Abstract
Nikotin acetylkolin reseptor subenheter (nAChR) er assosiert med ulike aspekter av røykevaner samt med røyking relaterte lidelser. Flere av disse underenheter har blitt funnet å være oppregulert hos røykere eller forskjellig uttrykt i lunge tumorceller. Mekanismene bak disse observasjonene er ikke kjent, men antas å være hovedsakelig post-transcriptional. Mange ettertranskripsjonsmekanismer er initiert av funksjonelt relevante sekvensmotiver innenfor uoversatt genområder som oppstrøms åpne leserammer (uORFs). Vi utførte en systematisk søk i alle røyking-forbundet nevronale nAChR subenheter og identifisert funksjonelt relevante uORFs i
CHRNA4 Hotell og
CHRNA5
. Luciferase eksperimenter viste at disse uORFs er i stand til å betydelig redusere proteinekspresjon. Vår kvantitativ real-time PCR (qPCR) resultater tyder sterkt på at de observerte effektene stammer i oversettelse i stedet for på transkripsjonsnivå. Interessant,
CHRNA4
uORF var bare funksjonelt relevant når det uttrykkes i kortere isoform av dette genet. Derfor de data som presenteres i denne studien sterkt peker mot en viktig rolle uORFs innenfor 5’UTR av
CHRNA4
-isoform en og
CHRNA5
som regulatorer av protein oversettelse. Videre felles uORF av
CHRNA4
-isoform 1 /isoform to representerer det første eksempelet på en sekvens kontekstavhengig uORF
Citation. Eggert M, Aichinger E, Pfaffl MW, Steinlein OK , PFOB M (2013) Nikotin Acetylkolin reseptorsubenheter α4 og α5 forbundet med røyking Behaviour og lungekreft er regulert av Upstream åpne leserammer. PLoS ONE 8 (7): e66157. doi: 10,1371 /journal.pone.0066157
Redaktør: Huibert D. Mansvelder, Neuroscience Campus Amsterdam, VU University, Nederland
mottatt: 12 mars 2013; Godkjent: 02.05.2013; Publisert: 02.07.2013
Copyright: © 2013 Eggert et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft [STE16511-2] og Friedrich-Baur-Stiftung [No 57/12]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Sigarettrøyking er kjent som en viktig risikofaktor for hjerte- og karsykdommer og røyking-assosierte maligniteter som lungekreft [1]. Likevel, om lag hver tredje voksne i verden røyker og antallet er økende [2]. Derfor er det ikke overraskende at store anstrengelser er gjort for å avdekke årsakene til nikotinavhengighet, samt å utvikle nye strategier for forebygging og terapi. Nikotin virker som en acetylkolin-agonist som er i stand til å bindes til neuronale nikotiniske acetylkolinreseptorer (nAChR). Den nAChR danne heterogene og homogene pentamer ionekanaler med et mangfoldig uttrykk mønster i nevronale og ikke-nevronale vev [3]. Derfor er mange av de gener som koder for nAChR subenheter er mistenkt for å spille en nøkkelrolle om nikotinavhengighet. Flere nAChR subenhetgenene har allerede blitt knyttet til røyking og røykerelaterte sykdommer. For eksempel
CHRNA7
, genet som koder den α7 nAChR subenheten ble vist å undertrykke luftveis basal celle spredning og å renovere lungeepitelet. I tillegg fremkom hypotesen om at feilregulert α7 ekspresjon gir opphav til preneoplastiske transformasjoner [4], [5]. Genetiske varianter innenfor den kodende regionen, men også i promoterregionen av
CHRNA4
er forbundet med både personlige respons på røyking og røykeslutt utfall [6] – [10]. Men de fleste studier som har blitt publisert på temaet kolinerge reseptorer og nikotinavhengighet /røyking relaterte sykdommer peke mot nAChR clusteret på kromosom 15. De polymorfismer i denne regionen som er mest konsekvent rapportert å være forbundet med røyking mengde, nikotinavhengighet , lungekreft og perifer arteriell sykdom ligger enten i
CHRNA5
eller
CHRNA3
genet [11] – [16]. I tillegg assosiasjoner mellom
CHRNB3
polymorfismer og svar på første gang tobakksbruk ble beskrevet [17].
De mekanismer som nAChR gener assosiert med nikotinavhengighet er regulert er ikke kjent i detalj så langt . Generelt kan genuttrykk endres enten før eller etter transcriptionally. De sistnevnte mekanismer er ofte mediert av cis-virkende sekvensmotiver lokalisert innenfor den ikke-translaterte regioner (UTR) som er til stede opp- og nedstrøms for de fleste eukaryote genet kodende regioner. Flere motiver i 5’UTR ansvarlige for translasjonsforskning regulering har blitt identifisert i eukaryote gener som interne ribosomet oppføring, jern responsive elementer og oppstrøms åpne leserammer (uORFs). De sistnevnte elementene kan spille en avgjørende rolle i reguleringen av genuttrykk. En voksende mengde bevis viser at uORFs er i stand til å påvirke protein oversettelse på ulike måter. Skanne ribosomer sette en uORF kanskje ikke være i stand til å gjenoppta videre nedstrøms på kodende region ATG, eller kanskje stall på uORF, blokkere andre ribosomer (ribosomalt veisperring). Alternativt kan stoppkodonet av uORF forveksles som en tull mutasjon, utløser tull mediert forfall. [18], [19]. Videre kan det uORF proteinet i seg selv modulerer translasjon, som indikert ved mutagenese eksperimenter innføre missense mutasjon i uORF sekvenser [20]. Alle disse mekanismene vil sannsynligvis øke den funksjonelle variasjonen av gener innenfor populasjoner. Den funksjonelle betydningen av uORFs blir ytterligere understreket av funn at mutasjoner i dem er i stand til å forårsake menneskelige sykdommer som arvelig trombocytemi eller Marie Unna arvelig håravfall [21], [22].
I denne studien vi utførte et systematisk søk etter funksjonelt relevante uORFs i nAChR subenheter som er mistenkt for å være involvert i nikotinavhengighet og røykerelaterte sykdommer. Våre forsøk viste at noen uORFs bidra til regulering av nAChR protein uttrykk.
Materialer og metoder
I silico
analyse av mulige uORFs i 5’UTR av α3, α4, α5, α7, og SS3 nAChR subenheter
5’UTRs av
CHRNA3, CHRNA4
isoform 1 og 2,
CHRNA5, CHRNA7 Hotell og
CHRNB3
(som koder for nAChR underenheter α3, α4, α5, α7 og SS3) ble screenet for i-ramme start- og stopp-kodoner oppstrøms for hoved startkodonet med StarORF Finder (https://star.mit.edu/orf/runapp .html). SNPs validert av SNP genet utsikt over NCBI og ligger innenfor uORF sekvens eller lage /slette en uORF ble ansett for undersøkelse (Fig. 1).
«UTR av nikotinavhengighet-forbundet nAChR subenhetgenene med antatte uORFs. Den bp posisjon for hver uORF (start /stopp) er avbildet starter fra hoved startkodon i 5’retning.
CHRNA4
isoform en og isoform to ulik koding regionen, med en ytterligere nedstrøms oversettelse initiering for isoform 2, som forlenger sin 5’UTR.
CHRNA4
isoform 2 ble ikke publisert før i 2012, og har ikke vært funksjonelt analysert før. Squares, uORFs; piler, SNPs
Plasmid bygging
Firefly luciferase vektor pGL4.10 (AY738222.1) og Renilla luciferase vektor pGL4.74 (AY738230.1) ble kjøpt fra Promega (Mannheim, Tyskland). TK-arrangøren sekvens ble kuttet ut av pGL4.74 med Kpnl og XhoI (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland) etter å generere en XhoI restriksjonssete i posisjon bp 783 bruker geneart seterettet mutagenese system (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland ). Etter Kpnl og Xhol spaltning av pGL4.10, ble TK-promotoren sekvensen ligert inn i det multiple kloningssete av pGL4.10 oppstrøms for ildflue luciferase-kodende sekvens. De 5’UTR innsatsene til nAChR underenheter α4 isoform 1 og 2, α5 og P3 ble syntetisert (MWG Eurofins, Ebersberg, Tyskland), og klonet inn i pGL4.10 med Xhol og Ncol (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland) direkte mellom TK-promoteren og ildflueluciferase kodende sekvens. Etter kloning av innskudd ble bekreftet ved sekvensering. For å skape konstruksjoner som mangler et viss uORF, ble ATG i uORF mutert til TTG. Likeledes ble SNP alleler innen uORFs utveksles ved seterettet mutagenese. For
CHRNA4
isoform 1 (NM_000744.6), husing en antatt uORF, to konstruksjonene ble opprettet: ett med villtype mRNA (
CHRNA4
-iso1-1) og ett med det muterte uORF startkodon (
CHRNA4
-iso1-2). For en påfølgende test (se resultatene), ble to mer konstruerer opprettet: en der stoppkodonet av uORF ble mutert (TAG til TAC), men Firefly startkodon bodde intakt (
CHRNA4
-iso1- 3), og en mangler både stoppkodonet av uORF og firefly startkodon (ATG til TTG) (
CHRNA4-
iso1-4).
for
CHRNA4
isoform 2 (NM_001256573.1), som har fem antatte uORFs, seks konstruksjoner ble laget: en med villtype-mRNA (
CHRNA4
-iso2-uORF1-5) og fem konstruksjoner, hvor hver og en av de fem uORFs ble slått av, nummerert tilsvarende, med den nyeste 5 «ligger uORF (
CHRNA4
-iso2-uORF1;
CHRNA4
-iso2-uORF2;
CHRNA4
-iso2 -uORF3;
CHRNA4
-iso2-uORF4;.
CHRNA4
-iso2-uORF5)
For
CHRNA5 plakater (NM_000745.3), husing en antatte uORF inneholder en SNP, fire konstruksjonene ble opprettet: ett med allel guanin og intakt /avslåtte uORF (
CHRNA5
-1;
CHRNA5
-2) og en med allelet adenin og intakt /avslåtte uORF (
CHRNA5
-3;
CHRNA5
-4). For en etterfølgende test (se resultater) ble to mer konstrukter ble opprettet: en hvor stoppkodonet av den uORF ble mutert (TAG til TAC), men det ildflue-startkodon oppholdt seg intakt (
CHRNA5
-5) , og en mangler både stoppkodonet av uORF og firefly startkodon (ATG til TTG) (
CHRNA
56).
for
CHRNB3 plakater (NM_000749.3 ), husing en antatt uORF og en SNP med de store allelet adenin skape en uORF startkodon ble tre konstruksjoner brukt: en med intakt uORF startkodon generert av SNP-allelet adenin (
CHRNB3
-1); en med det mindre SNP allelet guanin å slette den første uORF startkodon (
CHRNB3
-2) og dermed fører til en avkortet uORF og en tredje konstruksjon med SNP allelen guanin hvori startkodonet av det avkortede uORF slås off (
CHRNB3
-3). En oversikt over de konstruerer brukt i våre forsøk er vist i tabell 1.
Cell kultur
De humane embryonale nyreceller (HEK) 293 ble kjøpt fra Cellelinjer tjeneste (CLS, Eppelheim, Tyskland). Dyrking av cellene ble utført i T75-kolber i monosjikt med DMEM (Sigma-Aldrich, Hamburg, Tyskland) inneholdende 4,5 g glukose, 10% FBS, 1% L-glutamin og 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland). Cellene ble holdt i en fuktig atmosfære ved 37 ° C og 5% CO
2.
HEK 293-celler ble ko-transfektert med plasmid reporteren pGl4.10 + TK inneholdende 5’UTR av α4 isoform 1 og 2, henholdsvis α5 og SS3, og kontroll plasmid pGL4.74 i forholdet 20:01 hjelp Transit ®-LT1 transfeksjon Reagens (Mobitec, Göttingen, Tyskland) med 24 h transfeksjon før luciferase assay og qPCR, henholdsvis .
Luciferase-analyse
HEK293-celler ble utsådd 24 timer før transfeksjon med 3 x 10
5-celler i 24 brønners plater (Greiner bio-en, Frickenhausen, Tyskland). Firefly og Renilla luciferasepreparater aktiviteter ble målt med Tristar LB941 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland) ved Dobbel-Glow® luciferase assay system (Promega, Mannheim, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. Forholdet mellom ildflue luciferase og Renilla luciferaseaktivitet ble bestemt og normalisert til pGL4.10 + TK. De ulike 5’UTR konstruksjoner blir uttrykt som ganger endring til pGL4.10 + TK.
Alle forsøk ble gjentatt uavhengig tre ganger med tredoble prøver. En to-halet t-test ble anvendt for å sammenligne verdiene av testprøvene og kontrollprøvene. En
p
verdi på
p
0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle data er uttrykt som ganger endring og som gjennomsnitt ± SEM.
qPCR
kvantitativ real-time PCR ble utført hvis luciferase assay viste signifikante resultater. Co-transfeksjon med de forskjellige konstruksjonene ble utført som beskrevet ovenfor. RNA ble ekstrahert ved anvendelse av en Qiagen RNAeasy pakke med DNase-behandling av 10 min, i henhold til produsentens protokoll (Qiagen, Hilden, Tyskland). Første-tråd cDNA-syntese ble utført ved anvendelse av 1 pg av total RNA fra hver transfeksjon som utgangsmateriale (iScript ™ cDNA syntese kit, Bio-Rad, Munchen, Tyskland). Real-time PCR ble utført målretting ildflue luciferase (mål) og Renilla luciferase (kontroll) kodende sekvens ved hjelp av følgende primere ildflue-fwd 5’TGCAACACCCCAACATCTTC-3 «og firefly-rev 5’CCTTTAGGCACCTCGTCCAC-3»; Renilla-fwd 5’AATGGCTCATATCGCCTCCT-3 «og Renilla-rev 5′-CACGACACTCTCAGCATGGA-3». Forsterkningsvirkningsgrad og test linearitet (korrelasjonskoeffisient R «sup> 2) ble undersøkt for hver primer par (fig. S1). Reaksjonene ble utført i 20 pl volum inneholdende 10 pl SsoFast
TM EvaGreen
® Supermix (Bio-Rad, Munchen, Tyskland), 125 nM av hver primer, 7 ul molekylærbiologi grad vann og 1 mL av hver enkelt mal etter cDNA syntese. Termisk sykling besto av denaturering (98 ° C i 5 s), avspenning og utvidelse (60 ° C for Renilla, 62 ° C for ildflue i 5 s), utført i 50 sykkel trinn i Mini Opticon CFD-3120 cycler (Bio- Rad, München, Tyskland). Smelting kurve analysen varierte fra 65 ° C til 95 ° C med 0,5 ° C intervaller. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger uavhengig av hverandre med triplikate tekniske prøver. En to-halet t-test ble anvendt for å sammenligne verdiene av målet prøver og kontrollprøver. En
p
verdi på
p
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
CHRNA3 Hotell og
CHRNA7
i silico
analyse viste at verken 5’UTR av
CHRNA3
isoform 1 (NM_000743.4) og isoform 2 (NM_ 001.166.694,1) eller av
CHRNA7
isoform 1 (NM_000746.5) og isoform 2 (NM_001190455.2) inneholder antatte uORFs (Fig. 1). Derfor ble disse to subtype gener ikke inkludert i studien.
CHRNA4
isoform en 5’UTR havner en funksjonell uORF
To ulike
CHRNA4
mRNA-varianter eksisterer. Isoform 1 (NM_000744.6) oppviser en 5’UTR lengde på 231 nt, mens isoform 2 (NM_001256573.1) er karakterisert ved en lengre 5’UTR (690 nt) på grunn av kodende region forskjeller som resulterer i en ytterligere nedstrøms translasjonsinitiering. I 5’UTR av
CHRNA4
isoform en ett antatte uORF av 60 nt lengde kan være lokalisert
i silico plakater (Fig. 1). Dens startkodon er omfattet av en tilstrekkelig Kozak konsensussekvensen (på grunn av guanin i posisjon -3). Konstruksjonene
CHRNA4
-iso1-1 og
CHRNA4
-iso1-2 ble testet av luciferase assay (tabell 1 og S1). Resultatene viste at å slå av uORF betydelig økt
CHRNA4
-iso1-1 protein uttrykk med 4,8 ganger (
CHRNA4
-iso1-1 0,6 ± 0,09;
CHRNA4 Anmeldelser – iso1-2 2,9 ± 0,43;
p
= 0,013) (fig 2A)
A: Luciferase assay av
CHRNA4
isoform en 5’UTR resultert i betydelig økning.. i protein uttrykk når du slår av uORF. Brett endring av firefly aktivitet normalisert til pGl4.10 + TK, er illustrert for de tre forskjellige konstruksjoner; 1, pGl4.10 + TK; 2,
CHRNA4
-iso1-1; 3,
CHRNA4
-iso1-2. B: uORF ATG av
CHRNA4
-iso1 er i stand til å initiere oversettelse, noe som resulterer i en langstrakt Firefly protein. Brett endring av firefly aktivitet normalisert til pGl4.10 + TK, er illustrert for de fem ulike konstruksjoner; 1, pGl4.10 + TK; 2, pGl4.10; 3,
CHRNA4
-iso1-2; 4,
CHRNA4
-iso1-3; 5,
CHRNA4
-iso1-4. C: Relativ qPCR for
CHRNA4-iso1
5’UTR viste ingen signifikante forskjeller i mRNA mengden når man sammenligner intakt med slettet uORF. Brett endring av firefly mRNA normalisert til pGl4.10 + TK, er illustrert for de tre forskjellige konstruksjoner; 1, pGl4.10 + TK; 2,
CHRNA4
-iso1-1; 3,
CHRNA4
-iso1-2. D: Ingen av de fem uORFs av
CHRNA4
-iso2 5’UTR viste signifikante resultater. Brett endring av firefly aktivitet normalisert til pGl4.10 + TK, er illustrert for de sju ulike konstruksjoner; 1, pGl4.10 + TK; 2,
CHRNA4
-iso2-uORF1-5; 3,
CHRNA4
-iso2-uORF1; 4,
CHRNA4
-iso2-uORF2; 5,
CHRNA4
-iso2-uORF3; 6,
CHRNA4
-iso2-uORF4; 7,
CHRNA4
-iso2-uORF5. Feilfelt representerer ± SEM av 3 biologiske replikat. Stjernene viser signifikante forskjeller (
p
0,05).
Noen, men ikke alle uORFs er oversatt til protein. I et neste skritt vi derfor undersøkt om ATG startkodon av
CHRNA4-
iso1-1 uORF er i stand til å initiere protein oversettelse, som vil være en forutsetning for oversettelse av uORF selv. En oversatt uORF med en mutert stoppkodon, klonet i ramme med den ildflue ORF bør føre til syntese av et langstrakt ildflue protein. De to konstruksjoner
CHRNA4-
iso1-3 og
CHRNA4-
iso1-4 ble sammenlignet med
CHRNA4
-iso1-2. Den uORF ble satt i ramme med Firefly ORF for alle 3 konstruksjoner. Resultatene viste ingen signifikant forskjell i proteinuttrykk endrer seg mellom
CHRNA4
-iso1-2 og
CHRNA4-
iso1-3 heller ikke mellom
CHRNA4
-iso1-2 og
CHRNA4-
iso1-4 (
CHRNA4
-iso1-2 1,47 ± 0,59;
CHRNA4
-iso1-3 0,94 ± 0,25;
p
= 0,542 ;
CHRNA4
-iso1-2 1,47 ± 0,59;
CHRNA4
-iso1-4 0,83 ± 0,26;
p
= 0,471). Sammenligning av
CHRNA4
-iso1-4 med kontroll vektor pGL4.10 viste en økning i protein uttrykk som ikke nådde betydning (
CHRNA4
-iso1-4 0,83 ± 0,26; pGL4.10 0,03 ± 0,01;..
p
= 0,067) (fig 2B)
for å analysere om resultatene av luciferase assay skyldtes en transkripsjonen eller en translasjonell effekt, utførte vi relativ kvantitativ real -time PCR (qPCR). Når man sammenligner mRNA mengden av cellene transfektert med konstruksjonene
CHRNA4
-iso1-1 og
CHRNA4
-iso1-2 ble det ikke observert signifikante endringer mellom intakt og slettet uORF (
CHRNA4
-iso1-1 1,23 ± 0,29;
CHRNA4
-iso1-2 1,05 ± 0,22;..
p
= 0,702) (fig 2C)
5 «UTR av
CHRNA4
isoform 2 inneholder fem antatte uORFs spenner 18-60 nt i lengde (fig. 1). Konstruktet med bare intakte uORFs ble sammenliknet med konstruksjoner i hvilke hver og en av de fem uORFs ble slått av (tabell 1 og S1). Resultatene viste ingen signifikante forskjeller vedrørende intakt versus avslått uORF. Dette gjelder særlig for de mest 5 «uORF som er tilstede i både
CHRNA4
isoformer. Dette uORF syntes å være funksjonelle i isoformen med kortere 5’UTR (se ovenfor), men forårsaket ingen endringer i proteinuttrykk når avslått i isoformen med lengre 5’UTR (Fig. 2D). (
CHRNA4
-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;
CHRNA4
-iso2-uORF1 0,13 ± 0,02;
p
= 0,644;
CHRNA4
-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;
CHRNA4
-iso2-uORF2 0,14 ± 0,03;
p
= 0,607;
CHRNA4
-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;
CHRNA4
-iso2-uORF3 0,14 ± 0,02;
p
= 0,427;
CHRNA4
-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;
CHRNA4
-iso2-uORF4 0,15 ± 0,03;
p
= 0,514;
CHRNA4
-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;
CHRNA4
-iso2-uORF5 0,12 ± 0,02 ;.
p
= 0,926)
Når man sammenligner de to villtype isoformer
CHRNA4
-iso1-1 og
CHRNA4
-iso2-uORF1-5, resultatene viste at proteinet uttrykk for sistnevnte ble betydelig redusert (
CHRNA4
-iso1-1 0,6 ± 0,09;
CHRNA4
-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;
p
= 0,014).
CHRNA5
5’UTR inneholder en post-transcriptionally funksjonell uORF
CHRNA5
5’UTR (NM_000745. 3) ble funnet å nære en antatte uORF av 30 nt lengde (fig. 1). Innenfor denne uORF SNP rs56182392 med forfedrenes allel guanin (allel frekvens 99,4%) og de sjeldne allel adenin resulterer i en aminosyre utveksling fra alanin til treonin når oversatt.
For å analysere
CHRNA5
uORF og dens SNP på proteinnivå vi testet våre konstruksjoner av luciferase analyser (Tabell 1 og S1). Konstruksjonene
CHRNA5
-2 og
CHRNA5
-4 resulterte i et protein økning på 50%, henholdsvis 65%, sammenlignet med
CHRNA5
-1, henholdsvis
CHRNA5
-3 (
CHRNA5
-1 0,76 ± 0,03;
CHRNA5
-2 1,15 ± 0,06;
p
= 0,009;
CHRNA5
-3 0,63 ± 0,08;
CHRNA5
-4 1,04 ± 0,03;
p
= 0,006). Følgelig, i begge tilfeller konstruksjonene som mangler uORF produserte signifikant mer protein enn de tilsvarende konstruksjoner med intakte uORFs. Når man sammenligner de to alleler av rs56182392 (konstruksjoner
CHRNA5
-1 og
CHRNA5
-3) registrerte protein endringene var ikke signifikante (Fig. 3A).
«UTR havner en funksjonell uORF;
CHRNB3
uORFs er ikke involvert i translasjonell kontroll. A: Luciferase assay av
CHRNA5
5’UTR resulterte i signifikant økning i proteinuttrykk når du slår av uORF. Brett endring av firefly aktivitet normalisert til pGl4.10 + TK, er illustrert for de fem ulike konstruksjoner; 1, pGl4.10 + TK; 2,
CHRNA5
1; 3,
CHRNA5
-2; 4,
CHRNA5
-3; 5,
CHRNA5
-4. B: uORF startkodon av
CHRNA5
ikke starte oversettelses så effektivt som ildfluen startkodon. Brett endring av firefly aktivitet normalisert til pGl4.10 + TK, er illustrert for de fem ulike konstruksjoner; 1, pGl4.10 + TK; 2, pGL4.10; 3,
CHRNA5
-2; 4,
CHRNA5
-5; 5,
CHRNA5
-6. C: Relativ qPCR for
CHRNA5
5’UTR viste ingen signifikante forskjeller i mRNA mengden når man sammenligner intakt med slettet uORF. Imidlertid signifikante forskjeller ble vurdert for transkripsjon av de to SNP allel varianter. Brett endring av firefly mRNA normalisert til pGl4.10 + TK, er illustrert for de fem ulike konstruksjoner; 1, pGl4.10 + TK; 2,
CHRNA5
1; 3,
CHRNA5
-2; 4,
CHRNA5
-3; 5,
CHRNA5
-4. D: Luciferase assay av
CHRNB3
5’UTR viste ingen signifikante resultater. Brett endring av firefly aktivitet normalisert til pGl4.10 + TK, er illustrert for de fire forskjellige konstruksjoner; 1, pGl4.10 + TK; 2,
CHRNB3
1; 3,
CHRNB3
-2; 4,
CHRNB3
-3. Feilfelt representerer ± SEM av 3 biologiske replikat. Stjernene viser signifikante forskjeller (
p
0,05).
Igjen, for å vurdere om ATG startkodon av
CHRNA5
uORF er i stand til å initiere protein oversettelse, de to konstruksjonene
CHRNA5
-5 og
CHRNA5
-6 ble sammenlignet med
CHRNA5
-2. Den uORF ble satt i ramme med Firefly ORF for alle 3 konstruksjoner. Resultatene viste at så lenge Firefly startkodon var intakt luciferase protein ble sterkt uttrykt (
CHRNA5
-2 1,31 ± 0,30;
CHRNA5
-5 1,55 ± 0,46;
p
= 0,736). Men protein uttrykk falt med mer enn 90% når utelukkende ATG av uORF var tilstede (
CHRNA5
-2 1,31 ± 0,30;
CHRNA5
-6 0,08 ± 0,01;
p
= 0,029). Sammenligning av
CHRNA5
-6 med kontroll vektor pGL4.10 viste ingen signifikante forskjeller (
CHRNA5
-6 0,08 ± 0,01; pGL4.10 0,03 ± 0,01;
p
= 0,069) (fig. 3B).
Vi deretter utført forhold qPCR å utelukke en effekt på RNA nivå som en årsak til våre funn. Når man sammenligner mRNA mengden av cellene transfektert med de respektive konstruksjoner (
CHRNA5
-1;
CHRNA5
-2;
CHRNA5
-3;
CHRNA5
-4) ved relative qPCR ble det ikke observert signifikante endringer mellom intakt og slettet uORF (
CHRNA5
-1 0,98 ± 0,01;
CHRNA5
-2 0,97 ± 0,01;
p
= 0,369;
CHRNA5
-3 1,05 ± 0,01;
CHRNA5
-4 1,10 ± 0,05;
p
= 0,459) (figur 3C).. Dermed uORF ikke kvantitativt endre mRNA-nivå. Konstruer
CHRNA5
-3 inneholder sjeldne Et allel av rs56182392 ga betydelig mer ildflue luciferase transkripsjoner enn
CHRNA5
-1 (
CHRNA5
-1 0,98 ± 0,01;
CHRNA5
-3 1,05 ± 0,01;
p
= 0,011). Likevel ble ingen signifikante forskjeller mellom de to alleler sett på proteinnivå, og det er derfor lite sannsynlig at rs56182392 har en viktig innvirkning på
CHRNA5
funksjon.
CHRNB3
uORF gjør ikke påvirke protein uttrykk
5’UTR av denne subenheten (NM_000749.3) inneholder en enkelt antatt uORF. Det havner en SNP (rs4950 adenin /guanin) med den mindre allelet guanin å slette den første ATG startkodonet til det antatte uORF, og skaper en avkortet, antatt uORF (fig. 1). De tre konstrukter (
CHRNB3
-1;
CHRNB3
-2;
CHRNB3
-3) ble sammenlignet med hverandre ved luciferase assay (tabell 1 og S1). Det ble ikke observert signifikante forskjeller mellom de tre ulike varianter (
CHRNB3
-1 0,83 ± 0,17;
CHRNB3
-2 0,75 ± 0,02;
p
= 0,495;
CHRNB3
-1 0,83 ± 0,17;
CHRNB3
-3 0,92 ± 0,19;
p
= 0,778;
CHRNB3
-2 0,75 ± 0,02;
CHRNB3
-3 0,92 ± 0,19;
p
= 0,726). Dermed våre funn tyder på at verken lenger uORF heller avkortet uORF versjon spille en rolle i regulering av protein oversettelse (Fig. 3D).
Diskusjoner
De data som presenteres her sterkt at uORFs innenfor 5’UTR av
CHRNA4
-iso1 og
CHRNA5
er viktige regulatorer av protein oversettelse. Videre, de viser at de to kjente
CHRNA4
isoformer forskjellige med hensyn til deres effekt på genuttrykk nivå. Påvirkningen av
CHRNA4
-UTR på genekspresjon ble også tidligere rapportert av Briggs et al. De uttrykte ilder
CHRNA4 Hotell og
CHRNB2
sammen med /eller uten tilhørende UTR i oocytter. Interessant nok var utelukkende høy følsomhet og ingen lav-sensitivitet reseptor typen oppdaget når UTR var til stede. Imidlertid antatte regulatoriske UTR elementene ble ikke analysert i detalj i denne studien [23].
I forhold til den kortere isoform, tilstedeværelse av den lange 5’UTR av
CHRNA4
betydelig redusert luciferase-ekspresjon . Ingen av de fem uORFs som er tilstede i denne isoform viste noen effekt på genekspresjon når slått ut enkeltvis. Dette gjør det lite sannsynlig at de er ansvarlige for reduserte genuttrykk nivåer forbundet med lengre
CHRNA4
isoform. Vi kan ikke helt utelukke muligheten for at en samtidig dunke ut av alle fem uORFs ville ha hatt en effekt på genekspresjon, men tilstedeværelsen av andre undertrykkende regulatoriske sekvensmotiver eller RNA folding hendelser som enten destabilisere mRNA eller forsinke oversettelse synes å være minst like sannsynlige forklaringer.
Interessant, uORF funnet å være funksjonell i
CHRNA4
isoform med kortere 5’UTR er også til stede i det lange 5’UTR-isoform, men gjør ikke ser ut til å redusere genekspresjon i den sistnevnte sekvens sammenheng. Så vidt vi vet dette viser det første eksempelet på en uORF med isoform-spesifikk funksjonell relevans. Årsakene bak denne observasjonen er så langt ukjent. Våre forlengelses eksperimenter tyder på at ATG av den korte isoformen er i stand til å initiere translasjon av uORF. Men denne effekten var ganske lite, og resultatene var ikke signifikant. Derfor oversettelse av uORF protein kan bidra, men vil neppe være den viktigste årsaken til denne observasjonen. Det er også mulig at tilstrekkelig Kozak konsensussekvens [24] som omfatter uORF startkodon muliggjør tilstrekkelig ribosom-gjenkjennelse. Ribosom steiling har derfor betraktes som en alternativ mekanisme for effekter observert ved proteinnivå. Det kan bare spekulere på hvorfor det samme uORF syntes å være ikke-funksjonelle når analysert i det lange 5’UTR-
CHRNA4
isoform. En mulig årsak kan være tilstedeværelsen av ytterligere, så langt ukjente regulatoriske motiver som bare finnes i det lange 5’UTR-
CHRNA4
5’UTR og er i stand til å hemme uORF funksjon. Det har allerede blitt vist at den regulatoriske rolle i det minste noen uORFs kan være nært knyttet til andre 5’UTR sekvensmotiver [25]. Men uORF beskrevet i denne forrige rapport var bare funksjonell hvis ytterligere regulatoriske motivene var til stede.
CHRNA4
uORF diskutert her ville kreve det motsatte mekanismen, dvs. en undertrykkelse av sekvens motiver ukjent.
Når det gjelder enkelt uORF av
CHRNA5
, våre eksperimenter viste ingen klar indikasjon at uORF startkodon er i stand til å initiere translasjon av ildflue-genet klonet nedstrøms for den. Den mest sannsynlige forklaring på denne observasjonen ville være den lave styrke Kozak-sekvens som omgir uORF-ATG. Denne svake sekvens motiv er sannsynlig å redusere sannsynligheten for at ribosomer gjenkjenne uORF-ATG og initiere oversettelse på dette området. Men det faktum at vi ikke var i stand til å observere en betydelig forskjell i uttrykket nivåer mellom kontroll vektor og en konstruksjon der uORF startkodon fungert som den eneste fungerende oversettelse initiering hotellet (
CHRNA5
-6) gjør ikke nødvendigvis implisere at oversettelse av uORF er helt utelukket som en mulig mekanisme. Likevel, gitt imponerende virkning på protein ekspresjon i uORF viste i nærvær av sin egen intakt stoppkodon det er usannsynlig at denne sterke virkning resulterte utelukkende fra en svak oversettelse av uORF proteinet. Dette tyder på at, i motsetning til
CHRNA4
uORF beskrevet ovenfor,
CHRNA5
uORF er ikke en del av den gruppen av sekvensavhengig uORFs som oppnår sine effekter ved å kode små proteiner som spiller en aktiv rolle i translasjonelle kontrollmekanismer. Således andre mekanismer som må tas i betraktning, herunder steiling av ribosomer på uORF eller lekk skanning. Den drøye mekanisme oppstår når ribosomer slutter å bevege seg under uORF oversettelse [26]. Imidlertid, et startkodon som er i stand til å oppnå tilstrekkelig oversettelse er også usannsynlig å forårsake betydelig ribosom stalling. Leaky skanning synes å være en mer plausibel forklaring på de observerte effektene. Denne mekanismen skjer særlig hvis startkodonet av det uORF er omfattet av en dårlig startkodon sammenheng sekvens som er tilstede i den uORF av
CHRNA5
. Som et resultat av noen ribosomer gjenkjenne startkodonet av uORF og initiere, andre omgå den og sette i gang ved neste start-kodonet.
