Abstract
Tumor-forbundet makrofager har vist seg å fremme tumorvekst. De kan ha en obligatorisk funksjon i angiogenese, invasjon og metastasering gjennom frigjøring av inflammatoriske mediatorer. Deres tilstedeværelse i eggstokkreft har vært korrelert med dårlig prognose hos disse pasientene. Det humane kationiske antimikrobielle protein-18 (hCAP18) /LL-37 ble opprinnelig identifisert som en effektor-molekyl av den medfødte immunsystemet. Den er utgitt av medfødte immunceller som makrofager, for å bekjempe mikroorganismer. Tidligere studier har karakterisert hCAP18 /LL-37 som en vekstfaktor som har vist seg å fremme ovarial tumor progresjon. Imidlertid er rollen hCAP18 /LL-37 har i makrofag-promo ovarial tumor utvikling og hvordan dens ekspresjon blir styrt i denne sammenheng forblir dårlig forstått. Her viser vi i co-kultur eksperimenter av makrofager og eggstokkreft celler en betydelig økning i
in vitro
spredning og invasivitet av tumorceller er observert. Disse forbedrede vekst og invasjonsegenskapene korrelert med hCAP18 /LL-37 induksjon. HCAP18 /LL-37-ekspresjon ble redusert ved tilsetning av to nøytraliserende antistoffer, TLR2 eller TLR6, samt Cyp27B1 eller VDR-inhibitorer. Videre enten TLR2 eller TLR6 antistoff redusert vitamin D3 signalering og tumorcelle progresjon
in vitro
. Tilsetting av Cyp27B1 eller VDR-hemmere avskaffet TLR2 /6 aktivisering-indusert uttrykk for hCAP18 /LL-37 i makrofager. Knockdown av tumor-produsert versican V1 av RNAi i disse tumorceller ført til en redusert induksjon av hCAP18 /LL-37 i makrofager. Versican V1 knockdown også hemmet TLR2 og vitamin D3 signalering, så vel som vekst og invasivitet av disse tumorceller i
in vitro
ko-kulturen. I sammendraget, har vi funnet ut at versican V1 forbedrer hCAP18 /LL-37 uttrykk i makrofager gjennom aktivering av TLR2 og påfølgende vitamin D-avhengige mekanismer som fremmer ovarial tumor progresjon
in vitro
.
Citation : Li D, Wang X, Wu JL, Quan WQ, Ma L, Yang F et al. (2013) Tumor-Produsert Versican V1 Forbedrer hCAP18 /LL-37 Expression i Makrofager gjennom aktivering av TLR2 og vitamin D3 Signa å fremme Ovarian Cancer Progresjon
In Vitro
. PLoS ONE 8 (2): e56616. doi: 10,1371 /journal.pone.0056616
Redaktør: Qiang Wang, Cedars-Sinai Medical Center, USA
mottatt: 03.07.2012; Godkjent: 15 januar 2013; Publisert: 12 februar 2013
Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China Grants (81272603); Research Program for komiteen for vitenskap og teknologi i Putuo (PTKW09-B02). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
en svulst mikromiljøet spiller en avgjørende rolle i startfasen og markedsføring. Denne unike mikromiljøet inneholder medfødte immunceller, lymfocytter og bindevev samt ondartede celler [1]. Medfødte immunceller (også kjent som myeloide celler), omfatter makrofager, utslipp cytokiner og chemokiner samt innflytelse tumorigenesis [1] – [3]. Tumor-assosiert makrofager (TAM) er en viktig del av inflammatoriske infiltrater i svulster. TAMs er avledet fra sirkulerende monocyttiske forløpere ved kjemoattraktanter, som utskilles av begge tumor og stromale celler [4], [5]. Kliniske studier fortsetter å demonstrere en sammenheng mellom et høyt populasjoner av TAMs en dårlig prognose i eggstokkene, bryst, prostata, lunge, og livmorhalskreft [6] – [8]. Det er en økende mengde bevis for at flere proinflammatoriske faktorer produsert av makrofager, fremme tumorvekst, angiogenese, invasjon, og metastaser [1], [5], [9]. Men den faktiske rollen en rekke sentrale pro-inflammatoriske molekyler har i tumorvekst og deres mekanismer uttrykk og funksjonen er fortsatt dårlig forstått.
Den menneskelige kationiske antimikrobielle protein-18 (hCAP18) /LL-37 er den eneste kjente cathelicidin peptid hos mennesker [10]. HCAP18 /LL-37 blir konstitutivt produsert i en rekke celletyper, inkludert makrofager, neutrofiler, hud epiteliske celler i huden, fordøyelseskanalen og urinveier, av epididymis og ved respiratoriske epitelceller [11], [12]. Den HCAP18-genet består av 3-domener: den N-terminale signalpeptid region, den konserverte Cathelin-lignende domene og den C-terminale region betegnet LL-37 peptidet [13]. LL-37 peptidet blir opprettholdt i sin pro-peptidet form inntil spalting av protease tre like før sekresjon [14], [15]. LL-37 peptid serverer ulike funksjoner i ulike immunreaksjoner, inkludert immunmodulering, betennelsesreaksjon, celleproliferasjon, angiogenese, og antiapoptotic aktivitet [16]. LL-37 er etablert som en bidragsyter til tumorigenesis og tumorprogresjon [16], [17]. Studier har vist i eggstokk-kreft LL-37 bidrar til celleproliferasjon, invasjon, og progresjon av kreft ved direkte stimulering av tumorceller, initiering av angiogenese og rekruttering av immunceller [14], [18], [19]. Behandling med et syntetisk biologisk aktivt LL-37 peptid eller transgen ekspresjon LL-37 øker tumorcellelunge spredning i betydelig grad. Denne forskningen tyder på at LL-37 fungerer som vekstfaktor for human lungekreft [20]. I tillegg LL-37 også vurderes å øke spredning og metastase i brystsvulster og maligne melanomer [21], [22]. Til sammen disse funnene støtter hypotesen om at LL-37 funksjoner en vekstfaktor i transformerte celler.
En rekke stimuli, inkludert pro-inflammatoriske molekyler, vekstfaktorer, næringsstoffer, bakterielle produkter, og spesielt betennelser og skader seg -regulate uttrykk for hCAP18 /LL-37 [16]. Hos mennesker er 1,25-dihydroksyvitamin D3 (1,25D3) oppregulerer ekspresjonen av hCAP18 /LL-37 med en vitamin D-reseptor (VDR) i monocytter, makrofager, kerationocytes i epidermis [23], [24]. Tidligere forskning som fokuserer på intracellulær
Mycobacterium tuberculosis
demonstrert TLR2 aktivering i humane makrofager oppregulert uttrykk for VDR og Cyp27B1 gener. Denne kaskade av hendelser som øker produksjonen av 1,25D3, som i sin tur fører til induksjon av hCAP18 /LL-37 [24]. Nyere studier av svulsten mikromiljøet har vist Lewis lungekarsinom (LLC) celler som produseres faktorer, slik som versican, er nødvendige for lungetumorvekst og metastase. Videre har denne fremgangsmåte er avhengig av TLR2-mediert myeloid celleaktivering [25], noe som resulterer i NF-kB-aktivering av inflammatoriske faktorer TNFa, IL-6-produksjon [26], [27].
Målet med denne studien er å undersøke reguleringsmekanismer hCAP18 /LL-37 i svulsten mikromiljøet. Her rapporterer vi versican V1 avledet fra tumorceller øker hCAP18 /LL-37-ekspresjon i makrofager gjennom aktivering av TLR2 og påfølgende vitamin D-avhengige mekanismer. Videre er det denne kjeden av cellulære signal hendelser som fremmer ovarial tumor-celleformering og invasjon. Disse resultatene foreslår ny mekanisme for hCAP18 /LL-37 regulering i svulsten mikromiljøet. I tillegg gir de innsikt i kritiske faktorer involvert i kreft progresjon.
Materialer og metoder
Cellelinjer og reagenser
Den menneskelige eggstokkreft cellelinjer OV-90 og SKOV3 celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection, og andre menneskelige eggstokkreft cellelinjer HO-8910, 3AO celler ble kjøpt fra Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Science. Disse cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Hyclon laboratorier. Inc, South, Utah, USA) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), 100 U /mL penicillin og 100 U /ml streptomycin (Hyclon laboratorier. Inc). Cellekulturer ble utført ved 37 ° C i fuktet luft med 5% CO
2. FCS ble erstattet med 10% komplement-inaktivert human serum (HS) (hentet fra blodbanken på Tongji Hospital of Tongji University. Institutional godkjennelse fra lokale forskningsetiske komiteer (intern gjennomgang og etikk styrene i Tongji Hospital, Tongji University ) ble oppnådd før gjennomføre denne studien) 24 timer før forsøket. Nøytraliserende antistoff anti-hCAP18 /LL-37 (2 mikrogram /ml, Clone # mAb 3D11, Hycult biotech, Nederland), anti-TLR2 (10 mikrogram /ml, Clone # mAb 383 936, R Abcam, Cambridge, UK) og kanin anti-hCAP18 /LL-37 (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), mus anti- β-aktin (1:10000, Sigma Aldrich, Steinheim, Tyskland). HRP-konjugert geite-anti-kanin (1:5000; Santa Cruz Biotechnology) eller kanin-anti-mus (1:1000; Dako, Glostrup, Danmark) ble anvendt som sekundært antistoff
RNA isolering og real-time. PCR
Cell totalt RNA ble forberedt med RNeasy pluss mini kit (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA) i henhold til produsentens anbefaling. Sanntids blandinger PCR reaksjons har blitt beskrevet tidligere [28]. I korthet cDNA ble syntetisert ved revers transkripsjonsreaksjon ved å bruke First Strand cDNA-syntesesett (Invitrogen). Real-time PCR ble utført ved hjelp av qPCR SYBR Grønn Mix (Bio-Rad) på en AB 7300 Real time PCR system maskin (AB Applied Biosystems, Singapore). De følgende PCR-primere ble anvendt: β-aktin, 5′-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 «og 5′-CTGGTGCCTGGGGCG-3′; hCAP18 /LL-37, 5»-TGGGCCTGGTGATGCCT-3 «og 5′-CGATGTTCCTTCGACAGGAAGC-3′; VDR, 5»-AAGGACAACCGACGC CACT-3 «og 5′-ACACACCTGTAGCCGTACTA-3′; Cyp27B1, 5»-ACCCGACAC GGAGACCTTC-3 «og 5′-CACAGGTGCGACAACTGGTA-3′; Cpy24, 5»-CGCAG CGGCTGGAGAT-3 «og 5′-ATGGCGTTTCTTCCGATGCC-3′; TLR1, 5»-AACCC ATTCCGCAGTACTCCA-3 «og 5′-AAGGCCACGTTTGCTCTTTTC-3′; TLR2, 5»-CAATGATGCTGCCATTCTCAT-3 «og 5′-ATTATCTTCCGCAGCTTGC A-3′; TLR3, 5»-ACAACTTTAGCACGGCTCTGGA-3 «og 5′-ACCTCAACTGGGATC TCGTCA-3′; TLR4, 5»-AGTTTCCTGCAATGGATCAAGG-3 «og 5′-CTGCTT ATCTGAAGGTGTTGCAC-3»; TLR6, CCCATTCCACAGAACAGCAT-3 «og 5′-A TAAGTCCGCTGCGTCATGA-3′; CD14, 5»-TGTGAGCTGGACGATGAAGAT-3 «og 5′-CAGACACACACTGGAAGGCTT-3». Spesifisitet av RT-PCR ble kontrollert av «ingen revers transkripsjon» kontroller og smeltekurve analyse. Kvantitative PCR-resultater ble oppnådd ved bruk av ΔΔCT (syklus terskel) -metoden. Data ble normalisert til p-actin-nivåer i hver prøve.
ELISA-assay for versican
Prøver av cellekultursupernatanter ble analysert ved human versican ELISA (USCN life science, INC. Houston, TX, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Påvisningsgrensen for analysen var 0,107 ng /ml.
Statistisk analyse
Verdier er vist som middelverdien pluss eller minus SEM. Sammenligninger mellom grupper ble analysert ved t-test (tosidig). Resultatene ble ansett som statistisk signifikant for P-verdier mindre enn 0,05.
Resultatene
Uttrykket av hCAP18 /LL-37 i makrofager fremme spredning og invasivitet av eggstokkreft celler
TAM erstattes med perifere, blodmonocyttavledede makrofager for
in vitro
ko-kultur eksperiment hadde blitt rapportert fra ulike grupper. Disse rapporter viser at perifere, blodmonocyttavledede makrofager ha tilsvarende funksjon til TAMs [27], [31]. For å bestemme effekten av makrofager på ovarial kreft celler proliferasjon, ble Transwell innsatser benyttes som en ko-kulturmodell. Humane, perifere, blodmonocyttavledede makrofager ble plassert i Transwell innsatser og forskjellige eggstokkkreftcellelinjer ble sådd ut på undersiden av 24-brønners plater. Ko-kultur-celler ble dyrket i 4 dager ko-kultur i DMEM inneholdende 10% HS eller behandling med EGF, som en positiv kontroll. Veksten av HO-8910, OV-90, SKOV3, og 3AO cellene ble betydelig økt ved samtidig dyrket med humane makrofager avledet fra perifert blod monocytter (Fig. 1a). For å hindre hCAP18 /LL-37 funksjons monocytt celler ble forbehandlet med en hCAP18 /LL-37 nøytraliserende antistoff før co-kultur med eggstokkreft celler. I ko-kultur forsøk hvor monocytter ble forbehandlet med den hCAP18 /LL-37-nøytraliserende antistoff en signifikant inhibering av HO-8910, OV-90, ble observert SKOV3, og 3AO celler vekst (fig. 1A). Ingen hemming av cellevekst ble observert i kontroll IgG1-antistoff ko-kultur-eksperimenter (fig. 1A). For å vurdere makrofag-indusert eggstokkkreftceller vekst av BrdU-inkorporering i de nylig syntetiserte DNA-tråder, målt ved anvendelse av anti-BrdU-antistoff i en ELISA-analyse. Konsistent den observerte økning i celleformering, syntese DNA i HO-8910, OV-90, SKOV3, og 3AO-celler ble merkbart øket når cellene ble ko-dyrket med makrofager (Fig. 1B). Som forventet, tilsetning av hCAP18 /LL-37-nøytraliserende antistoff redusert makrofagen effekt på ovarial cancer celleproliferasjon (fig. 1B). Deretter ble eggstokkkreftceller invasjon undersøkt. Disse cellene evne til å invadere Matrigel-belagte innsatser var også betydelig forbedret ved makrofager (fig. 1 C, D). Etter ko-kulturmedium ble behandlet med den hCAP /LL-37-nøytraliserende antistoff, det tumorcelle-invasjon betydelig svekket (fig. 1 C, D). Disse resultatene tyder på en direkte rolle for hCAP /LL-37 for å fremme tumorcelle invasjon. Et IgG-kontroll-antistoff ikke påvirker ovarial cancer celle invasjon (fig. 1 C, D). Samlet utgjør disse data tyder på at hCAP18 /LL-37 er nødvendig for Makrofagindusert spredning og invasjon i eggstokkreft celler.
For co-kultur eksperimenter av eggstokkreft celler med makrofager, humant perifert blodmonocyttavledede makrofager (1 x 10
4-celler) ble anbragt i Transwell innsatser og eggstokkreft celler (1 x 10
4-celler) ble sådd ut på undersiden av 24-brønners plater. Cellene ble preinkubert med 2 ug /ml anti-hCAP18 /LL-37 eller en lgG1 isotype kontroll Ab (2 ug /ml) i 2 timer. Cellene ble ko-dyrket i DMEM (10% HS) i 4 dager. 100 ng /ml EGF (Sigma, Steinheim, Tyskland) ble brukt som kontroll. (A) Spredning av eggstokkreft celler ble målt ved celletall teller. (B) Celleproliferasjon ble målt ved hjelp av ELISA (BrdU merking) analyse. (C) Invasion assay. Invasion analysene ble utført ved hjelp av en BD BioCoat Matrigel invasjonen Chamber med en 8 mikrometer porestørrelse PET-membran, jevnt belagt med BD Matrigel Matrix. Resultatene er middel ± SEM, betydelig forskjell, n = 3, * p 0,05. (D) Matrigel invasjon bestemmelse av SKOV3. DAPI farging av migrerte tumorceller. Representative delene er vist (a) SKOV3 ingen behandling. (B) SKOV3 + makrofager. (C) SKOV3 + makrofager + nøytraliserende anti-hCAP18 /LL-37 (2 ug /ml). (D) SKOV3 + makrofager + lgG1 isotype kontroll Ab (2 ug /ml). (E) SKOV3 + EGF (100 ng /ml).
Kreftceller utløse aktivering av vitamin D3 og TLR2 alarm og opp regulering av hCAP18 /LL-37 i makrofager
Å undersøke uttrykk mønster av hCAP18 /LL-37, humane makrofager ble ko-dyrket med SKOV3 celler. Induksjon av hCAP18 /LL-37 mRNA (fig. 2A) og protein (full-lengde hCAP18 /LL-37 og kløyvet LL-37, Fig. 2B) nivåer økt i makrofager. Motsatt var det ingen signifikante forskjeller i hCAP18 /LL-37 mRNA eller pro-peptid nivåer observert i SKOV3 celler (Fig. 2A, B). Nei, modne LL-37 ble ikke påvist i SKOV3 celler (Fig. 2B). Disse resultatene indikerte at makrofager, og ikke SKOV3-celler bidrar til frigjøring av LL-37 peptid. For å vurdere graden av hCAP18 /LL-37 og spaltet LL-37 i cellemediet, utførte vi western blotting på cellesupernatanter etter 24 timer av ko-kulturen. En betydelig økning i nivåene av forløperen og spaltede peptidet ble observert sammenlignet med makrofager eller SKOV3-celler (Fig. 2C).
Humane perifere, blodmonocyttavledede makrofager og SKOV3-celler ble inkubert sammen som beskrevet i figur 1 . Total RNA og proteiner av SKOV3-celler og makrofager ble isolert 24 timer etter ko-kulturen. (A) Et uttrykk for hCAP18 /LL-37 mRNA ble målt ved hjelp av sanntids-PCR. (B) Ekspresjon av hCAP18 /LL-37 protein ble analysert ved hjelp av western blot. β-actin tjente som lasting kontroll. (C) Western blot av cellesupernatanter fra SKOV3-celler, makrofager, og ko-kultur etter 24 timer. (D, E) Induksjon av VDR, Cyp24, Cyp27B1, TLRs og CD14 mRNA ble målt i makrofager ved real-time PCR. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM ganger endring, vesentlig forskjell, n = 3, * p 0,05; ns, ikke signifikant.
Gitt VDR har blitt rapportert å formidle uttrykk for hCAP18 /LL-37 [23], [24] vi undersøke om uttrykket av VDR og beslektede gener induseres under co-kultur. Faktisk ble det observert en økning i VDR mRNA nivåer når makrofager ble ko-dyrket med SKOV3 celler (Fig. 2D). Videre ble 1,25 D3 katabolske enzym Cyp24 (også kjent som Cyp24A1) indusert i makrofager når de ble ko-dyrket med tumorceller. Cyp27B1, som katalyserer omdannelsen av inaktive provitamin D3 hormon (25D3) til den bioaktive formen (1,25D3) [24], mRNA-nivåer ble også oppregulert i den ko-kulturmodell (fig. 2D). Det har blitt rapportert at TLR2-aktivering fører til vitamin D-avhengig induksjon av hCAP18 /LL-37 i makrofager [32]. TLR2, 6 og CD14 mRNA nivåer viste all den forventede økningen i co-kultivert makrofager. Uttrykket nivåer av TLR1, TLR3, og TLR4 ble ikke endret i disse makroceller (Fig. 2E).
Eggstokkreft celle-mediert induksjon av hCAP18 /LL-37, VDR, Cyp24, og Cyp27B1 i makrofager er avhengig av TLR2 og TLR6
neste søkt å fastslå om induksjon av hCAP18 /LL-37 var avhengig TLR2 induksjon. Humane makrofager avledet fra perifere blodmonocytter ble inkubert i 2 timer med en TLR2-nøytraliserende antistoff eller en lgG1 isotype kontroll-antistoff, deretter stimulert i 24 timer i SKOV3-celle kondisjonert medium (SKOV3-CM) med 10% HS. I makrofagceller ble behandlet med TLR2 nøytraliserende antistoff ble det observert en signifikant reduksjon i hCAP18 /LL-37-induksjon, ble ingen signifikant effekt på geninduksjon observert i kontrollantistoffet behandlede prøvene (fig. 3A). For å avgjøre om induksjon av VDR, Cyp24, og Cyp27B1 ble også påvirket av eksponering for TLR2 nøytraliserende antistoff, ble mRNA nivåer målt. Prøvene utsatt for sameTLR2 antistoff viste ingen induksjon av VDR, Cyp24, eller Cyp27B1, igjen uten inhibitor påvirker ble observert i IgG antistoff kontrollprøver (Fig. 3B-D). Disse eksperimentene ble gjentatt ved bruk av en TLR6 nøytraliserende antistoff, ble det samme mønsteret av inhibering observert, med induksjon av hCAP18 /LL-37, VDR, Cyp24, og Cyp27B1 blir blokkert i TLR6 antistoffprøver, men ikke kontrollgruppen (Fig. 3A -D). Kombinering av TLR2 og TLR6 nøytraliserende antistoffer som tilbys muligheten for en synergistisk effekt inaktivering av disse genene (Fig. 3A-D). Disse data indikerer tumor-mediert induksjon av hCAP18 /LL-37 krever TLR2 /6 aktivitet i makrofager. Denne induksjonsmekanismen er antatt å være involvert i vitamin D3-signalering. I ytterligere støtte for vår modell, tilsetning av nøytraliserende antistoffer mot TLR2 eller TLR6 undertrykte betydelig SKOV3-celle proliferasjon og invasivitet (fig. 4A, B). Kombinering av TLR2 og TLR6 nøytraliserende antistoff resulterte i en synergistisk inhibering effekt på SKOV3-celle progresjon (fig. 4A, B). Disse resultatene indikerer aktivering av TLR2 eller TLR6 er nødvendig for tumorcellen progresjon.
humane makrofager ble preinkubert med 10 ug /ml anti-TLR2, 10 ug /ml anti-TLR6 eller en lgG1 isotype kontroll-antistoff (10 ug /ml) i 2 timer. Deretter makrofager var kultur med DMEM (10% HS) eller SKOV3-CM (10% HS) i 24 timer, og total RNA ble hentet for real-time PCR-analyse. (A) hCAP18 /LL-37 mRNA. (B) VDR mRNA. (C) Cyp24 mRNA. (D) Cyp27B1 mRNA. Bety ganger endring ± SEM, n = 3, * p. 0,05
Humane perifere, blodmonocyttavledede makrofager og SKOV3-celler ble preinkubert med 10 ug /ml anti-TLR2, 10 ug /ml anti -TLR6 eller en lgG1 isotype kontroll Ab (10 ug /ml) i 2 timer. Cellene ble ko-dyrket i DMEM (10% HS) i 4 dager. 100 ng /ml EGF ble anvendt som kontroll. (A) Cell nummer, spredning og invasjon av SKOV3 celler ble målt. Gjennomsnittlig ganger endring ± SEM, n = 3, * p 0,05. (B) Matrigel invasjon bestemmelse av SKOV3. DAPI farging av migrerte tumorceller. Representative seksjoner er vist som angitt. (A) SKOV3 ingen behandling. (B) SKOV3 + makrofager. (C) SKOV3 + makrofager + nøytraliserende anti-TLR2. (D) SKOV3 + makrofager + nøytraliserende anti-TLR6. (E) SKOV3 + makrofager + nøytraliserende anti-TLR2 og anti-TLR6. (F) makrofager SKOV3 + + lgG1 isotype kontroll Ab. (G) SKOV3 + EGF (100 ng /ml).
TLR2 /6 mediert uttrykk for hCAP18 /LL-37 via Cyp27B1 og VDR aktivering
Cyp27B1 avhengig biokonversjon av 25D3 til 1,25D3 er en viktig funksjon av vitamin D-mediert hCAP18 /LL-37 uttrykk [33]. For å bestemme hvorvidt den tumor-indusert aktivering av TLR2 /6 forbedret bioaktivitet av Cyp27B1, og dermed fører til hCAP18 /LL-37 ekspresjon, ble makrofager eksponert for TLR2-TLR6 ligand Pam2CSK4, i nærvær og fravær av 25D3 medier (DMEM uten serum ). Ekspresjon av hCAP18 /LL-37 ble ikke påvirket ved eksponering til 25D3 eller Pam2CSK4 uavhengig av hverandre. Men hCAP18 /LL-37expression ble indusert etter samtidig eksponering (Fig. 5A). Videre hemming av Cyp27B1 av itrakonazol blokkert TLR2 /6 aktivering og en etterfølgende økning inhCAP18 /LL-37 mRNA-nivåer (fig. 5A). Tilsetning av VDR antagonist ZK159222 også inhiberte induksjon av hCAP18 /LL-37 ekspresjon som bestemt ved mRNA-nivåer (fig. 5A). Deretter vi ko-dyrkede primære makrofager og SKOV3-CM (uten serum) i nærvær av en rekke 25D3 konsentrasjon, og nivåer av hCAP18 /LL-37 mRNA ble målt ved qPCR. I en annen makrofag /SKOV3-CM co-kulturen eksperiment tilsetning av 25D3 betydelig økt hCAP18 /LL-37 mRNA-nivåer på en doseavhengig måte (fig. 5B). Det er bemerkelsesverdig at SKOV3-CM uten HS induserte ikke ekspresjon av hCAP18 /LL-37 (fig. 5B) på grunn av utilstrekkelig vitamin D i kulturmedium [24], [33]. Disse resultatene tyder derfor på at tumorindusert aktivering av TLR2 /6 i humane makrofager utløser hCAP18 /LL-37 uttrykk. Videre data støtter denne opp reguleringen er avhengig av Cyp27B1 og VDR mediert endogen produksjon av 1,25D3.
(A) humane makrofager ble forbehandlet med VDR antagonist ZK159222 (10
-7 M) eller den Cyp27B1 antagonist itrakonazol (10
-7 M) i 2 timer og deretter stimulert med TLR2 /6 ligand Pam2CSK4 (100 ng /ml) i nærvær eller fravær av 25D3 (10
-6 M) (DMEM uten serum) i 24 timer. Ekspresjon av hCAP18 /LL-37 mRNA ble bestemt som beskrevet i figur 3. (b) Regulering av hCAP18 /LL-37 genet på stimulering med 25D3 i DMEM (uten serum) eller SKOV3-CM (uten serum). Gjennomsnittlig ganger endring ± SEM, n = 3, * p. 0,05
Tumor-utskilt versican V1 aktiverer TLR2 og TLR6 å indusere hCAP18 /LL-37 uttrykk i makrofager
Som angitt ovenfor, ko-kultur av makrofager /SKOV3-celler aktivert TLR2 /6 og dermed økt hCAP18 /LL-37 ekspresjon i makrofager. Disse resultatene tyder på ubestemte løselige faktorer produsert av SKOV3-celler medierer denne prosessen. Kim et al. viste at versican V1, en makrofag aktivator som virker gjennom TLR2 og dets ko-reseptorene TLR6 og CD14, er opp regulert i mange humane tumorer inkludert eggstokkreft og lungekreft, og forbedrer tumor metastatisk vekst lunge [25]. For å avgjøre om versican V1 kan være løselig faktor ansvarlig for TLR2 /6 aktivering observert her vi undersøkt versican V1 uttrykk nivåer i kreftceller co-dyrket med makrofager. Figur 6A viste versican V1-protein-ekspresjon ble øket i totale cellelysater av SKOV3, HO-8910, OV-90, og 3AO cellene når ko-dyrket i 24 timer. For å undersøke nivået av versican V1 sekresjon fra ovarietumorceller vi inkubert SKOV3, HO-8910, OV-90, og 3AO celler med kondisjonert medium fra makrofager (M-CM) i 24 timer. ELISA-analyser ble utført for å bestemme tilstedeværelsen av utskilt versican V1 i cellemedium.
