /SF er nødvendig for migrering /spredning av epitelceller fra den første knekkpunktet. Nemotic CAF-43-celler produsert mer HGF /SF enn de andre tre cellestammer. Støtte dette Kankuri et al. [15] har vist at HGF /SF produsert av fibroblast kuler direkte fremmer kreftcelle invasjon. Også en annen studie har vist at orale fibroblaster kjøre invasjon av OSCC celler ved å øke utskillelsen av HGF /SF [35]. VEGF er nødvendig senere i tumorprogresjon når kreftcellemassen strekker seg et punkt hvor det ikke lenger kan vokse uten oksygentilførsel. VEGF, utskilt av fibroblaster induserer angiogenese ved å rekruttere endotelceller til å danne nye blodårer [36]. . CAF-74 celler, som er senescent, har den klart høyeste nivået av VEGF i nemosis
Det har vært godt etablert at kafeer, men ikke normale fibroblaster, er i stand til å fremme tumorprogresjon [37] – [ ,,,0],39]. Nyere resultater har vist at i utgangspunktet normale fibroblaster hemme veksten av kreftceller [2], og våre nåværende resultater enig med at begrepet. Vi viser her at normale fibroblaster faktisk hemme koloni dannelsen av tilbakevendende SCC celler, men merkelig dette ble ikke sett med primærtumorceller. De kafeer synes å være i stand til å påvirke bare de primære SCC celler og ikke tilbakevendende celler. De kafeer produserte lavere nivåer av vekstfaktorer, og det kan være at på grunn av dette de er i stand til å påvirke mer responsive primære SCCS, men mindre følsomme tilbakevendende cellene ikke svare på dette lavere mengde utskilte vekstfaktorer.
Den observerte spontan spheroid dannelsen av FB-43 og CAF-43 i monolagkulturer er i tråd med resultatene fra Kankuri et al. [15], hvor spontan gruppering av fibroblaster, dvs. nemosis, kunne oppnås ved tilsetning av tumorcelle-avledet kondisjonert medium til en fibroblast monolag. Men vi fant ikke dette med fibroblast stammer fra den andre SCC pasienten. Dette kan være delvis på grunn av induksjon av p53 tumor suppressor i 74A og 74B SCC-celler. Likevel, fibroblaster fikk vokse raskere under påvirkning av 74B SCC-celler; Dette var også tilfelle med CAF-74 celler som synes å være i en tilstand av stress-indusert alderdom. Videre mer, vi fikk ikke se forankringsuavhengig vekst av fibroblaster, i konflikt med resultatene oppnådd med prostate- og prostata karsinom assosiert fibroblaster [40]. Mulige forklaringer på dette er individuelle variasjoner og opprinnelsen til fibroblaster. Det er verdt å merke seg at i den myke-agarose eksperimenter SCC-celler og fibroblaster ikke var i direkte kontakt med, men adskilt med et fast lag av agarose, og kulturene ble ikke etterfylles med frisk medium. Derfor er den parakrine signaleringen mellom disse to celletyper må være mediert av løselige faktorer.
Som konklusjon, denne studien viser klart at fibroblaster erholdt fra forskjellige individer varierer i genekspresjon og adferd, og at ekspresjon av CAF markører er forskjellig normale fibroblaster og kafeer i nemosis. Både normale og kreftassosiert fibroblaster modulere tumorceller, normale fibroblaster ved inhibering av veksten av invasive SCC-celler og kafeer ved ytterligere å forsterke veksten av primære SCC-celler. Nemosis, en
in vitro
modell av fibroblast aktivering, kan ha sin
in vivo
motstykke i kreft-assosiert fibroblaster og er et verdifullt verktøy i å studere variasjoner mellom fibroblaster hentet fra ulike individer. Nemosis respons, særlig av CAF markører a-SMA og FAP og kunne derfor anvendes som en prognostisk markør for å forutsi stromal reaksjon av tumorer.
Materialer og metoder
Cellestammer og cellekultur
Alle brukte cellestammer hadde tidligere blitt etablert [25], [26], [41] og ble gitt av Dr. Reidar Grenman (Åbo universitet Central Hospital, Finland). I korte trekk, ble UT-SCC-43A (43A) celler hentet fra primærtumor av en 75 år gammel kvinne med gingival sårdannelse og metastasering. Histologi (T4N1M0) var et godt differensiert SCC. UT-SCC-43B (43B) celler ble etablert fra resected residiv av tumor. UT-SCC-74A (74A) celler ble hentet fra en 31-år gammel mann som har SCC i språklige høyre marg (T3N1M0). UT-SCC-74B (74B) cellelinje ble etablert fra en metastase funnet senere i nakken. Pasienten-matchet FB-43 og FB-74 normale fibroblaster ble erholdt fra huden og CAF-43 og CAF-74 fibroblaster ble oppnådd fra stroma i de respektive munn SCC. Den mesenchymal opprinnelse av fibroblast-stammer opprinnelig ble bekreftet ved positiv farging for vimentin og negativ farging for cytokeratin ved hjelp av immunhistokjemi.
Alle cellepopulasjonene ble dyrket ved + 37 ° C i 5% CO
2 atmosfære i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) og supplert med 5% føtalt kalveserum (FCS) (Invitrogen), 0,3 mg /ml glutamin, 100 ug /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin. Fibroblast sfæroider ble dannet som tidligere beskrevet [17]. I korte trekk ble 150-ul aliquoter /brønn av en enkelt cellesuspensjon (1,3 x 10
5 celler /ml) ble sådd ut på agarose-overtrukket U-bunn 96-brønners plater (Costar, Cambridge, MA).
