Abstract
Aberrant aktivering av PI3K /AKT signale representerer en av de mest vanlige molekylære forandringer i lungecancer, selv om det relative bidrag av de enkelte komponenter i kaskaden til NSCLC utvikling er fremdeles dårlig definert. I dette manuskriptet har vi undersøkt forholdet mellom ekspresjon og genetiske endringer av komponentene i PI3K /AKT sti [KRAS, den katalytiske subenhet av PI3K (p110α), PTEN, akt1 og akt2] og aktivering av AKT i 107 kirurgisk resekterte NSCLCs og har analysert de eksisterende relasjoner med klinisk-patologiske funksjoner. Expression analyse ble utført ved immunhistokjemi på Tissue Micro Arrays (TMA); mutasjonsanalyse ble utført ved hjelp av DNA-sekvensering; kopitallet variant ble bestemt ved FISK. Vi rapporterer at aktivering av PI3K /AKT sti i italienske NSCLC pasienter er forbundet med høy grad (G3-G4 sammenlignet med G1-G2, n = 83, p 0,05) og mer avansert sykdom (TNM stadium III vs. etapper I og II ; n = 26, p 0,05). I tillegg fant vi at PTEN tap (41/104, 39%) og overekspresjon av p110α (27/92, 29%) representerer den hyppigste avvik observert i NSCLCs. Mindre hyppige molekyl lesjoner består overekspresjon av akt2 (18/83, 22%) eller akt1 (17/96, 18%), og KRAS mutasjon (7/63, 11%). Våre resultater tyder på at det blant alle genene, ble bare p110α overekspresjon signifikant assosiert til AKT aktivering i NSCLCs (p = 0,02). Manipulering av p110α uttrykk i lungekreftceller som bærer en aktiv PI3K allel (NCI-H460) effektivt redusert spredning av NSCLC celler
in vitro Hotell og tumorvekst
in vivo
. Til slutt, RNA profilering av lunge epitelceller (BEAS-2B) som uttrykker en mutant allel av PIK3 (E545K) identifisert et nettverk av transkripsjonsfaktorer slik som MYC, FOS og HMGA1, ikke tidligere er kjent for å være assosiert med avvikende PI3K signalisering i lungekreft.
Citation: Scrima M, De Marco C, Fabiani F, Franco R, Pirozzi G, Rocco G, et al. (2012) Signa Networks Associated med AKT Aktivisering i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC): ny innsikt i rollen Phosphatydil-inositol-3 kinase. PLoS ONE 7 (2): e30427. doi: 10,1371 /journal.pone.0030427
Redaktør: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle RICERCHE (CNR), Italia
mottatt: 25 juli 2011; Godkjent: 16 desember 2011; Publisert: 17 februar 2012
Copyright: © 2012 Scrima et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC) til GV og AW og den europeiske union (IP: CRESCENDO, kontrakt n.er LSHM-CT-2005-018652), Minis dell’Università e della Ricerca (PRIN, Grant n.er 2008CJ4SYW_004) til AW Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1], [2]. Epitelial lungekreft er klassifisert i to hovedgrupper: små-celle lungecancer (SCLC) (ca. 15% av alle lungekreft) og ikke-små-celle lungekreft (NSCLC) (ca. 85% av alle lungekreft) [3] . NSCLC består plateepitelkreft (SCC), adenokarsinom (ADC), og stor celle lungekreft (LCC) [3]. Til tross for fremskritt i tidlig oppdagelse og standard behandling, er NSCLC ofte diagnostisert på et avansert stadium og pasienter ofte har dårlig prognose, med fem års overlevelse mindre enn 15% [4], [5]. Av denne grunn er en bedre forståelse av den molekylære opprinnelsen av sykdommen vil bidra til å bedre terapeutisk behandling av lungekreftpasienter.
Nyere studier har vist at den fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) signalkaskade er hyppig overactivated i human kreft [6] – [8] spiller en kritisk rolle både i initiering og progresjon av NSCLC [9], [10]. Den PI3K pathway regulerer cellulære funksjoner som proliferasjon, overlevelse, motilitet og angiogenese, som er kritisk for vekst og /eller vedlikehold av tumorer [11], [12]. Endepunktet av PI3K veien er AKT, en serin /treonin protein kinase som formidler de fleste signaler funneled gjennom PI3K veien. AKT aktiveres ved rekrutteringen til cellemembranen via binding av sin PH domene til 3′-fosforylerte fosfatidylinositoler generert av PI3K og påfølgende fosforylering på T308 og S473 [12], [13]. Omvendt, lipid fosfataseaktivitet PTEN demper AKT aktivering ved dephosphorylating 3′-stillingen av fosfatidylinositoler [14].
Aberrant AKT aktivering bidrar til lunge karsinogenese [9], [10]. Hyperaktive av AKT er oppdaget i de fleste NSCLC cellelinjer [15] – [17], og i 30-75% NSCLCs [18] – [22] og fremmer motstand mot kjemoterapi og strålebehandling [16]. AKT-aktivering i kreft er for tiden evaluert ved anvendelse av fosfo-spesifikke antistoffer mot S473 i immunohistokjemiske analyser av vevsprøver. Selv fosforylering av AKT på S473 er korrelert med dårlige kliniske resultater i mange krefttyper, resulterer i lungekreft er tilsynelatende uforenlige [7] – [10] har blitt assosiert med enten dårlig eller god prognose [20] – [22]. AKT kan aktiveres via flere mekanismer, som følge av tydelig og ofte gjensidig utelukkende hendelser som inkluderer aktiverende mutasjoner (KRAS, PIK3CA eller akt1), økt uttrykk (PIK3CA, akt1, akt2) eller tap av PTEN [10]. Imidlertid er det relative bidrag av de enkelte komponenter i PI3K veien til AKT aktivering i NSCLCs fremdeles uklar. I dette manuskriptet har vi undersøkt sammenhengen mellom genetiske endringer som finnes i disse genene og aktivering av AKT i NSCLC.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Pasient periodisering var gjennomført i henhold til interne Review Board av INT Fondazione Pascale (Napoli, Italia) (CEI 556/10 av 12/3/2010). Studien ble godkjent av den interne Review Board av AOU Mater Domini /Universitetet Magna Graecia (Catanzaro, Italia) i møtet mellom 16/3/2011. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakere til studien. Alle dyr arbeidet ble gjennomført i henhold til de relevante italienske retningslinjer og ble godkjent av Internal Utvalget for dyrestudie (CESA) ved Institutt for genetisk forskning «Gaetano Salvatore 7. april
th 2008 (CESA 10-08).
pasienter
Arkivmateriale fra 107 pasienter diagnostisert med NSCLC [3] ble hentet fra INT Fondazione Pascale (Napoli, Italia). Median alder var 64 år gammel (range 28-82). Blant pasienter med kliniske data, kvinner var 18 og menn 83. trinn ble kjent for 81 pasienter: 67 pasienter hadde stadium I-II sykdom og 14 hadde stadium III-IV sykdom. Karakteren ble kjent for 83 pasienter: 35 tilfeller var G1-G2 og 48 var G3-G4. Se tabell S1, Tabell S2 og Tabell S3 for mer detaljerte kliniske kjennetegn ved alle pasienter.
TMA skred ble deparaffinized, oppvarmet i en trykkoker med 1 mM EDTA, pH 8,0 i 10 min, og inkubert med pepsin på 37 ° C i 30 minutter. Preparatglassene ble deretter dehydrert i økende etanolkonsentrasjoner, og deretter lufttørket. Probene ble denaturert ved 96 ° C i 5 minutter, og hybridisering ble påført på hvert objektglass og inkubert ved 75 ° C i 1 min. Etter inkubering over natten ved 37 ° C i et fuktig kammer, ble objektglass vasket med 0,4 x SSC og 0,3% NP40 i 2 minutter ved 75 ° C, luft-tørket i mørke, motfarget med DAPI, og et dekkglass ble anvendt.
Tissue microarray (TMA) og Immunohistochemistry
TMA ble bygget i samarbeid med Enhet for Farging på Centro Nacional de Investigaciones Oncologicas (Madrid, Spania) i henhold til etablerte metoder [23] med en Tissue Arrayer ( Beecher Instruments, Gene Micro-Array Technologies, Silver Spring, MD). Immunfarging ble utført ved anvendelse av avidin-biotin-peroksidase-metoden (LSAB kit; DAKO, Glostrup, Danmark) som tidligere beskrevet [24]. Antistoffer anvendt for immunfarging ble valgt i henhold til tidligere publiserte arbeidet [25] – [29]. Anti-pS473 (# 9277), anti-akt1 (# 2938), anti-akt2 (# 4057), anti-PIK3CA (# 4249), anti- PTEN (# 9559) var alle fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA).
Den anti-akt1 og anti-akt2 har vist seg å være isoform-spesifikke antistoffer i tidligere arbeid [25]. I tillegg, ved hjelp av NCI-H460-celler interfererte for akt1 eller akt2, henholdsvis vi bekreftet at anti-akt1 antistoffet gjenkjenner bare den akt1 isoformen og den anti-akt2 antistoffet gjenkjenner bare den akt2 isoformen (figur S1A).
immunohistokjemisk Resultatet pakt og PTEN brukt i dette arbeidet ble valgt på basis av de allment etablerte kriterier som forekommer i litteraturen [28], [30], [31]: pakt ble merket som positivt da 10% av tumorcellene var positive med sterk eller diffus immunopositivity. PTEN ekspresjon ble klassifisert som (+) når farging ble påvist i 50% av cellene, (+/-) ved farging ble påvist i 25-50% av cellene, og (-) ved farging ble påvist i 0-25% av celler. For statistisk analyse PTEN uttrykk ble ansett som tapt da prøvene ble klassifisert som (-).
Også for farging score til akt1, akt2 og PIK3CA, vi valgte kriterier som er beskrevet i tidligere rapporter [27], [28], [32]. Vevsprøver ble delt inn i fire grupper etter hvor stor prosentandel av positive celler: (-) består helt negative prøver; (+) Utgjøres prøver med opp til 10% av positive celler; (++) Som omfattes prøver med 11-50% av positive celler; og (+++) omfattet prøvene med 50% av positive celler, respektivt. Av statistiske grunner, ble tumorene klassifisert i en lav uttrykk gruppe bestående av (-) og (+) og en høy ekspresjon gruppe som omfatter: (++) og (+++)
for hver en immunhistokjemisk rundt en. negativ kontroll har blitt inkludert, ved å erstatte det primære antistoff med oppløsningsmidlet ved samme volum av det med det primære antistoff ble resuspendert i den. Alle kontroller ga tilfredsstillende resultater. Stained TMA seksjoner ble evaluert av to dyktige patologer (RF, GB) med ensartede kriterier. Avvik ble løst gjennom samtidig inspeksjon og diskusjon av resultatene. Avvik mellom to kjerner fra samme saken ble løst gjennom en felles analyse av de to kjernene.
Fluorescens In Situ Hybridisering (FISH)
FISH analyse ble utført på TMA. BAC kloner ble utformet i henhold til Ensembl database (www.ensembl.org). BAC kloner dekker akt1 genet var RP11-982M15, RP11-477I4 og RP11-556J09. Kontroll BAC sonder som dekker kromosom region 14q11 var RP11-324B11. BAC kloner dekker akt2 genet var RP11-36B02, RP11-688J23, RP11-725P04. Kontroll BAC sonder som dekker kromosom region 19p13.1 var RP11-737I1, RP11-520G3. BAC kloner dekker PIK3CA genet var RP11-360P21 og RP11-245C23. Kontroll BAC sonder som dekker kromosom region 3p14.1 var RP11-175F9 og RP11-15B21. Alle BAC kloner ble merket med dUTP-spek-trum Orange (Vysis Inc., DownersGrove, IL, USA). Alle Kontroll prober ble merket med dUTP-spek-trum Grønn (Vysis Inc., DownersGrove, IL, USA).
To forskjellige etterforskere som ikke hadde noen tidligere kjennskap til de genetiske, kliniske og IHC resultater evalueres FISH analyse. All fisk ble bedømt i et gjennomsnitt på 130 (60-210) kjerner.
For evaluering av kopiantallet av gener som koder akt1, akt2 og PIK3CA, et gen-til-kontroll-forhold på 1,0 ble klassifisert som disomy ; forhold mellom 1,0 og 2,0 ble betraktet gen lavnivå gevinst; forholdstall 2,0 ble vurdert som høy polysomy og /eller genamplifisering [33], [34]
Derfor svulster ble delt inn i forskjellige klasser: disomy, trisomi (3 kopier av kromosomer i 40%. av celler), lav polysomy (≥3 kopier av kromosomer i 40% av cellene), høy polysomy (≥4 kopier av kromosomer i ≥40% av celler), og genamplifikasjon (tilstedeværelse av gensamlingene med et forhold av gen -to-kromosomet til ≥2 per celle i ≥40% av celler eller tilstedeværelsen av små eller nonenumerable klynger av genet signal). Dette tillot klassifisering av pasientene i to grupper: FISH-negative (disomy og gevinster) og FISH-positive (høy polysomy og /eller genamplifisering)
PCR, RT-PCR og
mutasjonsanalyse
Total RNA og genomisk DNA ble fremstilt som beskrevet [35], [36]. Q-RT-PCR og Q-PCR ble utført ved hjelp av strøm SYBR Grønn PCR Master Mix i en ABI Prism 7300 termo (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). cDNA ble syntetisert fra 1 mikrogram total RNA ved hjelp QuantiTect Reverse Trascription (Qiagen, Nederland, Venlo). Normalisering ble utført for å GAPDH mRNA-innhold. De relative mengder av mRNA eller DNA som ble beregnet ved den komparative syklusen terskel (CT) metode ved Livak og Schmittgen [37]. Mutasjon analyse for PIK3CA hjelp LightCycler ble utført med DNA Master /hybridisasjonsprober kit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland). Direkte sekvensering ble utført ved anvendelse av BigDye v3.03 syklussekvenseringssett (Applied Biosystems) i en kapillær automatisk sekvensdanner (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer; Applied Biosystems). Protokoller og primere for Q-PCR, Q-RT-PCR og sekvensering KRAS (eksoner 2 og 3) og PIK3CA (eksoner 9 og 20) er rapportert i vedlegg S1.
Antistoffer og Western Blot
Western blot-analyse ble utført ved standardmetoder [38]. Hele celleekstrakter ble fremstilt ved homogenisering av cellene i NP-40 lyseringsbuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP-40) inneholdende proteaseinhibitorer. Lysater ble fjernet ved sentrifugering, og proteinene ble separert ved SDS-PAGE. Antistoffer som ble brukt var fra Cell Signaling Technology: anti-akt1 (# 2938); anti-S473 (# 9277), anti-PIK3CA (# 4249).
Cellelinjer
NCI-H460 ble kjøpt fra ATCC-LGC Promochem (South West London, UK) og vedlikeholdes i RPMI1640 (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), supplert med 10% føtalt bovint serum og 100 U /ml penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). BEAS-2B celler ble kjøpt fra Cambrex (Milan, Italia) og vokst som foreslått av produsenten [39].
Virus generasjon og infeksjons
For å generere p110α koding lentivirus, cDNA som koder for human p110α (Addgene, Cambridge, MA, USA) ble klonet i pENTR1A vektor (Invitrogen) og saman i pLenti6.2 /C-Lumio ™ /V5-MÅL Vector ved å gjøre bruk av Gateway Technology (Invitrogen). pLenti vektor ble anvendt for å danne partikler i lentivirale HEK293T emballasje-celler som beskrevet [40]. Transduced BEAS-2B celler gjennomgikk tre runder med infeksjon og ble valgt i medium som inneholdt 5 mikrogram /ml blasticidin (Invitrogen). The Human PIK3CA (NM_006218), akt1 (NM_005163) og akt2 (NM_001626) MISSION shRNA sett (Sigma-Aldrich, St.Luis, MO) og Mission non-target kontroll transduksjon virus (SHC002V) ble brukt til å generere lentiviral partikler i HEK293T emballasje celler [40]. Etter transfeksjon ble supernatanter oppsamlet ved 8 timers mellomrom, ble filtrert og benyttet for tre runder med transduksjon av NCI-H460-celler i nærvær av 8 ug /ml polybrene (Sigma).
in vitro Proliferation Assay
Celler proliferasjon ble analysert ved MTT [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid; Sigma] reduksjon. Celler ble sådd ut i 96-brønners flatbunnede mikrotiterplater (200 ul cellesuspensjoner, 2 x 10
3 /brønn for NCI-H460) og inkubert med MTT substrat (5 mg /ml) i 4 timer. Hver 24. time, kulturmediet ble fjernet og vannfri 2-propanol ble tilsatt. Den optiske tetthet ble målt ved 570 nm.
tumorigene assays
celler (1 x 10
6) ble suspendert i 100 ml 10% FBS og 100 ml Matrigel (BD Biosciences, NJ , USA) og injisert subkutant inn i høyre flanke av 6-ukers-gamle atymiske nakne mus (Charles River, Vest-Tyskland) i tre paralleller. Hver 7 dager tumorstørrelse ble målt med en caliper.
RNA profilering analyse
RNA konsentrasjonen ble bestemt med en Nanodrop (Nanodrop, Wilmington, Delaware, USA) spektrofotometer og dens kvalitet ble vurdert med en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Milano, Italia). For hver prøve ble 500 ng av total RNA syntetisert til biotinylert cRNA ved hjelp av Illumina RNA Amplification Kit (Ambion, Inc., Austin, TX). Syntese ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. cRNA konsentrasjon og kvaliteten ble vurdert som beskrevet ovenfor. Fra hver prøve ble det tekniske replikater produsert og 750 ng cRNA ble hybridisert i 18 timer for mennesker HT-12_V3_0_R1 Expression BeadChips (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) i henhold til protokollen gitt av produsenten. Hybridiserte chips ble vasket og farget med streptavidin-konjugert Cy3 (GE Healthcare Milano, Italia). BeadChips ble tørket og skannet med en Illumina BeadArray Reader (Illumina Inc.)
Mikromatriser dataanalyse. RNA profilering, gener «karakterisering, beriket trasé og bibliografiske nettverk oppdagelse
Expression filene ble normalisert og analysert ved hjelp GeneSpring 10,1 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Differensielt uttrykte (degs) gener mellom BEAS-2B og BEAS-PI3K-CA-celler ble selektert på basis av folden endring (forholdet mellom uttrykket nivåer i de to tilstander) og den statistiske signifikans. Vi filtrert listene ved hjelp fold endre 1,5 og T-test (
p
-verdi (0,01) som terskel. Den degs listen (komponert av 2126 probesets) ble brukt til å vurdere funksjonell atferd i form av biologiske prosesser og . Molecular Funksjon, utvikling funksjon og sykdom og lidelse vilkår graden av anrikning ble statistisk evaluert for å avgjøre om en observert nivå for annotering for en gruppe av gener er viktig særlig for hvert semester, en
q
. – verdi ble beregnet av Hypergeometrisk test (
p
≤0.05) og korrigeres med False Discovery Rate (FDR) [41]. vilkårene med
q
-verdi stiger betydningen terskelen var da valgt som representant. ble utført Pathway og nettverksanalyse ved hjelp av oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA, Oppfinnsomhet Systems).
Datasettet settet~~POS=HEADCOMP ble utvunnet for betydelige trasé med IPA bibliotek av kanoniske trasé og nettverk ble generert ved hjelp av IPA som grafisk fremstilling av de molekylære forhold mellom gener og genprodukter. Betydningen av sammenhengen mellom listen over degs og Canonical Pathway ble målt ved hjelp av en Fishers eksakte test for å beregne en
p
-verdi (
p
≤0.05). Fishers eksakte test resultater ble også korrigert for multippel testing ved bruk av FDR.
I nettverk, gener eller genprodukter er representert som noder, og den biologiske forholdet mellom to noder blir representert som en kant (line). Alle kanter er understøttet av minst en referanse fra litteraturen, fra en lærebok, eller fra kanonisk informasjon som er lagret i IPA kunnskapsbase. Menneske, mus, rotte og ortologer fra et gen som er lagret som separate objekter, men er representert som en enkelt node i nettverket. Den nettverksbygging algoritme bestemmer en statistisk poengsum for hvert nettverk. Dette gjøres ved å sammenligne antallet av fokus gener som bidrar til et gitt nettverk forhold til det totale antall forekomster av disse gener i alle nettverk eller veier som er lagret i IPA kunnskapsbase. Intensiteten av gener (node) farge i nettverkene angir graden av nedregulering (grønn) eller oppregulering (rød) av genekspresjon. Noder vises ved hjelp av ulike former som representerer funksjonsklasse av genprodukter.
Resultater
AKT-aktivering i NSCLCs
Som en avlesing av PI3K /AKT signalisering i NSCLC vi bestemt fosforylering status for rester S473 av akt1 (Pakt). Pakt ble evaluert på TMA inneholder duplisert kjerne biopsi av 107 NSCLCs. Som kontroller 45 matchede normale prøver ble anvendt. Pasientenes klinisk-patologiske egenskaper er beskrevet i Materialer og Metoder og oppsummert i tabell S1, S2 og S3. Resultatene oppnådd fra pakt farging i NSCLC Resultatene er oppsummert i tabell 1. pakt fargingen var knapt synlig i epitelceller fra normal epitel og alveolare fra øvre luftveier (39 av 45 prøver) (Se figur S1). I motsetning til dette ble AKT aktivering observert i 60 ut av 97 av NSCLC analysert (tabell 1). Positiv Pakt farging var vesentlig høyere i carcinoma prøvene enn både vanlig alveolar eller bronkialepitelet (P 0,001; Chi kvadrat test). Pakt farging ble observert i 23/37 SCCS og 30/44 adjutanter (figur 1A og B, henholdsvis). Vi fant en signifikant sammenheng mellom Pakt flekker og karakteren eller stadium av sykdommen (tabell 2): Pakt farging ble betydelig mer representert hos pasienter med karakterer G3-G4 sammenlignet med pasienter med karakterer G1-G2 (p 0,05) og i pasienter med TNM stadium III sammenlignet med pasienter med stadium II sykdom (p 0,05). Se tabell S4 og S5 for fordeling av pasienter til SCCS og ADCs. Disse resultater viser at, i overensstemmelse med arbeid på andre populasjoner i italiensk NSCLC pasienter som AKT-aktivering forekommer i tumorvev og korrelerer med et mer avansert stadium av sykdommen [20] – [22]. Se også tabell S9 og S10 for en detaljert, pasient-by-pasient, liste over Pakt positivitet
A, venstre. SCC negativ for Pakt fosforylering; høyre: SCC positivt for pS473 fosforylering. B, venstre: ADC negativ for Pakt fosforylering; høyre: ADC positivt for pS473 fosforylering. Forstørrelse 10 x og 40 x henholdsvis
Mekanismer av AKT aktivering i NSCLCs. Immunhistokjemi
For å undersøke de molekylære mekanismene som fører til AKT-aktivering i italienske pasienter påvirkes av NSCLC vi gjennomført en omfattende analyse av uttrykket og /eller genetiske statusen akt1 og akt2 og sine nærmeste regulatorer (KRAS, PIK3CA og PTEN). Av de 107 tilfellene stede på TMA 96 kan være riktig analysert for akt1, 83 for akt2, 104 for PTEN og 92 for PIK3CA.
Se Materialer og metoder for evalueringskriteriene som brukes for akt1. Kort fortalt, prøver definert (-) var helt negativ for akt1; Prøvene som er definert (+) inneholdt opp til 10% av positive celler; Prøvene definert (++) består 11-50% av positive celler; Prøvene som er definert (+++) utgjøres 50% av positive celler, respektivt. Figuren viser representative S2 stainings av (+), (++) eller (+++) ekspresjon akt1 i SCCS og ADCs. Svulster ble inndelt i en lav uttrykk gruppe bestående av (-) og (+) og en høy ekspresjon gruppe som omfatter: (++) og (+++). Analyse av TMA 258,1 og 258,2 viste at akt1 var over-uttrykt i 17/96 NSCLC tilfeller (~19%) (figur 2), med SCCS og adjutanter viser lignende resultater: 7/37 akt1 positive tumorer var SCCS (19%) og 7/44 akt1 positive tumorer var adjutanter (16%). Se figur 2A og B, respektivt. . Ni av 15 (60%) NSCLCs overekspresjon akt1 viste AKT aktivering (tabell 3)
A, venstre: SCC negativ for akt1 uttrykk; høyre: SCC positivt for akt1 uttrykk. B, venstre: ADC negativ for akt1 uttrykk; høyre: ADC positivt for akt1 uttrykk. Forstørrelse 10 × og 40 ×, henholdsvis. C. To-farge fluorescens in situ hybridisering analyse av akt1 genkopitallet. FISH analyse av akt1 (røde signaler) og cent av kromosom 14 (grønne signaler). Venstre, NSCLC prøven med diploide celler; høyre, NSCLC prøven med flere grupperte flekker av røde signaler om akt1 med 2 cent signaler (genet forsterkning). Original forstørrelse 100 ×.
Vi deretter analysert uttrykk for akt2 i NSCLCs. Se Materialer og metoder for evaluering av akt2 farging. Prøver definert (-) var helt negativ for akt2; Prøvene definert (+) var med opp til 10% av positive celler; Prøvene definert (++) består 11-50% av positive celler; og eksempler definert (+++) utgjøres 50% av positive celler, respektivt. Figur S3 viser representative stainings av (+), (++) eller (+++) uttrykk akt2 i SCCS og ADCs. Svulster ble inndelt i en lav uttrykk gruppe bestående av (-) og (+) og en høy ekspresjon gruppe som omfatter: (++) og (+++). Akt2 ble overexpressed i 18/83 NSCLCs (~22%) (figur 3). På forskjell akt1, ble akt2 overekspresjon observert oftere hos SCCS (10/31 SCCS, 32%, 4/33 ADCs, 12%). Se figur 3A og B, respektivt. I tillegg er de fleste akt2 positive tumorer (12/17, 71%) viste AKT aktivering (tabell 3)
A, venstre. SCC negativ for akt2 uttrykk; høyre: SCC positivt for akt2 uttrykk. B, venstre: ADC negativ for akt2 uttrykk; høyre: ADC positivt for akt2 uttrykk. Forstørrelse 10 × og 40 ×, henholdsvis. C. To-farge fluorescens in situ hybridisering analyse av akt2 genkopitallet. FISH analyse av akt2 (røde signaler) og kromosom region 19p13.1 (grønne signaler). Venstre, NSCLC prøven med diploide celler; høyre, NSCLC prøven med flere grupperte flekker av røde signaler om akt2 med to kromosom region 19p13.1 signaler (genet forsterkning). Original forstørrelse 100 ×
Pasienter påløpt for dette studiet hadde vært preget av PTEN uttrykk [38]. Fullstendig tap skjedde i 41 av 104 (39%) NSCLCs og delvis nedregulering ble observert i 41 ekstra tilfeller. PTEN tap ble sett oftere i SCCS (22/40, 55%) enn i ADCs (14/51, 27%) (Se figur S5). Når imidlertid korrelert med AKT aktivering, tap eller reduksjon av nivåene av PTEN-protein var ikke assosiert med AKT aktivering (n = 95, p = 0,832). (Tabell 3)
Til slutt, analyserte vi uttrykk av den katalytiske subenhet av PI3K, p110α. Evalueringskriterier er rapportert i materialer og metoder. Prøver definert (-) var helt negativ for p110α; Prøvene definert (+) inneholdt opp til 10% av p110α-positive celler; Prøvene definert (++) består 11-50% av p110α positive celler; og prøver definerte (+++) består 50% av p110α positive celler. Figur S4 viser representative stainings av (+), (++) eller (+++) uttrykk akt1 i SCCS og ADCs. Svulster ble inndelt i en lav uttrykk gruppe bestående av (-) og (+) og en høy ekspresjon gruppe som omfatter: (++) og (+++). Vi observerte p110α overekspresjon i ~29% av NSCLCs (27/92): 12 av 34 ble SCCS (35%) og 12 ut av 43 var ADC (28%) (figur 4A og 4B). At forskjellen med andre gener i veien som har blitt analysert, fant vi at NSCLCs med uttrykt p110α presenteres betydelig aktivert AKT (18 av 26; p = 0,02) (Tabell 3)
A, venstre. SCC negative for PIK3CA uttrykk; høyre: SCC positivt for PIK3CA uttrykk. B, venstre: ADC negativ for PIK3CA uttrykk; høyre: ADC positivt for PI3KCA uttrykk. Forstørrelse 10 × og 40 ×, henholdsvis. C. To-farge fluorescens in situ hybridisering analyse av PIK3CA genkopitallet. FISH analyse av PIK3CA (røde signaler) og kromosom region 3p14.1 (grønne signaler). Venstre, NSCLC prøven med diploide celler; høyre, NSCLC prøven med flere grupperte flekker av røde signaler om PIK3CA med to kromosomregioner 3p14.1 signaler (genet forsterkning). Original forstørrelse 100 ×.
Spesielt fra den integrerte analysen av TMA vi fant ut at AKT aktivering ble hyppigere observert i tumorer som viser avvikende uttrykk for mer enn et enkelt gen innenfor PI3K veien (PTEN tap eller overekspresjon av akt1, akt2, p110α henholdsvis). Faktisk ble AKT aktivering påvist i 15-64% av tumorer som viser avvik i et enkelt gen, 44-89% av tumorer med avvikende ekspresjon av to gener, 67-100% av tumorer med avvikende ekspresjon av tre gener og 100% av tumorer med avvikende ekspresjon av alle fire gener. Motsatt, avvikende uttrykk for medlemmene av PI3K veien var mindre vanlig i svulster viser ingen aktivering av AKT signale (se tabell 4)
Mekanismer av protein overekspresjon:. FISH analyse
FISH analyse i NSCLCs ble utført for akt1, akt2 og PIK3CA for å bestemme de molekylære mekanismer av overekspresjon av de tilsvarende proteiner. Se Materialer og metoder for klassifisering av svulster ved FISH. Vi har funnet 20/82 NSCLC (24%) med kopiantall forsterkningen i akt1-genet på kromosom 14, hvorav 16 var høy polysomy ( 4 kopier) og 4 fokal forsterkning (SCC-11, SCC-12, SCC-14 og SCC-21) (figur 2C). Expectedly flere akt1 FISH-positiv NSCLCs (12 av 20 tilfeller, 60%) viste moderat eller høy akt1 uttrykk. Se tabell S9 og S10 for en detaljert liste over genetiske forandringer påvist i enkelt SCC og ADC pasienter. I tilfelle av akt2, observerte vi 24/73 NSCLCs (31%) med kopiantall forsterkning av genet på kromosom 19, hvorav 23 pasienter hadde høy polysomy og en pasient hadde fokal forsterkning (SCC-11). Se figur 3C for et representativt eksempel. Det gjenstår imidlertid betydningen av akt2 forsterkning i lungekreft uklart, siden 13/24 (54%) tilfeller av akt2 FISH-positive svulster viste ikke økt uttrykk av det tilsvarende protein.
FISH analyse med kromosom 3q26. 32 prober avslørte tilstedeværelsen av en økning i PIK3CA genkopitallet i 19 tilfeller (~26%), som alle er presentert høy polysomy, med 7 tilfeller viser også fokal forsterkning (ADC-5, SCC-4, SCC-14, SCC-16, SCC-19, SCC-30, SCC-34) (figur 4C). Flertallet av NSCLCs med økt kopi antall PIK3CA (13 av 19 tilfeller, 68%) viste moderat eller høy uttrykk for p110α.
Men ikke all fisk-positive NSCLCs resulterte i aktivering av AKT signalering. Som vist i tabell S6, S7 og S8, 11/18, 10/19 og 14/23 saker som ble FISH-positiv for PIK3CA, akt1 og akt2 resultert positivt for Pakt, henholdsvis.
Mekanismer av AKT aktivering : mutasjon analyse av PIK3CA og KRAS
Pasienter påløpt for denne studien hadde allerede blitt analysert for akt1 mutasjoner [24]. Pasient SCC-29 presentert en somatisk mutasjon i genet som koder for akt1 resulterer i en glutaminsyre til lysin substitusjon ved aminosyre 17 (E17K) [24]. Svulsten fra denne pasienten viste økt AKT uttrykk og aktivitet. Tilsvarende missense mutasjoner i PIK3CA har sjelden blitt rapportert [42] – [45]. Vi har funnet en substitusjons GAG1633 → AAG som fører til aminosyreforandring E545K i en SCC (SCC-6) (figur 5A og B). Omvendt, 7 NSCLCs viste mutasjoner i KRAS: G12A (GGT → GCT) (n = 1); G12C (GGT → TGT) (n = 4); G12V (GGT → GTT) (n = 1); G13C (GGC → TGC) (n = 1) (figur 5C). KRAS mutasjoner ble detektert hovedsakelig i omvandlere (6 av 32; 19%) som beskrevet [46], [47]. Fem av syv tilfeller med mutasjoner i KRAS viste signifikant AKT aktivering (figur 5D).
A. Mutasjonsdeteksjon i eksoner 9 og 20 av PIK3CA fra NSCLC.
