Abstract
Ef reseptorene er den største familien av reseptor tyrosin kinaser. Sammen med deres ligander, de ephrins, oppfylle de flere biologiske funksjoner. Avvikende ekspresjon av Ephs /ephrins fører til økt Ef-reseptor for å Efrin ligand-forhold er en kritisk faktor i tumorgenese, noe som indikerer at tett regulering av Ef og Efrin uttrykk er avgjørende for normal celle oppførsel. Den 3′-ikke-translaterte regioner (3’UTRs) av transkripter spille en viktig ennå vidt lite verd rolle i kontrollen av proteinekspresjon. Basert på en forutsetning om at paralogues av store genfamiliene kan oppvise en konservert organisering av regulatoriske elementer i sine 3’UTRs vi brukt en roman bioinformatikk /molekylærbiologi tilnærming til 3’UTR sekvenser av Ef /Efrin transkripsjoner. Vi identifiserte klynger av motivene som består av cytoplasma polyadenylerings elementer (CPEs), AU-rik elementer (Ares) og Hur bindingssteder. Disse klyngene binde flere RNA-stabiliserende og destabiliserende faktorer, inkludert Hur. Overraskende, til tross for sin allment akseptert rollen som en mRNA-stabiliserende protein, vi viser videre at binding av Hur til disse klyngene faktisk destabiliserer Ef /Efrin transkripsjoner i tumorcellelinjer. Derfor knockdown av Hur modulerer sterkt uttrykk for flere Ephs /ephrins på både mRNA og proteinnivåer. Sammen våre studier tyder på at overekspresjon av Hur som finnes i mange progressive svulster kan være utløsende for uorden Ef reseptoren til Efrin ligand forhold som fører til en høyere grad av vev invasivitet
Citation:. Winter J, Roepcke S, Krause S , Müller EC, Otto A, Vingron M, et al. (2008) Comparative 3’UTR Analyse Lar Identifikasjon av Regulatoriske Clusters at Drive Ef /Efrin Expression in Cancer Cell Lines. PLoS ONE 3 (7): e2780. doi: 10,1371 /journal.pone.0002780
Redaktør: Thomas Preiss, Victor Chang Cardiac Research Institute, Australia
mottatt: 23 april 2008; Godkjent: 25 juni 2008; Publisert: 23.07.2008
Copyright: © 2008 Winter et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble finansiert av Deutsche Volkswagenstiftung og Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 577, prosjekt A6 til SS)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
3’untranslated regioner (3’UTRs) av mRNA spille viktige roller i posttranskripsjonelt regulering av genekspresjon, for eksempel ved å modulere mRNA lokalisering [1], [2], [3], stabilitet [4], og oversettelse [ ,,,0],5], [6]. Bortsett fra å ha bindingssteder for de nylig oppdagede microRNAs kan 3’UTRs havna motivene som samhandler med spesifikke RNA-bindende proteiner. Disse motivene er normalt kortsekvenselementer som aktivitet kan være påvirket av deres sekundærstruktur [7]. Derfor er deres identifisering av datamaskinalgoritmer vanskelig og vanligvis produserer mange falske positiver
For å identifisere 3’UTR motiver brukte vi en ny tilnærming som er basert på to forutsetninger:. Først, ikke bare koding regioner, men også elementer innenfor de 3’UTRs som er avgjørende for gen-funksjon kan bli bevart mellom paralogues av store genfamiliene; andre, mRNA som koder for proteiner som funksjonelt samhandler eller oppfyller redundante funksjoner kan fremvise et konservert organisering av regulatoriske elementer i sine 3’UTRs. For å undersøke dette, valgte vi familiene til Efrin ligander og Ef reseptorer. Familien av Ef-reseptorer er den største familien av reseptor-tyrosin-kinaser. Ef-reseptorer er delt opp i to underklasser basert på deres ligand spesifisiteter. Generelt, Ef klasse A (EphA) reseptorer bindes til glykosylfosfatidylinositol-forankret Efrin A-ligander (ephrinA) (med unntak av EphA4), mens Ef klasse B (EphB) reseptorer bindes til transmembran-domene-inneholdende Efrin B-ligander (ephrinB) [ ,,,0],8]. Men nyere data tyder på at interaksjoner kan også oppstå på tvers av klasser [9]. Ved binding til sine beslektet Efrin ligander, reseptorer Ef autophosphorylate og aktivere nedstrøms signalkaskader (forover signalering). Selv om de ikke har katalytisk aktivitet selv, begge klasser av Efrin ligander kan aktivere signaltransduksjonsveier etter samspill med Ef reseptorer (omvendt signalering) [10].
På cellenivå, signaliserer gjennom Ef reseptorer og ephrins leads til enten øket adhesjon (tiltrekning) eller redusert adhesjon (frastøtning) av samvirkende celler. Disse reaksjoner er viktige for å mediere en rekke biologiske aktiviteter, inkludert angiogenese, celle segregering, celleadhesjon, celle morfogenese, og cellemotilitet [11]. Flere av disse prosessene er ute av kontroll under tumorgenese, fremhever en potensiell viktig rolle for Ef /Efrin signalisering i utviklingen av mange humane kreftformer. I tråd med at patofysiologi, flere Ephs og ephrins, inkludert EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphB2, EphB3, og Efrin-A1 er overuttrykt i en rekke svulster og utstillings meste tumor-fremme egenskaper [11], [12 ].
Expression mønstre av Ephs og ephrins er komplekse, og deres riktige uttrykket er avgjørende for riktig funksjon av mange av de ovennevnte prosesser. Derfor ville en finjustert regulering av Ef /Efrin uttrykk både på transkripsjons og posttranskripsjonelt nivåer synes å være uunnværlig. På transkripsjonsnivået, har Ef reseptorer og ligander Efrin vært innblandet som nedstrøms mål for mange forskjellige transkripsjonsfaktorer, inkludert homeodomen-proteiner [13] og p53 protein familien [14], [15], [16], [17]. Mye mindre er kjent om posttranskripsjonelt regulering. Men det er bevis for involvering av 3’UTR. Oppregulering av den EphA2 reseptoren i aksoner som krysser midtlinjen er mediert av et sterkt konservert sekvens i transkriptet er 3’UTR som inneholder et cytoplasmatisk polyadenyleringssete element (CPE) [18]
Her har vi systematisk samlet 3’UTR sekvenser av mus Ef reseptorer og Efrin ligander og siktet dem for
cis
-acting sekvensmotiver. Vi har identifisert tre ulike typer motiver i flere av de Ef /Efrin 3’UTRs: CPEs, AU-rike elementer (Ares), og Hur bindingssteder. Mens noen av disse motivene ble funnet å bli distribuert tilsynelatende tilfeldig i de respektive 3’UTRs, andre ble funnet å være gruppert i klynger som er sterkt konservert mellom forskjellige arter virveldyr. Videre identifiserte vi flere RNA-bindende proteiner, inkludert Hur, som samhandler med disse klyngene, og vi viser at EfnA2, EphA2, og EphA4 er direkte posttranskripsjonelt mål av Hur i kreftcellelinjer. Overraskende, har vi funnet at Hur ikke opptrer som en stabiliserende faktor ved ekspresjon av disse Ef /ephrins, men at det destabiliserer de respektive meldinger.
Resultater
De 3’untranslated regioner av transkripsjoner av mus Ef reseptorer og Efrin ligander
for å få en komplett samling av full-lengde 3’UTR sekvenser av mRNA av Ef reseptorer og Efrin ligander, må vi først hentet alle tilgjengelige muse Ef /Efrin sekvenser fra GenBank database av NCBI. Bare polyadenylert transkripter ble ansett for å være full lengde, og bare en slik avkutting av varianter som inneholder både (i) en konsensussekvens heksamer nær spaltningssetet og (ii) en poly (A) hale ble inkludert i analysen. Ufullstendige transkripsjoner ble utvidet til poly (A) halen ved å samkjøre 3’complete EST data ved hjelp av programmet CAP3 (for deponeringsnummer se tabell S1). C-terminal avkortede isoformer ble ikke inkludert i studien.
Mens koding regioner og ekson /intron grensene [19] er høyt konservert mellom de ulike medlemmene av Ef reseptor og Efrin ligand genet familier, de 3’UTRs av transkripter viser en høy mangfold av lengde og sekvens: de av Efrin ligander som varierer fra 552 bp (EfnA4) til 3171 bp (EfnB2) og de av EPH-reseptorer fra 198 bp (EphB6) til 3310 bp (EphA4) (fig. 1, Tabell S1). Dessuten kunne vi ikke påvise noen vesentlig bevaring på sekvensen nivå, enten mellom 3’UTRs av Ef reseptor transkripsjoner eller de av Efrin ligander (data ikke vist).
Scheme av 3’UTRs av Ef /ephrins. Antatte
cis
-acting sekvensmotiver er uthevet i forskjellige farger, bevaring mellom menneske /mus, human /mus /Xenopus vises med stjerner /åpne sirkler.
ortologe bevaring mellom menneske og mus varierte fra 60% til 80%, noe som er sammenlignbart med genom-wide middelverdi på 69% [20].
Alternative polyadenyleringsseter ble funnet i 3’UTRs av EfnA4, EfnB2, EphA3, og EphA7 (fig. 1).
de 3’untranslated regioner av karakterutskrift for de Ef reseptorer og Efrin ligander inneholder svært konservert
cis
-acting sekvens motiver
Som beskrevet ovenfor, er sekvenser av Ef /Efrin 3’UTRs meget dårlig konservert mellom paralogues. Imidlertid posttranskripsjonelt regulering ofte er avhengig av kort
cis
-acting sekvensmotiver, og gener som koder for proteiner som vekselvirker funksjonelt og /eller gener som tilhører samme genfamilie kan antas å inneholde konserverte motiver 3’UTR. For å oppdage slike elementer vi skannet 3’UTRs muse Ef /Efrin transkripsjoner for kjente
cis
-acting sekvensmotiver (se https://genereg.molgen.mpg.de/cgi-bin/regEchse/regEchse.pl: motiver som er tatt med i søket er oppført under «velg kjent motiv, Hur bindingsseter ble identifisert ved hjelp av Transterm https://uther.otago.ac.nz/Transterm.html). Bemerkelsesverdig, dette førte til identifisering av tre fremstående motiver-CPEs, Ares og Hur bindingsseter i flere av de Ef /Efrin 3’UTRs (Fig. 1). CPEs er translasjonsforskning styreenheter som må ligge i umiddelbar nærhet til poly (A) området for å være funksjonell [21]. Derfor, i figur 1, bare de CPEs som oppfyller dette kriteriet [0-250 bp avstand fra poly (A) heksamer] er avbildet. Hur samhandler med flere AUUUA gjentar [22] og U-rike strekninger med høy affinitet. Mer nylig forsøk har blitt gjennomført for å mer spesifikt definere et Hur bindingssetet [23], [24]. I en serie av bindingsforsøk Meisner et al. dedusert at Hur bindingssetet er det 9-mer NNUUNNUUU. Bemerkelsesverdig motivet ble funnet å være til stede i alle validerte Hur mål, og et enkelt punkt mutasjon i motivet er tilstrekkelig til å fullstendig ødelegge Hur bindende. I denne studien jakten på Hur bindingsseter var basert på motivet. Både Ares og Hur bindingsseter ble funnet i alle deler av 3’UTRs. Noen av motivene ble funnet som isolerte, ikke-overlappende elementer. I andre tilfeller ble CPEs funnet å overlappe med Ares eller hur bindingsseter, eller Ares med Hur bindingssteder. Av notatet, alle tre typer motiver, noen i flere eksemplarer, ble funnet sammen i klynger (Fig. 1, Tabell S2). Disse klyngene viser to forskjellige lokaliseringsmønster: lokalisert hvor som helst i den 3’UTR med ingen åpenbare preferanse for en spesiell region (f.eks EphA3, se Fig. 1) eller spesifikt oppstilt i 3’terminal regionen av 3’UTR i umiddelbar nærhet til den polyadenyleringssete (f.eks EphA2, se fig. 1).
i ortologe 3’UTRs,
cis
-acting sekvenselementer med viktige tilsynsfunksjoner forventes å bli konservert gjennom evolusjonen [24] . For 18 av de 21 mus Ef /Efrin 3’UTRs undersøkt i denne studien, sekvenser fra menneskelige orthologues var tilgjengelig, og 44%, 74% og 72% av CPEs, Ares, og Hur bindingsseter henholdsvis ble funnet å være konservert mellom de to arter (fig. 1 og 2). Mest åpenbare, nesten alle av de motivene som stod i klynger er bevart. Foruten pattedyr, ortologe sekvenser av de 3’UTRs av EfnB2 og EphA2 fra lavere virveldyr
Xenopus laevis
er tilgjengelige. Igjen, særlig de motivene som er kledd i klynger og ligger i nærheten av poly (A) området ble funnet å være bevart i denne arten (Fig. 1 og 2).
Multialignments av representative eksempler på grupperte motiver som finnes i 3’terminal deler av EfnA1, EfnA4, EphA2 og EphA4 3’UTRs. Plassering av CPEs, Ares, Hur bindingssteder samt konsensus hexamer av polyadenyleringssignal er angitt under justeringer.
Identifisering av proteiner som binder seg til sekvensere motiver i EPH /Efrin 3’UTRs
på grunnlag av følgende kriterier ble 3’terminal deler av EfnA1, EphA2, og EphA4 3’UTRs valgt for videre karakterisering. Først, inneholder hvert grupperte sekvensmotiver som består av CPEs og Hur bindingssteder. EphA2 og EphA4, i tillegg inneholde Ares i disse klyngene. Derfor 3’terminal deler av disse 3’UTRs syntes å være gode kandidater for identifisering av proteiner i samspill med motivet klynger. For det andre, alle tre motiv klynger viser en høy grad av ortologe bevaring i menneskelig (Fig. 1). I tillegg er EphA2 klynge høyt konservert i
Xenopus laevis plakater (for EfnA1 og EphA4, ingen sekvens informasjon var tilgjengelig for denne arten). For det tredje har 3’terminal regionen i EphA2 3’UTR allerede vist seg å oppfylle viktige regulatoriske funksjoner [18].
For å teste for binding av samspill proteiner til disse motiv klynger, radioaktivt merkede transkripsjoner som omfatter tre «terminale regioner av EfnA1, EphA2, og EphA4 3’UTRs (fig. 3a) ble inkubert med lysat fra musehjerne og UV-tverrbundet. Musehjerne ble brukt i dette forsøket fordi flere kjente er- og CPE-samspill proteiner er høyt uttrykt i dette organet. Kompleksene ble løst ved elektroforese gjennom SDS akrylamidgeler, og de tørkede geler ble eksponert for røntgenfilm. Interessant nok er denne metoden ikke bare identifisert flere proteiner som var bundet til motiv klynger av alle tre 3’terminal regioner, men også avdekket en overlappende båndmønster (figur 3b.): Proteiner fra 30-45, 50 og 75 kD bundet til alle tre sekvenser, selv om affinitet til 3’terminal regioner av EphA2 og EphA4 3’UTRs virket meget høyere enn den for EfnA1 3’UTR. Proteiner av -60 og 70 kD var utelukkende påvises i EphA2 og EphA4 baner (Fig. 3b). Identiteten til samspill proteiner ble bestemt i en RNA-protein nedtrekk assay med påfølgende analyse av den eluerte fraksjon ved massespektrometri. Biotin-merket
i Anmeldelser –
vitro
-transcribed transkripsjoner svarer til 3’terminal regionen i EphA2 3’UTR ble inkubert med lysat fra musehjerne og dro ned med streptavidin magnetiske kuler. Transkripter i antisense orientering til den valgte regionen ble anvendt i en negativ kontrollforsøk. Kompleksene ble løst ved hjelp av SDS-PAGE, farget med kolloidal Coomassie, og båndene er spesielt anriket i prøven oppnådd med sense-transkripter ble analysert ved elektrospray ionisering (ESI) massespektrometri. Interessant, i tillegg til flere proteiner som er kjent for å være involvert i transkripsjon og mRNA-spleising myelin uttrykk faktor to (MyEF-2); heterogen kjernefysisk ribonucleoprotein M (hnRNP M); langt oppstrøms bindende protein 1 (FUSE-bindende protein 1, FBP); skjøting faktor, proline- og glutamin-rike (PSF) -vi identifisert AUF1 og KSRP, to ER-bindende proteiner (ARE-BPs) som er kjent regulatorer av mRNA stabilitet (Fig. 3c, tabell 1). For å bekrefte samspillet vi gjentok RNA-protein nedtrekk analysen. Denne gangen, derimot, RNA-proteinkomplekser ble overført til PVDF membraner og samspill proteiner ble påvist med spesifikke antistoffer. Som forventet, KSRP bundet til RNA-probe som svarer til den EphA2 3’UTR terminal region, men ikke til den antisense negativ kontroll (fig. 3d). Interessant, om AUF1, vi kan bare oppdage binding av P45 og P42 isoformer men ikke p40 og p37 isoformene. Foruten ARE og CPE-motiver, den 3’terminal del av EphA2 3’UTR havner en Hur bindingssete av konsensus NNUUNNUUU. Imidlertid Hur ble ikke identifisert som et samspill protein i massespektrometrianalyse. For å teste direkte for binding av Hur vi inkubert Western blot-membran med et antistoff rettet mot endogene hur protein. Som ventet ble Hur funnet å spesifikt samhandle med 3’terminal regionen i EphA2 3’UTR.
(A) Scheme av 3’UTRs av EfnA1, EphA2 og EphA4 som vist i fig. 1. Sonder brukes for UV-tverrbinding og RNA-protein pulldown analyser er angitt (B) UV-crosslink med protein lysat fra musehjerne og radioaktivt merkede prober som tilsvarer gruppert motiver stede i 3’terminal deler av EfnA1, EphA2 og EphA4 3 «UTR. (C) 10% SDS-gel farget med kolloidal Coomassie viser proteinene eluert fra streptavidin perler koblet til en biotinylert probe svarende til 3’terminal del av EphA2 3’UTR (venstre felt) eller til den respektive antisens-sekvens (høyre felt ). Differensielle bånd ble skåret ut og analysert ved hjelp av massespektrometri. Protein identiteter er gitt. (D) Western blot analyser av RNA-protein nedtrekk med protein lysatet fra musehjerne og biotinylerte prober som tilsvarer den 3’terminal del av EphA2 3’UTR (venstre felt) eller til den respektive antisens-sekvens (høyre felt). KSRP, AUF1, Hur og hnRNP A0 oppdages ved hjelp av spesifikke antistoffer. (E) Westernblot analyser av RNA-protein nedtrekk med protein lysatet fra musehjerne og biotinylerte prober svarende til 3’terminal delene av Ef /Efrin 3’UTRs eller til den EphA2 antisens sekvens. Hur og AUF1 oppdages ved hjelp av spesifikke antistoffer.
Basert på størrelse likheter med 30-45 kD, UV-kryssbinding analysen antydet binding av de samme proteinene til 3’terminal deler av EfnA1, EphA2, og EphA4 3’UTRs (fig. 3b). Dette kan tyde på at uttrykk for flere av Ef reseptorer og ephrins er regulert av en felles mekanisme. For å bevise at identiske proteiner binde til motivet klynger identifisert i flere Ef /Efrin 3’UTRs, utførte vi ekstra RNA-proteinpulldown analyser med
i Anmeldelser –
vitro
-transcribed og biotinylert 3 « terminal deler av alle Ef /Efrin 3’UTRs som inneholder Ares, CPEs og /eller hur bindingsseter (tabell 2). I tillegg har vi brukte 3′-terminale del av en Ef 3’UTR som ikke inneholder et slikt motiv (EphA1, den eneste motiv identifisert i 3’UTR av denne transkripsjon er en hur-bindingssete lokalisert utenfor den 3»-terminale delen ). Igjen ble kompleksene overført til PVDF-membraner, og disse ble inkubert med antistoffer detektering av 32 kD-proteinet Hur og fire AUF1 isoformene, p37, p40, p42 og p45, respektivt. Til vår overraskelse fant vi at både Hur og AUF1 p42 /p45 bundet til noen, men ikke alle transkripsjoner (fig 3e.), Og bindende mønstre av begge proteiner var bare delvis overlappende: både Hur og AUF1 samhandlet med 3 «terminal regioner av EfnA2, EfnB2, EphA2, EphA4, og EphA6 3’UTRs, men bare AUF1 bundet til det 3»-terminale regioner av EfnA1, EphA3, og EphB1 3’UTRs (fig. 3e). Ingen binding av enten AUF1 eller hur ble sett med 3 «terminal regionen EphA1, som ikke inneholder et motiv.
En nærmere titt på sammensetningen av de ulike 3’UTR terminal deler avdekket at AUF1 hadde bundet til alle er holdig transkripsjoner unntatt EphA7, men også til fire utskrifter som ikke inneholder en ARE (EfnA1, EfnB2, EphA6, EphB1). For binding av Hur nærvær av konsensus Hur bindingssetet var viktig, men ikke tilstrekkelig: vi ikke kunne oppdage binding av Hur til noen av vitnemål mangler dette nettstedet; Men av de åtte transkripsjoner inneholder dette nettstedet, Hur bundet til EfnA2, EfnB2, EphA2, EphA4, og EphA6 men ikke til EfnA1, EfnB3, og EphB1.
Fordi Hur binder til single-RNA, var det slås at Hur bindingssetet må kanskje anta en spesiell konformasjon å gjennomgå høy affinitet Hur bindende [24]. Derfor brukte vi Mfold program for å forutsi sekundærstrukturer i 3’UTR sonder som vi hadde brukt i RNA-protein nedtrekk analysen. Etter avtale med resultatene fra Meisner et al. (2004), fant vi at Hur hadde samhandlet bare med de karakterutskrifter hvor Hur bindingsseter ble anslått til å være lokalisert i enkelt-strandet sløyfer (Fig. 4a). De Hur bindingssteder for de gjenværende transkripsjoner var alle (i hvert fall delvis) ligger i dobbelt strandet regioner (Fig. 4b) og derfor muligens utilgjengelig for Hur.
Synlig er de sekundære strukturer av sondene som brukes i UV -crosslinking og RNA-proteinpulldown eksperimenter som tilsvarer de 3’terminal deler av Ef /Efrin 3’UTRs som spådd av Mfold. (A) prober med Hur bindingssteder som ligger i enkelt strandede regioner (stjernetegn) som viste høy affinitet binding av Hur. (B) prober hvor Hur bindingsseter ble spådd til å bli næret i doble strandede regioner.
Den sekundære strukturen i en relativt kort delvis transkripsjon kan være svært forskjellig fra strukturen av hele 3’UTR og derfor kanskje ikke nødvendigvis konformasjon
in vivo
. For å få innsikt i tilgjengeligheten av Hur bindingssteder næret i Ef /Efrin 3’UTRs vi brukte Mfold algoritme for å forutsi de sekundære strukturene i hele 3’UTRs. Interessant, bortsett fra EfnB3 og EphA1, alle murine Ef /Efrin 3’UTRs inneholde minst én Hur bindingssetet spådd til å bli en del av en enkelt-strandet region i eller utenfor de beskrevne motiv klynger, noe som tyder på en særlig viktig rolle Hur i regulering av Ef /Efrin uttrykk (fig. S1).
Hur regulerer uttrykket av Ef /ephrins i kreftcellelinjer
Unormal uttrykk for Ef /ephrins har blitt rapportert i ulike kreftformer, og er assosiert med dårlig prognose og avanserte stadier av malignitet [11], [25]. Mens mye innsats har blitt satt inn i klarlegging av transkripsjonsregulering av Ef /ephrins i kreftcellelinjer og kreft vev har posttranskripsjonelt regulering blitt neglisjert. Sytti-to prosent av de Hur bindingssteder av mus Ef /Efrin 3’UTRs er bevart i menneskelig (se ovenfor). For å teste om våre funn i museceller gjelder også for menneskeceller vi immunoutfelt Hur fra livmorhalskreft cellelinje HeLa og astrocytom /glioblastom cellelinje U373MG (Fig. 5a) ved hjelp av en anti-Hur antistoff, og utført RT-PCR på immunoutfelle med primere spesifikke for EfnA2, EphA2, og EphA4, som er tre mRNA som er kjent for å være sterkt uttrykt i forskjellige krefttyper [11]. Som negativ kontroll vi utførte samme fremgangsmåte med ikke-spesifikke immunglobuliner i stedet for anti-Hur antistoff (fig. 5a og b), og som negativ kontroll for RT-PCR vi utførte cDNA-syntesetrinn uten revers transkriptase (data ikke vist). Sammenlignet med den negative IgG kontroll, var det klart anriking av EfnA2, EphA2, og EphA4 meldinger i immunpresipitatene av begge cellelinjer (Fig. 5b) som indikerer at Hur hadde bundet til Ef /Efrin mRNA
in vivo
. Av notatet kan ikke-target-GAPDH-melding også bli forsterket, men mindre effektivt, og i samme grad i begge IP-grupper; dette funnet har blitt beskrevet før [23], og bekreftet bruk av like mengder innsatsmateriale.
(A) Immunpresipitasjon av endogen Hur. Jakten eller U373 cellelysater ble immunopresipitert med anti-Hur antistoff eller med uspesifikke IgG. Immunutfelninger ble lastet på 10% SDS-sider og analysert ved westernblot med anti-Hur antistoff; HC, tung kjede; LC, lett kjede (B) RT-PCR etter RNA-ekstraksjon fra Hur og IgG immunpresipitatene med primere spesifikke for EfnA2, EphA2, EphA4 og GAPDH.
I en videre rekke eksperimenter testet vi om Hur posttranscriptionally regulerer Ef /Efrin uttrykk. Vi banket ned Hur i HeLa og U373MG celler ved hjelp av to ulike Hur-spesifikke siRNA oligonukleotider (Fig. 6a og data ikke vist) og oppdaget EfnA2, EphA2, og EphA4 mRNA ved Real-Time RT-PCR 72 timer etter transfeksjon. Hur har blitt rapportert som en mRNA stabiliserende protein, noe som tyder på at det blir slått ned, ville føre til en reduksjon av Ef /Efrin mRNA uttrykk. Men mens mengden EphA2 mRNA gjorde nedgang etter knock-down av Hur, til vår overraskelse EfnA2 og EphA4 mRNA nivåer økt betydelig (Fig. 6a). For å teste om de observerte endringene i RNA nivå gjenspeiler situasjonen på proteinnivået vi lastet like mengder proteinlysatene fra HeLa og U373 celler etter Hur knock-down og utføres Western blot analyse med antistoffer detektere EphA2 og EphA4 (Fig. 6b) . I bekreftelse av Real-Time PCR eksperimenter fant vi at uttrykket av EphA2 protein ble drastisk redusert med 10-fold i HeLa og fem ganger i U373 celler etter knock-down av Hur, mens uttrykk for EphA4 ble økt med 1,2 ganger og to ganger, henholdsvis (fig. 6b). Kontroll siRNA oligonukleotider ikke ha en betydelig effekt på EphA2 eller EphA4 protein uttrykk i forhold til en mock-transfektert kontroll. Av notatet, den kommersielt tilgjengelige EphA4 antistoff som brukes i dette forsøket registrerer tre forskjellige band i HeLa celler (Fig. 6b), som alle ble oppregulert etter Hur knock-down. To av disse bandene kan tilsvare to forskjellige EphA4 isoformer med en størrelse forskjell på 37 aminosyrer som er oppført i Genome Browser. Det tredje bandet kan representere en HeLa-spesifikk isoform som ennå ikke er påvist i noen av de konvensjonelle databaser.
Hur ble slått ned med en bestemt Hur RNAi oligonukleotid i HeLa og U373 celler (A) mRNA uttrykk for EfnA2, EphA2 og EphA4 72 timer etter transfeksjon av en spesifikk hur RNAi oligo ble sammenlignet med transfeksjon av et ikke-tie kontroll oligo målt ved real time RT-PCR. Forholdet mellom uttrykk nivåer etter Hur knockdown og transfeksjon av ikke-Silencing kontroll oligonucleotodides vises. Verdiene ble normalisert til GAPDH. (B) Westernblot analyser av protein ekspresjon av EphA2, EphA4 (tre isoformer, se piler), Hur og GAPDH 72 timer etter knockdown Hur (øvre panel, spor 3) med spesifikke antistoffer i forhold til en mock-kontroll (kolonne 1) så vel som en ikke-tie siRNA kontroll (kolonne 2). Kvantifisering av band (Against GAPDH) ble utført ved hjelp av Image Quant programvare 5.2 (nedre panel). Brett økning eller reduksjon av uttrykk er avbildet.
For å skille mellom indirekte transkripsjons effekter og direkte mRNA stabilisering forårsaket av knock-down av Hur, blokkert vi transkripsjon med actinomycin D 48 timer etter transfeksjon av hur siRNA oligos eller styre oligonukleotider, og målte mRNA halveringstider på EfnA2, EphA2, og EphA4 av real-Time RT-PCR. Overraskende, fant vi at knock-down av Hur økte halveringstider på alle Ef /Efrin mRNA testet. Dette tyder på at Hur destabiliserer disse mRNA (fig. 7a), og at nedgangen i EphA2 melding oppdaget etter knock-down av Hur kan være forårsaket av sekundær hemming av EphA2 transkripsjon.
(A) 48 timer etter transfeksjon av en spesifikk hur RNAi oligonukleotid eller en kontroll oligonukleotid halveringstider på EfnA2, ble EphA2 og EphA4 mRNAer vurdert ved anvendelse av 5 ug /ml Actinomycin D; mRNA halveringstid ble målt med Real Time RT-PCR, mRNA uttrykk var normalisert til GAPDH. (B) 3’terminal deler av EfnA2, EphA2 og EphA4 3’UTRs ble klonet i pGL3 promotervektor og transfektert inn i HeLa celler. 30 timer etter transfeksjon ble cellene høstet og ildflue luciferase-aktiviteten ble målt. For normalisering en Renilla luciferase plasmid (PRL) var co-transfektert. (C) 24 timer etter transfeksjon av en spesifikk hur RNAi oligonukleotid HeLa-celler ble transfektert med pGL3 promotorkonstruksjoner som er beskrevet i (B), og 48 timer senere ildflue luciferase-aktiviteten ble målt og normalisert til den ko-transfektert PRL plasmid.
for ytterligere å bekrefte at de observerte effektene er mediert av
cis
-acting sekvenser næret i 3’terminal deler av EfnA2, EphA2, og EphA4 3’UTRs, pGL3P reporter plasmider bærer disse sekvenser (inkludert Hur bindingssetene) nedstrøms for ildflue luciferase cDNA ble transfektert inn i HeLa-celler. For normalisering, PRL vektor som inneholder
Renilla
luciferase cDNA ble kotransfektert. pGL3P konstruksjoner som inneholder EfnA2, EphA2 eller EphA4 3’terminal sekvenser produsert vesentlig mindre ildflue luciferase aktivitet enn pGL3P vektor uten 3’UTR innsatser, bekrefter en destabiliserende funksjon for 3’terminal deler av disse 3’UTRs (Fig. 7b). Etter knock-down av Hur med en bestemt RNAi oligo dette destabiliserende effekt kan være delvis reddet, noe som ytterligere antyder en destabiliserende funksjon for Hur protein (Fig. 7c). Knock-down av Hur med en RNAi oligo rettet mot en annen region av Hur mRNA viste sammenlignbare resultater (data ikke vist). Off-target effekter ble ekskludert ved transfeksjon en pGL3P vektor uten Hur bindingssteder.
Diskusjoner
I denne studien brukte vi en bioinformatikk /molekylærbiologi tilnærming å skjerme de 3’UTRs av transkripsjoner av Ef reseptorer og Efrin ligander for antatte
cis
-acting sekvensmotiver og å karakterisere sin biologiske funksjon.
Vi viser at flere av de Ef /Efrin 3’UTRs, men stiller betydelig divergens mellom paraloger i når det gjelder lengde og sekvens, inneholde evolusjonært konserverte motiv klynger består av overlappende CPEs, Ares, og Hur bindingssteder. Vi identifiserte Hur og flere andre proteiner involvert i mRNA stabilitetskontroll som interaksjonspartnere disse klyngene. Bytte fra mus til menneske kreft cellelinjer, også fikk vi bevis for at uttrykket av Ef /ephrins er posttranscriptionally regulert gjennom samspillet av de konserverte sekvens klynger og Hur, noe som tyder på en sammenheng mellom misregulation av Ef /Efrin uttrykk i kreft og overekspresjon av Hur.
de 3’untranslated regioner av transkripsjoner av mus Ef reseptorer og Efrin ligander
Et kjennetegn på medlemmer av Ef /Efrin familier er deres ekspansjon av tall i løpet av evolusjon, på grunn av flere duplisering hendelser [19]. De respektive kodende områder og ekson /intron grensene er høyt konservert blant orthologues og paralogues, noe som gjenspeiles av de overflødige funksjoner som Ef /ephrins kan oppfylle og av evnen Ef reseptorer til å samhandle med flere ephrins. Videre er 3’UTRs av Ef /Efrin orthologues sterkt konservert mellom menneske og mus (opptil 80%), noe som indikerer sterk seleksjonstrykk og kanskje bevaring av forskjellige uttrykk profiler. I kontrast til 3’UTRs av Ef /Efrin paralogues viser en høy grad av strukturelle avvik, som kan ha aktivert Ephs /ephrins å tilegne seg ulike uttrykk profiler (mobil eller subcellulære), som har blitt foreslått for andre konserverte paralogues [26].
