Abstract
hemming av DNA-skade svar pathway synes å være en attraktiv strategi for kreftterapi. Det ble tidligere rapportert at i gnagerceller eksponert for varmestress, ble cellevekst fremmet av aktiviteten av DNA-avhengig proteinkinase (DNA-PK), et enzym som er involvert i DNA ikke-homolog ende sammenføyning (NHEJ) som kreves for dobbel tråd bryte reparasjon. Fraværet av en fungerende DNA-PK ble assosiert med nedregulering av varmesjokkprotein 70 (HSP70). Formålet med denne studien er således å undersøke rollen til DNA-PK inhibering i varme-indusert apoptose i humane cellelinjer. Inhibitorene av fosforylering av DNA-PK katalytisk subenhet (DNA-PKCS) på Ser2056, såsom NU7026 og NU7441, ble benyttet. Videre slå ned på DNA-PKCS ble utført ved hjelp av små interfererende RNA (Sidna-PKCS). For varmepåvirkning, ble celler plassert i vannbad ved 44 ° C i 60 min. Apoptose ble evaluert etter 24 timers inkubering strømnings cytometrically. Proteiner ble hentet etter 24 timer og analysert for HSP70 og HSP40 uttrykk ved Western blotting. Total RNA ble ekstrahert 6 timer etter behandling og analysert ved hjelp av en GeneChip® microarray system for å identifisere og velge de oppregulert gener (≥1.5 fold). Resultatene viste en forbedring i varmeinduserte apoptose i fravær av fungerende DNA-PKCS. Interessant nok ble uttrykket nivåer av HSP70 og HSP40 forhøyet i fravær av DNA-PKCS etter varmestress. Resultatene av genetisk nettverksanalyse viste at HSP og Jun gener ble oppregulert uavhengig av DNA-PKCS i utsatt forelder og slå ut celler. I nærvær av fungerende DNA-PKCS, var det en observert oppregulering av anti-apoptotiske gener, slik som NR1D1, mens i fravær av DNA-PKCS de pro-apoptotiske gener, slik som EGR2, ble fortrinnsvis oppregulert. Fra disse funnene, konkluderte vi med at i humane celler, kan inaktivering av DNA-PKCS fremme varme-indusert apoptose uavhengig av varmesjokkproteiner
Citation. Okazawa S, Furusawa Y, Kariya A, Hassan MA, Arai M, Hayashi R, et al. (2013) Inaktivering av DNA-avhengig protein kinase Fremmer Heat-indusert apoptose Uavhengig av Heat-Shock Protein Induksjon i Human Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (3): e58325. doi: 10,1371 /journal.pone.0058325
Redaktør: Michael Sherman, Boston University Medical School, USA
mottatt: 06.11.2012; Godkjent: 01.02.2013; Publisert: 11 mars 2013
Copyright: © 2013 Okazawa et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte for denne studien ble gitt av en Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (22390229), Japan Society for Promotion of Science. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ondartede svulster er et stort problem i verden som i det medisinske forskningsfeltet er utvikling av effektive behandlingsformer har alltid vært på toppen av forskningsinteresser i flere tiår. Dette målet har vedvart over flere år til tross for de mange terapeutiske verktøy tilgjengelig (for eksempel kirurgi, cellegift, strålebehandling, hypertermi [1], høy intensitet fokusert ultralyd (HIFU) [2], immunterapi [3], etc.), og rekke deres strategiske kombinasjoner [1], [4], [5]. Dette er fordi ingen av disse verktøyene har fungert perfekt eller trygt i utrydde kreft. Men for å sette vitenskapelig grunnlag til funn av nye tilnærminger, blir obligatorisk en grundig forståelse av kreft molekylærbiologi. Nylig studiene på DNA skade respons (DDR) trasé gjengitt dette området som lovende i behandling av kreft. Kombinasjonen av DNA-skadende midler med molekylære rettet mot medikamenter mot aktørene som er involvert i DNA reparasjon veier kan føre til en synergistisk effekt i å drepe kreftceller [6]. Studiene på DDR viste en overflod av molekylære mål som Ataxia telangiectasia mutated (ATM), ataxia telangiectasia og Rad3 relaterte (ATR), og DNA-avhengig proteinkinase (DNA-PK). Disse proteinene er medlemmer av phosphoinositol 3-kinase-lignende kinase (Pikk) familie som virker som transdusere i DDR for å aktivere flere proteiner involvert i cellulær respons til DNA-skade [7] -. [9]
Det ble rapportert den DNA-PK kommuniserer med varmesjokktranskripsjonsfaktor (HSF1) [10]. I en studie DNA-PKCS negativ musecellelinje scva2 og en matchet DNA-PKCS positiv cellelinje sc (8) -10 avledet fra scva2 ved innføring av et DNA-PKCS strukturelle gen, ble utsatt for varmebehandling og den grad av varme-indusert apoptose ble evaluert. De DNA-PKCS negative celler viste noe forsinket HSP70 induksjon som nådde en lavere steady state nivå. Denne observasjonen ble begrunnet med HSF1 og DNA-PKCS interaksjon [11]. Men som DDR aktivering av hypertermi ikke ble gjenkjent på den tiden, involvering av ATM aktivering, p53 fosforylering [12], og induksjon av γH2AX [13] av varmestress ble ikke rapportert. Nylig har fosforylering av p53 ved Ser15, så vel som den intracellulære signalisering av den ikke-homologe ende sammenføyning (NHEJ) blitt avslørt. I tillegg er flere andre scenarier av DNA-PK engasjement i varmestressrespons, for eksempel celleoverlevelse signal oppregulering av Akt fosforylering gjennom DNA-PK [14] og aktivering av NFkB p50 [15], er også rapportert. Videre har vår gruppe vist at inhibering av DNA-PK av DNA-PK-inhibitorer og RNAi teknikken fremmet ultralyd-indusert celledød uavhengig av p53 fenotype [16].
I denne studien vil vi likeledes undersøke rollen til DNA-PK i varmeinduserte apoptose i forskjellige humane kreftcellelinjer. Vi hypotese at den DNA-PKCS hemming kan forsterke hypertermi-indusert celledød. Detaljene i de underliggende mekanismene vil også bli studert.
Diskusjon
Heat-indusert apoptose ble forsterket av DNA-PK hemmere
Kontroll og behandlede celler ble analysert for
Resultater og omfanget av kromatin kondens som en indikator for apoptoseinduksjon ved hjelp av en kjernefysisk-ID ™ grønn kromatin kondens kit målt flyt cytometrically. Analysen ble utført 24 timer etter varme eksponering i fravær eller nærvær av DNA-PK-inhibitorer. Som vist i figur 1A B, både DNA-PK hemmere NU7026 og NU7441 forbedret apoptose betraktelig etter varmestress. Interessant, NU7026 hadde ingen effekt på celler under normale forhold, mens NU7441 indusert betydelig apoptose i HeLa-celler i fravær av varmestress. Dette var sannsynligvis på grunn av høyere potens av den siste mot andre medlemmer av familien Pikk proteiner slik som pattedyr-target av rapamycin (mTOR) og phosphatidylinositide-3-kinase (PI3K) [17].
Chromatin kondens i cellene i nærvær av 10 uM av (a) NU7026, eller (b) NU7441 Det bør bli angitt her at DMSO ble bekreftet ikke å interferere med de oppnådde resultater (data ikke vist).. (C) inhibering av DNA-PKCS fosforylering ved Ser2056 ved 10 uM NU7026 og NU7441 6 timer etter eksponering for varmestress. (D) Tidsavhengig Western blot-analyse av HeLa-celler (0-6 h) viser endringene i fosforylering av DNA-PKCS ved Ser2056 (DNA-PKCS-pS2056) og HSP; HSP70 og HSP40, med 10 mikrometer av NU7026. Caspase-3-spalting og HSP ekspresjon ved Western blotting 24 timer etter behandling i fravær eller nærvær av 10 uM (e) NU7026 eller (f) NU7441. NU7441 indusert svak caspase-3-aktivering uten varmeeksponering i forstørrelse med kromatin kondens data. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (*, P 0,05, **, P 0,01; NS, ikke-signifikant).
I Western blotting, viser figur 1C at begge hemmere kunne lykkes undertrykke fosforylering av DNA-PKCS ved Ser2056 på 6 timer etter eksponering for varmestress. Tidsavhengig analyse av celler viste at fosforylering av DNA-PKCS ved Ser2056 økes gradvis med tiden opp til 6 timer etter varmebehandling. På samme tid var selvfølgelig der en samtidig økning i uttrykket av HSP70 og HSP40. Påfallende, etter DNA-PK-hemming, DNA-PKCS-pS2056 redusert mens HSP70 og HSP40 uttrykk beholdt sin tidsavhengig økning (figur 1D). Retensjonen av HSP økning mønster i fravær av DNA-PK kommer i motsetning til den tilhørende reduksjon rapporteres i museceller, og kan således reflektere at sensibilisering av humane celler til apoptose via DNA-PK-hemming kan operere uavhengig av HSP. For å bevise denne spesielle forskjell vi bekreftet at 10 uM NU7441 behandling reduserte ekspresjon av HSP70 i kinesisk hamster ovarie-celler, CHO-K1 (figur S1).
Celledød ved apoptose-induksjon ble ytterligere bekreftet ved caspase- 3 cleavage. I figur 1E F, caspase-3 cleavage ble oppdaget 24 timer etter oppvarming. Caspase-3 cleavage ble betydelig forbedret i nærvær av inhibitorer spesielt NU7441. NU7441 behandling indusert svake bånd i ikke-oppvarmet celler i forstørrelse med kromatin kondens data. Videre viser dataene at økningen i HSP70 og HSP40 ble oppholdt opp til 24 timer etter behandling med DNA-PK-hemmer.
Heat-indusert apoptose ble forsterket av DNA-PKCS knockdown ved hjelp av små forstyrrelser RNA
for å bekrefte rollen av DNA-PK i varmeveks-indusert apoptose, utførte vi alternative forsøk på celler som mangler en funksjonell DNA-PK gjennom stanse proteinet ved en DNA-PKCS rettede siRNA (Sidna-PKCS). Transfeksjonsagensene prosedyrer ble først bekreftet ved Western-blotting 48 og 72 timer etter transfeksjon. Figur 2A viser fravær av endogene DNA-PKCS bånd ved alle konsentrasjoner av Sidna-PKCS. Ytterligere eksperimenter ble således utført ved bruk av celler transfektert ved 20 nM. Celler transfektert med luciferase siRNA (siLuc, 20 nM) under lignende betingelser ble tatt som negative kontroller. Ved eksponering for varme, celler som mangler funksjonell DNA-PK viste signifikant kromatin kondensering sammenlignet med celler transfektert med siLuc (figur 2B). Til støtte økte spaltes caspase-3 bånd 24 timer etter behandling betydelig i Sidna-PKCS-transfekterte celler. Disse resultatene støtter ytterligere rolle DNA-PKCS i varme-indusert apoptose. Igjen var det ingen tydelig sammenheng mellom HSP og DNA-PK lyddemping etter eksponering for varmestress (figur 2C). Dette funnet kommer i motsetning til rapporter på gnager celler som mangler funksjonell DNA-PK viser at ekspresjonsnivået av HSP70 etter varmestress ble nedregulert [11] (fig S2). For å bekrefte generalisering til andre menneskelige celler, gjennomførte vi lignende eksperimenter på to varianter av ondartede glioma celler, nemlig; M059K celler med fungerende DNA-PK og DNA-PKCS defekte M059J variant. Som vist i fig S3, ekspresjonen av HSP70 og HSP40 var lik i begge celler, uavhengig av DNA-PK status. Som sådan, kan det konkluderes at i humane celler, inhibering av DNA-PK forbedrer varmeinduserte apoptose uavhengig av HSP.
(a) HeLa-celler transfektert med forskjellige doser av små forstyrrelser RNA mot DNA-PKCS (Sidna-PK) og luciferase (siLuc); (B) DNA-PKcs- knockdown celler eksponert for varmestress viste høyere prosentandel av kromatin kondens; (C) Den knockdown av DNA-PKCS forbedret caspase-3-aktivering følgende varmestress uavhengig av HSP70 og HSP40 uttrykk 24 timer etter behandling; (D) HSF1 aktiv form bånd ble forbedret i fravær av DNA-PKCS 1 time etter eksponering for varmestress. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (** P 0,01, NS, ikke-signifikant).
Ekspresjon av HSF1 aktiv form ble analysert i HeLa-celler ved en timer etter varmeeksponering ( 44 ° C i 60 min). HSF1 aktive formen ble oppregulert i fravær av DNA-PKCS (figur 2D). Dette funnet reflekterer at HSF1 aktivering krever DNA-PKCS.
Gene Expression Analysis
Figur 3A viser at varmestress kunne up-regulere 403 probe sett av ≥1.5 fold i både siLuc- og Sidna-PKCS-transfekterte celler (gruppe 1). En annen 160 probe settene var oppregulert under varme stress ved ≥1.5 fold i siLuc-transfekterte celler (gruppe 2) mens 179 probe settene ble oppregulert ved ≥1.5 fold i Sidna-PKCS-transfekterte celler (gruppe 3). Den genetiske nettverk som består gruppen 1 gener viste at HSP, som HSP70 (HSPA6) og HSP40 (DNAJB1), ble sterkt uttrykt (figur 3B). Pro-apoptotiske gener som juni proto-onkogen (juni) og FBj murine osteosarkom viral onkogen homolog B (FOSB) ble også identifisert som oppregulert gener. Oppreguleringen av gruppe 1 gener i begge cellevariantene tyder på at disse genene reagerer på temperatur- belastning uavhengig av DNA-PK status, det som ytterligere støtter Western blot-data. På samme måte som HeLa-celler, våre tidligere studier viste at ekspresjonen av grunn-regionen leucin zipper (bzip) transkripsjonsfaktorer juni, ATF3 og FOS ble også forbedret i humane lymfom U937-celler som viser apoptose etter eksponering for varmestress ved 44 ° C i 15 min [18]
(a) Illustrasjons Venn-diagram av oppregulert gener i siLuc- og Sidna-PKCS-transfekterte celler etter eksponering for varme stress.; (B) Felles oppregulert gener i både siLuc- og Sidna-PKCS-transfekterte celler eksponert for varmestress (Gruppe 1); den genetiske nettverk vises grafisk som noder (gener) og kanter (de biologiske relasjoner mellom gener). Noden farge indikerer ekspresjonsnivået av det respektive genet. Noder og kanter, er vist i ulike former og etiketter som representerer de funksjonelle klasser av gener og arten av forhold mellom noder, respektivt. Dette nettverket viser at HSP gener som ikke var assosiert med DNA-PK status og at juni-relaterte gener ble oppregulert i respons til varme-indusert celleskade.
ekspresjonsprofilen av noen utvalgte gener nemlig; HSPA6, DNAJB1, DNAJA4 og juni, ble bestemt ved bruk av real-time qPCR (figur 4A-D). Resultatene viste at mRNA-nivåene av disse genene ble signifikant økt etter varmestress.
HeLa-celler ble behandlet ved 44 ° C i 60 min og deretter inkubert ved 37 ° C i 6 timer. De mRNA ekspresjonsnivåer av (a) DNAJB1 (HSP40), (b) HSPA6 (HSP70), (c) DNAJA4, (d) juni, (e) NR1D1, (f) AHR, (g) BIRC3, (h) JUND , (i) EGR2 og (j) KLF4 normalisert til GAPDH-ekspresjonsnivået. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (*, P 0,05, ** P 0,01; NS, ikke-signifikant)
Deretter vi avbildet mulig genetiske nettverk som ville omfatte. oppregulert gener i siLuc-transfekterte celler (gruppe 2) (figur 5A). Genene identifisert inkludert pro-apoptotiske gener som virker gjennom TNFa messige reaksjonsveier, for eksempel TLR4 [19], RIPK2 [20], og TNFRSF10B, også kjent som DR5, som kan aktiveres av tumor nekrose faktor-relatert apoptose induserende ligand [21 ]. De tumornekrosefaktorreseptor-assosiert faktorer, slik som TRAF2 og TRAF6, ble også påvist. TRAF2 mediere signalering fra TNF-R-superfamilien for aktivering av JNK (c-Jun N-terminal kinase) eller NFkB [22]. TRAF6 deltar også i signalveien fra TLR super og induserer apoptose gjennom en caspase-avhengige veien og øker NFkB aktivisering [23]. TRAF3IPs samhandler med Traf familie proteiner og enten jeg-kB kinase eller MAP kinase [24]. IRF1 genet induserer celledød i nærvær av INFγ og TNFa [25]. På den annen side, ble enkelte celle overlevelse gener også identifisert. Oppreguleringen av overlevelses genene ble igjen bekreftet ved qPCR-analyse. Figur 4E viser at mRNA nivået av NR1D1 ble oppregulert i siLuc-transfekterte celler mens nedregulert i DNA-PKCS knockdown celler. NR1D1 er avbildet i nettverket som genet som kan påvirke TLR4. NR1D1 ble rapportert å være en LXR mål-genet i humane makrofager og undertrykker LXR-indusert-TLR-4-ekspresjon [26]. Interessant nok er NR1D1 en av de intranuclear-reseptorer og anses å bidra til den biologiske system, er imidlertid den biologiske modus til dets virkning er ukjent. En fersk rapport antyder NR1D1 kan virke på fettmetabolisme enzymaktivitet i human epidermal vekstfaktor-reseptor 2 (ErbB2) -positivt brystkreft, og til å fungere i celleoverlevelse [27], [28]. Dermed kan det være at NR1D1 induseres under varme stress ved DNA-PK for å fremme celle metabolisme for å overleve. Tilsvarende figur 4F G viser differensial uttrykk for AHR og BIRC3 i begge celle varianter. AHR har mange funksjoner i ATM-signalering, ben differensiering, Th17 lymfocytt differensiering, P450-ekspresjon og regulering av NFkB veien [29], [30]. I tillegg forbedrer AHR den cytobeskyttelse messige genet SERPINE1 [31] som også ble identifisert som en opp-regulert gen i vår tidligere studier [32], [33]. BIRC3 (cellulær apoptose inhibitor av protein 2; cIAP2) er en av de inhibitorer mot apoptose familieproteiner. BIRC3 induseres ved TNFa via NFkB vei, og kan induseres av andre veier, inkludert PI3K [34]. På dette punktet, var det viktig å bekrefte rollen til disse overlevelses gener i å redde celler etter varmestress eksponering. For dette utførte vi knockdown eksperimenter mot NR1D1 og BIRC3 i HeLa celler etterfulgt av varmebehandling. Effektiviteten av knock down ble bekreftet ved qPCR-analyse 24 timer etter transfeksjon (fig S4). Transfekterte celler ble eksponert for varmestress 24 timer etter transfeksjon. Western blot analyse viste at det spaltede caspase-3 nivåer økte noe i siNR1D1- og siBIRC3-transfekterte celler 24 timer etter behandlingen (fig S5). Celler som mangler NR1D1 vist signifikant økning av kromatin kondensering sammenlignet med celler transfektert med siLuc, mens knockdown av BIRC3 litt, men ikke signifikant, økning i prosentandelen av celler med kondensert kromatin følgende varmebehandling (figur S6).
( a) oppregulert gener i varmeutsatte siLuc-transfekterte celler (gruppe 2 i fig. 3A). Denne gruppen består av anti-apoptotiske gener som NFkB pathway relaterte gener, AHR og NR1D1; (B) oppregulert gener i varmeutsatte Sidna-PKCS-transfekterte celler (gruppe 3 i fig. 3A). Denne gruppen består av pro-apoptotiske gener som normalt hemmet av DNA-PK aktivitet som EGR2, KLF4 og ATF4.
Figur 5B illustrerer mulige genetiske nettverk som vil omfatte de oppregulert gener i Sidna -PKcs-transfekterte celler (gruppe 3). Figur 4H-J gi qPCR resultater for noen utvalgte gener, nemlig JUND, ERG2 og KLF4. Blant de oppregulert gener er JUND som oppfører seg på samme måte som JUN proteiner til transactivate en AP-1-responsiv promoter sammen (figur 4H). JUND viser en celle avhengig rolle i å forebygge celledød i UV-stresset mus embryonale fibroblaster [35], og samtidig forbedre UV-indusert caspase-3-aktivitet i menneskelig myeloblastisk leukemi [36]. SOCS1 uttrykk er indusert av TLR stimulering og hemmer JAK /STAT signalering [37] som negative tilbakemeldinger modell [38]. SOCS1, som reguleres av JUND i T-celler [39], regulerer varigheten av NFkB signalering ved å redusere ekspresjon av NFkB-avhengige gener [40]. PLAUR er en urokinase-type plasminogen aktivator reseptor-genet. PLAUR regulerer endotelisk celleoverlevelse og er viktig for VEGF-indusert anti-apoptose [41]. De over uttrykk for JUND fører til nedregulering av VEGFA mRNA [42].
Den genetiske nettverk bekrefter også oppregulering av flere pro-apoptotiske gener som går i samarbeid med den observerte forbedringen i apoptose i fravær av DNA-PK. EGR2 spiller en nøkkelrolle i PTEN-indusert apoptotiske sti. ERG2 ble forskjellig økt i Sidna-PK slå ned celler (Figur 4i). Den over uttrykk for EGR2 induserer apoptose i forskjellige tumorcellelinjer via BNIP3L og BAK [43]. CYCS (cytokrom c-genet som induserer apoptose gjennom BCL-2 veien ved utgivelsen fra mitokondriene til cytoplasma), aktivere transkripsjonsfaktor 4 (ATF4) (hjelpemidler i oppregulering av pro-apoptotiske protein C /EBP-homolog protein uttrykk [ ,,,0],44]), og sink-finger transkripsjonsfaktor KLF4 (rapportert å være involvert i apoptose-induksjon in T-celle leukemi [45]) ble alle identifisert som opp-regulerte gener. Økningen i mRNA-nivået av KLF4 var under signifikansnivået (p = 0,078), men tendensen var merkbar i alle replikatene (figur 4J). Disse pro-apoptotiske gener kan bli inhibert av DNA-PK-aktivitet og således i fravær av en funksjonell DNA-PK, kan disse genene føre til en forbedring av varme-indusert apoptose.
Materialer og Metoder
Kjemi
Den selektive DNA-PK inhibitor NU7026 (2- (morfolin-4-yl) benzo [h] chomen-4-one) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St Louis, MO) og NU7441 (8- (4-Dibenzothienyl) -2- (4-morfolinyl) 4H-1-benzopyran-4-on) ble kjøpt fra Axon medchem (Groningen, Nederland). De ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) ved en sluttkonsentrasjon på 10 mM. Stamløsninger ble lagret ved -20 ° C inntil bruk.
Cellelinjer og behandling
Menneskelig livmorhalskreft HeLa S3 celler (Riken, Tsukuba, Japan), menneskelig maligne gliomer M059K og dens DNA- PKCS defekt variant M059J (levert av A. Takahashi, Gunma University, Japan), ble alle dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin antibiotisk blanding. Og ovarieceller fra kinesisk hamster CHO-K1 og dets DNA-PKCS defekte variant V3-celler [46] (Riken) ble alle dyrket i MEMα supplert med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin antibiotisk blanding. Oppvarming ble utført ved å nedsenke et parafilm lukkede cellekulturplate i et vannbad ved 44 ° C i 60 min. Temperaturen ble overvåket med et digitalt termometer (# 7563, Yokogawa, Tokyo, Japan). I hemming eksperimenter, cellene ble pre-inkubert med 10 pM av NU7026 og NU7441 i 30-60 min, etterfulgt av varmeeksponering. Behandlet celler ble deretter inkubert ved 37 ° C inntil analyse uten medium utveksling.
Chromatin Kondens Analyse
Kontroll og behandlede celler ble samlet 24 timer etter behandling og farget ved hjelp av en kjernefysisk-ID ™ grønn kromatin kondens deteksjon kit (Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York) i henhold til produsentens protokoll. Omfanget av kromatin kondens ble målt ved å beregne fluorescens intensiteten av Nuclear-ID ™ grønt i forhold til kontroll med flowcytometri (Epics XL, Beckman Coulter, Miami, FL).
Western blotting analyse
Celler ble løst i lyseringsbuffer (50 mM NaCl, 1% Nonidet P-40 og 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) inneholdende natrium-ortovanadat og protease inhibitor cocktail (Nacalai tesque, Kyoto, Japan). SDS-polyaclylamidegel elektroforese og Western blotting ble utført som beskrevet andre steder [47]. De primære antistoffene som ble brukt var som følger: et monoklonalt muse anti-HSP70-antistoff (MBL, Nagoya, Japan); en mus monoklonalt anti-HSP40 antistoff (MBL); et kanin polyklonalt anti-kaspase 3 antistoff som gjenkjenner hele lengden caspase-3 (35-kDa), så vel som fragmenter (19- og 17-kDa) av aktivert enzym (Cell Signaling Technology, Danvers, MA); en kanin polyklonale anti-fosfo DNA-PKCS ved Ser2056 antistoff (Abcam, Cambridge, UK); en kanin monoklonale anti-DNA-PKCS antistoff (Epitomics, Burlingame, CA); en kanin polyklonale anti-HSF1 antistoff (Stressgen BioReagents, Victoria, Canada); og et mus monoklonalt anti-glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) antistoff (Organon Teknika, Durham, North Carolina). Immunreaktive proteiner ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence (ECL) detection system på en selvlysende bilde analysator (LAS-4000, Fujifilm, Tokyo, Japan).
Band tettheter ble kvantifisert ved Image J (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2012.) og de relative mengder proteiner assosiert med hver spesifikke antistoff ble normalisert til GADPH band.
Transfeksjon med små interfering RNA (siRNA)
Negativ kontroll luciferase siRNA og DNA-PKCS målrettet siRNA ble hentet fra Nippon Gene Material (Toyama, Japan), og Thermo Fisher Scientific, Dharmacon produkter (Lafayette, CO), respektivt. De sirnas målretting NR1D1 (Rev-erbα) og BIRC3 (c-IAP2) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnolgy, Santa Cruz, CA. Transfeksjon ble utført på HeLa-celler ved å bruke RNAi Max (Invitrogen, Carlsbad, CA) i henhold til fremstillingen protokoll. I korte trekk, ble HeLa-celler samlet opp, vasket og suspendert i fullstendig vekstmedium uten antibiotika. Cellene ble sådd ut ved en tetthet på 2,5 x 10
4 celler /brønn i 12-brønners plater og til venstre for å feste i 24 timer. For transfeksjon ble 800 ul Opti-MEM (Invitrogen) lagt til celler etterfulgt av 200 ul Opti-MEM som inneholder RNAi max /siRNA komplekser forberedt 20 min før tillegg (Omvendt transfeksjon protokollen). Seks timer senere ble transfeksjonen mediet erstattet med friskt komplett medium uten antibiotika. Deretter ble cellene inkubert i ytterligere 42 timer. Tretti minutter før varmebehandling, ble mediet byttet med komplett medium med antibiotika.
RNA Isolation
Total RNA ble ekstrahert fra cellene ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) og behandlet med DNase i (RNase-fri DNase kit, Qiagen) i 15 min ved romtemperatur for å fjerne resterende genomisk DNA. RNA kvalitet ble analysert ved hjelp av en Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). RNA prøver som hadde RNA integritet nummer (RIN) verdier over 9,5 ble ansett akseptabelt.
Microarray og Computational genuttrykk Analyser
Gene uttrykk ble analysert ved hjelp av en GeneChip® Menneskelig Gene 1,0 ST Array flekket med ca 28869 probe sett (Affymetrix, Santa Clara, CA). Prøver for matrise hybridisering ble fremstilt som beskrevet i Affymetrix GeneChip® Expression tekniske håndboken. De skannede arrays ble analysert ved hjelp av GeneChip® Analysis Suite-programvaren (Affymetrix). De oppnådde hybridisering intensitet data ble analysert ved hjelp av GeneSpring® analyseprogramvare ver 11.5 (Silicon Genetics, Redwood City, California) for å trekke ut viktige gener. For å undersøke genet ontologi, inkludert de biologiske prosesser, cellulære komponenter, molekylære funksjoner og genetiske nettverk, ble innhentet data analysert ved hjelp av verktøyene oppfinnsomhet Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, Mountain View, CA, USA), en web-levert søknad som muliggjør identifisering, visualisering, og utforskning av molekylære interaksjoner nettverk i genuttrykk data [48]. Fullstendige lister over probe sett fra alle prøver er tilgjengelig på Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE39063).
Fast -time Kvantitativ Polymerase Chain Reaction (qPCR)
sanntids~~POS=TRUNC qPCR analyse ble utført på Mx3000P® real-time PCR system (Stratagene Japan, Tokyo, Japan) ved hjelp SYBR® Premiks Ex Taq (Takara Bio, Shiga , Japan) i henhold til produsentens protokoll. Revers transkriptase reaksjon (PrimeScript® reagent Kit, Takara Bio) ble utført med DNase-behandlet totalt RNA. Primerne ble utformet basert på følgende database sekvenser: NM 006 145, dnaJ (HSP40) homolog, underfamilien B, medlem 1 (DNAJB1); NM 002155, heat shock 70 kDa protein 6 (HSP70B «) (HSPA6); NM 018602, dnaJ (HSP40) homolog, underfamilien A, del 4 (DNAJA4); NM 002228, juni proto-onkogen (juni); NM 021724, kjernekraft reseptorunderfamilien 1, gruppe D, medlem 1 (NR1D1); NM 001621, aryl hydrokarbon reseptor (AHR); NM 001165, baculoviral IAP gjenta inneholder 3 (BIRC3); NM 005354, juni D proto-onkogen (JUND); NM 000399, tidlig vekstrespons 2 (EGR2); NM 004235, Kruppel-lignende faktor 4 (KLF4); NM 002 046, glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH). GAPDH ble brukt som kontroll for normalisering [49].
Statistical Analysis
Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Statistisk signifikans mellom to datasett ble fastsatt ved hjelp Welch t-test ved bruk av R-programvare (R Foundation for statistiske Computing, versjon 2.15.1, gratis programvare tilgjengelig på https://www.R-project.org) med p-verdier 0,01; N.S., ikke-signifikant)
doi: 10.1371 /journal.pone.0058325.s004
(EPS)
Figur S5..
Western blot-analyse av caspase-3 i siNR1D1 og siBIRC3 transfekterte celler etter varmestress. Western blot analyse viste at spaltes caspase-3 bånd 24 timer etter behandling økt i siNR1D1- og siBIRC3-transfekterte celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0058325.s005 plakater (TIF)
Figur S6 .
Chromatin kondens analyse i siNR1D1 og siBIRC3 transfektert celler etter varmestress. Ved eksponering for varmestress, celler med opphevet NR1D1 vist signifikant økning av kromatin kondensering sammenlignet med celler transfektert med siLuc, mens oppheving av BIRC3 en tendens til å øke graden av kromatin kondensasjon uten å vise statistisk signifikans. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (*, P 0,05, NS, ikke-signifikant)
doi: 10,1371 /journal.pone.0058325.s006 plakater (EPS)
Takk
forfatterne ønsker å takke Prof. Akihisa Takahashi, Gunma Universitetet for gaven av malignt gliom cellelinje M059K og M059J.
