Abstract
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), en reseptor tyrosin kinase som fremmer cellevekst og overlevelse, er unormalt uttrykt i mange svulster epitelial opprinnelse, inkludert tykktarmskreft (CRC). EGFR-monoklonale antistoffer er vist å øke den midlere overlevelsestid og er godkjent for behandling av kolorektal cancer. Histone deacetylases (HDACs), ofte overuttrykt i tykktarmskreft og flere kreftformer, er en annen attraktive mål for kreftbehandling. Flere hemmere av HDACs (HDACi) er utviklet og viser kraftige antitumor evner. I denne studien, viste human kolorektal kreftceller behandlet med HDACi redusert EGFR-ekspresjon, og dermed forstyrret EGF-indusert ERK og Akt fosforylering. HDACi også redusert ekspresjon av SGLT1, en aktiv glukosetransportør funnet å være stabilisert av EGFR, og undertrykket glukoseopptak av kreftceller. HDACi trykt transkripsjon av EGFR og klasse I HDACs ble vist seg å være involvert i denne hendelsen. Chromatin immunpresipitasjonsanalyse viste at HDACi forårsaket dissosiasjon av SP1, HDAC3 og CBP fra EGFR promoter. Våre data antydet at HDACi kan tjene som monoterapi for å blokkere både EGFR og HDAC, og kan bringe flere fordeler til utvikling av CRC terapi
Citation. Chou CW, Wu MS, Huang WC, Chen CC ( 2011) HDAC Hemming Reduserer uttrykk av EGFR i tykktarmskreftceller. PLoS ONE 6 (3): e18087. doi: 10,1371 /journal.pone.0018087
Redaktør: Chris Chan, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 23 august 2010; Godkjent: 24 februar 2011; Publisert: 25 mars 2011
Copyright: © 2011 Chou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en forskningsstipend fra National Science Council of Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
EGFR (også kjent som ErbB-1 /HER1), som hører til ErbB-familien av reseptor-tyrosin-kinaser, omfatter et ekstracellulært ligand-bindende domene, et enkelt hydrofobt transmembrandomene og et cytoplasmatisk tyrosinkinase-domene innehold [1]. Ligandbinding induserer homo- eller hetero-dimerisering av reseptor og påfølgende aktivering av veier, inkludert Ras /Raf /MEK /ERK og PI3K /PDK1 /Akt [1]. De fleste av kolorektal kreft (CRC) er karakterisert med overekspresjon av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) og forutsies med høy risiko for metastaser og tilbakefall [2]. Målretting EGFR synes å være en lovende metode for CRC behandling. Faktisk, cetuximab, binder en human-muse-chimer lgG1-antistoff til det eksterne domene av EGFR, har blitt godkjent av FDA i 2004 for behandling av metastatisk kolorektal kreft [3]. Etter det, en fullt humanisert antistoff, panitumumab, er også godkjent for å behandle CRC [4]. Men samler bevis viser at effekten av målretting EGFR i kolorektal kreft er i stor grad begrenset på grunn av statusen for KRAS mutasjon [5]. KRAS mutanter omgå EGFR å aktivere de Ras /Raf /MEK /ERK-signaler, og i betydelig grad svekke den terapeutiske effekten av cetuximab [6]. Undersøkelse av KRAS status er nå en forutsetning for bruk av cetuximab [7]. Selv -60% av CRC pasienter uttrykte villtype KRAS, men bare halvparten av dem drar nytte av cetuximab. Derfor er det KRAS status ikke er den eneste bestemmende faktor for effektiviteten av EGFR-target terapi [8]. Derfor er behandling med et bredt spekter av genetiske bakgrunn presserende behov og vil dra nytte de fleste pasienter irresponsive til cetuximab-basert terapi.
Selv om EGFR er en reseptor tyrosin kinase og leverer signaler etter ligand konjugering, kan dens prosurvival effekten være uavhengig å kinase aktivitet. For eksempel mus som mangler EGFR er i sin spede dødelig, men de skjuler kinase-inaktive mutanter bare oppvise noen epiteldefekter [9], [10]. I tillegg er tap av EGFR kinase-aktivitet bremses celle proliferaiton men tap av dets ekspresjon ødelegger glukoseopptak og fører til celledød [11] – [13]. Derfor kan hemming av EGFR uttrykk være en bedre strategi for CRC terapi.
Histone deacetylases (HDACs) som fjerner acetyl grupper fra histone å slå av gentranskripsjon er sterkt uttrykt i ulike tumorer [14], [15 ]. HDACs har blitt en av de nye målene for kreftbehandling, og HDAC hemmere (HDACi) viser lovende kreft aktiviteter [15]. Blant ulike HDACi hadde Saha (Vorinostat) blitt godkjent for behandling av kutan T-celle lymfom (CTCL). HDAC familie kan inndeles i fire klasser, og den klasse I HDACs, som omfatter HDAC1, HDAC2, HDAC3 og HDAC8, har blitt rapportert å være sterkt uttrykt i tykktarmskreft [16]. Den pro-proliferative effekter av HDACs er koblet til den transkripsjonelle undertrykkelse av CDK-inhibitor, P21, og knockdown av HDAC 1, 2 og 3 redusert veksten av flere tykktarmskreftceller [17]. Derfor kan HDAC tjene som et potensielt mål for CRC terapi, og Saha hadde gått inn i kliniske forsøk for behandling av CRC [18].
I denne studien viste vi at EGF-signalisering i KRAS mutant cellelinjer HCT116 og SW480, ble avbrutt av HDACi gjennom transkripsjonen undertrykkelse av EGFR uttrykk, noe som indikerer at HDACi fungerte som monoterapi for å blokkere EGFR og HDAC samtidig. Tap av EGFR delvis bidrar til den cytotoksiske effekten av HDAC-inhibitorer. I tillegg ble ekspresjon av SGLT1, en aktiv glukosetransportør som er stabilisert med EGFR, også redusert med HDACi og førte til reduksjon av glukoseopptak i tykktarmskreftceller. Mekanismen bak transkripsjons undertrykkelse av EGFR av HDACi var involvert med histoner hypoacetylation og dissosiasjon av SP1, HDAC3 og CBP fra EGFR promoter. Våre data antydet at HDACi kan tjene som et enkelt middel til samtidig blokkere både EGFR og HDAC, og kan gi fordeler for CRC pasienter med et bredere spekter av genetiske bakgrunn.
Materialer og metoder
etikk Uttalelse
Alle pasient-avledet prøver ble samlet inn og arkivert i henhold til protokoller godkjent av Institutional Divisjonsstyret for National Taiwan University Hospital og støttet av National Science Council, Taiwan. En full verbal forklaring av studien ble gitt til alle deltakere. De samtykket til å delta på frivillig basis.
Material
TSA ble kjøpt fra Sigma og Saha ble innhentet fra Merck. Myc-merket HDAC1, 2 og 3 ble gitt av Dr. WM Yang (Nchu, Taiwan). Antistoffer spesifikke for EGFR, p21, HDAC3, og aktin ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. Anti-Ac-histon H3, H4, og SP1 antistoffer ble oppnådd fra Upstate. Anti-SGLT1 antistoff ble kjøpt fra Abcam.
Cell kultur
HCT-116 (fra Van Dyke MW, MD Anderson) og SW480 (fra TH Leu, NCKU) humane tykktarmkreft celler ble dyrket i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum; A431 (human epidermoide karsinom celler) og MDA-MB-468 (human bryst adenokarsinomceller) oppnådd fra ATCC ble holdt i RPMI supplert med 10% FCS.
RNA isolering, RT-PCR og sanntids-PCR
Total RNA ble isolert fra HCT116 celle hjelp Trizol reagens (Livet Technology). Revers transkripsjonsreaksjon ble utført ved bruk av 2 pg av total RNA, revers transkribert til cDNA ved anvendelse av oligo dT-primer. cDNA ble underkastet RT-PCR-amplifisert og 30 sykluser ved hjelp av to oligonukleotidprimere avledet fra publiserte EGFR eller GAPDH-sekvens, herunder 5′-TGGAGCTACGGGGTGACCGT-3 «og 5′-GGTTCAGAGGCTGATTGTGAT-3′ (EGFR), 5»-AAGCCCATCACCATCTTC-CAG- 3 «og 5′-AGGGGCCATCCACA-GTCTTCT-3′ (GAPDH) og 5»-TGAC-GGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3 «og 5′-CTAGAAGCATTTGCG-GGGACGATGGAGGG-3′ (Actin). PCR-produktene ble utsatt for 1.2% agarosegel elektroforese og visualisert ved hjelp av etidiumbromidfarging. Real time PCR ble utført med cDNA prøvene ved hjelp av ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, California). Primere var som følger: EGFR (forover-primer, 5»-TTCCTCCCAGTGCCTGAAT-3 «revers primer, 5′-GGTTCAGAGGCTGAT-TGTGAT-3′); Actin (forover-primer, 5»-CCAACCG-CGAGAAGATGA-3 «, revers primer, 5′-TCCATCACGATGCCAGTG-3»). Dataene ble normalisert ved Actin husholdningsgenet deteksjon.
Celleproliferasjon
For vekstinhibering analyse, HCT116-celler ble sådd ut ved en tetthet på 3 x 10
3-celler per brønn i 96 -vel platene. Etter poding ble vekstmediet erstattet med medium inneholdende indikerte konsentrasjon av TSA. Etter 3 dager ble cellevekst målt ved bruk av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (Sigma, St. Louis, MO) kolorimetrisk metode. Cellesyklusen ble bestemt ved flowcytometri ved hjelp av en propidiumjodid flekk buffer og analysert på en BD FACS Calibur cytometer med Cellquest programvare.
Måling av intracellulær glukose
Før høsting, tilhenger kulturer av kontroll og TSA-behandlede celler i DMEM inneholdende 1 eller 4,5 mg /ml glukose ble vasket to ganger med kald fosfatbufret saltløsning (PBS), og deretter lysert med ione-Freeh
2O i 5 min på is. Glukoseinnholdet ble målt med D-glukosemålesett (GAHK-20, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ifølge produsentens protokoll.
Transient transfeksjon og luciferase aktivitetsanalyse
EGFR promoter plasmid som inneholder en ildflue luciferase ble transient transfektert inn HCT116-celler med arrestin transfeksjon reagens. I korte trekk ble 0,9 ug av plasmid-DNA, 0,1 ug av Renilla luciferase, og 5 ul transfeksjon reagenser blandet, og den transfeksjon protokollen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Promega). Seks timer etter transfeksjon, ble cellene dyrket i normal komplett medium i ytterligere 16 timer. Deretter ble de transfekterte cellene utsettes for luciferase-assay. Firefly luciferase aktiviteten ble normalisert til den av Renilla luciferase.
Utarbeidelse og infeksjon av shHDAC-uttrykke lentivirus
Kort, 6 mikrogram pCMV-dR8.91, 3 ug pMD2.G, og 9 mikrogram pLKO-shLuciferase, pLKO-shHDAC1, pLKO-shHDAC2 eller pLKO-shHDAC3 ble kotransfektert inn HEK293T celler ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Supernatantene som inneholdt infeksiøs shLuciferase, ble shHDAC1, shHDAC2 eller shHDAC3 lentivirus oppsamlet på dag 3 etter transfeksjon og lagret ved -80 ° C. For lentivirus infeksjon, 2 × 10
5 HCT116-celler ble infisert med shLuciferase, shHDAC1, shHDAC2 eller shHDAC3 lentivirus på et mangfold av infeksjon (MOI) på 1.
Pasienter og prøve forberedelse
Prøver av tumorvev og tilstøtende normalt vev av kolon ble oppnådd fra 14 pasienter som har blitt patologisk diagnostisert kreft i tykktarmen og gjennomgikk kirurgisk reseksjon ved National Taiwan University Hospital. Vevsprøver ble malt, deretter sonikert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, 5% Triton X-100) med proteasehemmere. Prøvene ble mikrosentrifugert for å fjerne større rusk og utsatt for Western-analyse.
Chromatin immunoutfelling assay
Celler ble behandlet med 5 uM Saha i 6 timer og tverrbundet med 1,42% formaldehyd i 15 min. Celler i to 10 cm skåler ble skrapet i 1 ml kald PBS, sentrifugert og lysert i 1 ml med IP-buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40 og 1% Triton X-100) inneholdende proteaseinhibitorer (1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 1 uM leupeptin og 1 mM aprotinin). Den nukleære pellet ble resuspendert i IP-buffer og ultralydbehandlet for å skjære kromatin. De ultralydLysaTene ble immunoprecipited med antistoffer mot SP1, AcH3, AcH4, H3K4Me2, CBP og HDAC3 henholdsvis og immunkompleksene ble utvunnet med protein A-Sepharose (Roche). Den immunopresipitert DNA og inngangs DNA ble ekstrahert ved inkubering med 100 ul 10% Chelex (Bio-Rad), koking for å reversere tverrbinde, og sentrifugering for å fjerne Chelex slurry. Real-time PCR ble utført med den rensede DNA ved hjelp av følgende primere: A: 5’GTGAAAAACCCCACCGTTC-3 «og 5’TCTGAAGGGGAGCAACCTTA-3′; B: 5»-AAGCTTCCGCGAGTTTCC-3 «og 5′- GAGGCTAAGTGTCCCACTGC-3′; C: 5»- ACCCTGGCACAGATTTGG-3 «og 5′- TGAGGAGTTAATTTCCGAGAGG-3′; D: 5»-CCAGTATTGATCGGGAGAGC-3 «og 5′- TTCCTCCAGAGCCCGACT-3′; E:. 5»-CTGAGGAAGGAACCCAAAAA-3 «og 5′-GGGAGGTCCTCTCAGAA AGC-3»
Statistisk analyse
Triplikat eksperimenter ble utført og resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SE. De to-tailed Student t test ble brukt for å beregne statistisk signifikans mellom gruppe
Resultater
HDAC hemmere forstyrre EGF signaliserer via stanse EGF reseptor (EGFR) uttrykk
Å undersøke antitumoreffekt av HDACi i tykktarmskreft, KRAS villtype (WiDr og HT29) og KRAS mutante celler (HCT116 og SW480) ble behandlet med Saha eller cetuximab i 48 timer, og cellenes levedyktighet ble målt. Saha redusert overlevelse av disse cellene på en dose-avhengig måte (Fig. 1A), noe som tyder uavhengighet KRAS status på antitumoraktivitet av HDACi. I motsetning til dette, cetuximab hadde liten virkning på cellenes levedyktighet (fig. 1A). Dette resultatet er i overensstemmelse med den tidligere undersøkelse som kolorektal kreftceller behandlet med cetuximab ble drept mer effektivt ved antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) som er fraværende i
in vitro
system [19]. Siden EGFR spiller en betydelig rolle i CRC, til evnen til sin ligand utløse den nedstrøms signal i KRAS mutante celler ble undersøkt. EGF utløst både Akt og ERK-fosforylering i HCT116-celler og indusert ERK-aktivering i SW480 celler (fig. 1B), noe som indikerer at KRAS mutasjon ikke fullt ut overtar den ligand-mediert ERK-aktivering og også impling betydningen av EGFR i KRAS mutante celler . Dessuten, forbehandling med HDAC-inhibitorer, TSA og Saha forstyrret den EGF-stimulerte ERK og Akt-fosforylering i HCT116-celler og ERK-fosforylering i SW480-celler (fig. 1C). Siden HDAC hemmere sperret begge Akt og ERK phosphorylations, kanskje den aller proksimale del av EGF signale bli målrettet av HDACi. Derfor er ekspresjonen av EGF-reseptoren ble først undersøkt. Etter behandling med TSA, ble ekspresjon av EGFR redusert i HCT116, SW480, og HT29-celler. For å finne ut om dette er et vanlig fenomen, ble cellene stammer fra ulike organer som brukes. Etter behandling med TSA ble redusert EGFR uttrykk også sett i menneskelig hud (A431) og bryst (MDA-MB468) kreftceller (Fig.1D).
(A) HCT116, SW480, WiDr og HT29 celler ble opprettholdt i DMEM med 1 mg /ml glukose og behandlet med 0,1, 1, 10 ug /ml cetuximab eller 1, 3, 5 uM Saha celle overlevelse ble målt ved MTT-analyse etter 48 timers behandling (B) HCT116 og SW480-celler ble serum-sultet i 24 timer og deretter stimulert med 1 pM EGF i, 1, 5, 15, 30 og 60 minutter. (C) HCT116 og SW480-celler ble pre-inkubert med 0,5, 1 pM TSA eller 5 uM Saha i 24 timer og deretter stimulert med EGF i 5 minutter. (D) HCT116, SW480, A431 og MDA-MB468-celler ble behandlet med 1 pM TSA i 24 eller 36 timer Antall cellelysat ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse med antistoffer som er spesifikke for fosfo-Akt, fosfor-ERK, Akt og Erk .
HDAC-inhibitorer redusere ekspresjonen av SGLT1 og redusere den intracellulære glukose
i tillegg til EGF-signalering, er EGFR blitt rapportert å være involvert i glukosetransport ved å assosiere og stabilisere aktiv glukosetransportør, SGLT1 [13], [20]. Etter ekspresjon av EGFR ble redusert med HDACi i CRC-celler, ble nivåene av SGLT1 ekspresjon og intracellulær glukose i respons til HDACi også undersøkt. Som forventet, TSA redusert SGLT1 uttrykket (Fig.2A) og det intracellulære glukosekonsentrasjonen (fig. 2B). Glukose fylling beholdt den intracellulære glukose (fig. 2C) og reddet celler fra TSA-indusert celledød (fig. 2D). Disse data antydet at tapet av EGFR og dens partner, SGLT1, kan være involvert i den cytotoksiske effekt av HDAC-inhibitorer.
(A) HCT116 celler ble behandlet med 1 pM TSA for 24, 36 eller 48 timer. Hele cellelysat ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse med antistoffer som er spesifikke for SGLT1, EGFR og aktin. (B) Cellene ble dyrket i DMEM med 1 mg /ml, og behandlet med 1 pM TSA i 24 timer. Glukoseinnholdet ble målt som beskrevet i materiale og fremgangsmåte (Triplikatprøver ble anvendt i hver gruppe i stjerne indikerer en signifikant forskjell med p … 0.05 Feilstolper angir gjennomsnitt ± SE) (c) Cellene ble dyrket i DMEM med 1 mg /ml eller 4,5 mg /ml glukose og behandlet med 1, 3 eller 5 mM TSA i 24 timer. Glukoseinnholdet ble målt. (D) Cellene ble dyrket i DMEM med 1 mg /ml glukose og behandlet med 1 eller 3 uM TSA. Etter 24 eller 48 timer etter behandling, ble glukose justert til 4,5 mg /ml. Celleoverlevelse ble målt ved MTT-analyse etter 72 timers behandling med TSA. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SE av tre uavhengige eksperimenter utført in triplo.
Tap av EGFR er implisert i HDAC-inhibitor-mediert cytotoksisitet
HDAC-inhibitorer er vist å utøve en antitumoraktivitet etter stanse cellesyklus og å utløse apoptose [15]. Konsekvent, økt Saha sub-G1 befolkningen fra 7,72% til 17,23% og G2 /M befolkningen fra 16,6% til 24,4% (Fig.3A). For å klargjøre rollen av EGFR i antitumoraktivitet av HDACi, ble celler transfektert med myc-EGFR og deretter behandlet med Saha i 24 timer. Overekspresjon av myc-merket EGFR redusert sub-G1 befolkningen og G2 /M befolkningen (Fig.3A). Saha-indusert p21 uttrykk ble også dempet av ektopisk uttrykk av EGFR (Fig.3B). Disse data indikerte at Saha-EGFR redusert ekspresjon bidratt til Saha-indusert apoptose og cellesyklus-stans.
(A) HCT116-celler ble transfektert med Myc-EGFR så vel som dens vektorkontroll, og transfekterte celler ble behandlet med 5 uM Saha i 24 timer. Celler ble fiksert med 70% etanol og farget med propidiumjodid, og fraksjonen av cellesyklusen ble analysert ved flow-cytometer. (B) HCT116-celler ble transfektert med Myc-EGFR så vel som dens vektorkontroll, og de transfekterte celler ble behandlet med 5 uM Saha i 24 timer. Hele cellelysat ble fremstilt og underkastet Western blot ved hjelp av Ab spesifikk for EGFR, Myc, P21 og tubulin.
HDACs er involvert i transkripsjon av EGFR
Siden mengden av EGFR protein blir redusert etter behandling med HDACi ble EGFR gentranskripsjon undersøkt. MRNA nivået av EGFR ble sunket dramatisk etter behandling med TSA og Saha (Fig.4A), noe som tyder HDACi transcriptionally downregulate EGFR uttrykk. Denne effekten ble ytterligere bekreftet ved EGFR-reporter-analyser. Vår Resultatet viste at TSA og Saha betydelig redusert EGFR promoter aktivitet (Fig.4B øvre panel). Det har blitt rapportert at HDACi redusert EGFR-mRNA-stabilitet i ER-negative humane brystcancerceller [21]. Derfor ble stabiliteten av EGFR mRNA undersøkt.
de novo
transkripsjon ble stoppet av actinomycin D og EGFR mRNA ble målt ved real-time PCR. Skråningen av EGFR mRNA degradering viste ingen signifikant forskjell mellom basal og TSA behandling (Fig. 4B nedre panel), noe som tyder på at HDACi ikke påvirker nedbrytningen av EGFR mRNA i kolorektal kreftceller. For ytterligere å belyse involvering av HDACs i transkripsjonen av EGFR, myc-merket HDAC1, HDAC2 eller HDAC3 ble ectopically uttrykt i HCT116-celler, og EGFR mRNA ble målt ved hjelp av RT-PCR. En økning av EGFR mRNA ble funnet i alle disse HDAC-uttrykkende celler (Fig. 4C øvre panel). Motsatt, knockdown av HDAC1, HDAC2 eller HDAC3 av shRNA redusert uttrykk av EGFR protein (Fig.4C nedre panel). Disse data indikerte at klassen jeg HDACs er avgjørende for EGFR uttrykk. Den positive korrelasjon mellom EGFR og HDAC3 ekspresjon ble også observert i fjorten par av human colon tumor og tilstøtende normale vev (fig. 4D).
(A) HCT116 celler ble behandlet med 1 pM TSA eller 5 uM for Saha 1 og 8 timer. Total RNA (2 mikrogram) ble benyttet for RT-PCR og Real-time PCR som beskrevet. (B, øvre panel) Cellene ble behandlet med 1 mikrometer TSA eller fem mikrometer Saha for 6 timer, deretter tilført med EGFR-Luc. Luciferasepreparater aktiviteter ble målt som beskrevet under «Materiale og metode». (B, nedre panel) Celler ble behandlet med 1 pM TSA i 4 timer før RNA-syntese ble stanset ved Actinomycin D (5 ug /ml) i 0, 2, 4 eller 6 timer. RNA ble fremstilt ved angitte tidspunkter etter tilsetning av actinomycin D og nivåer av EGFR mRNA ble målt ved hjelp av sanntids-PCR. (C, øvre panel) Cellene ble transient transfektert med Myc-tagged HDAC1, 2 eller 3, henholdsvis og total RNA (2 pg) ble brukt for RT-PCR for å påvise EGFR-mRNA-nivå. (C, nedre panel) Cellene ble transfektert med shLuc, shHDAC1, shHDAC2 eller shHDAC3 av lentivirus som beskrevet under «Materiale og metode». Cellelysater ble høstet på dag 5 etter transfeksjon og deretter underkastet Western blot-analyse med antistoffer som er spesifikke for EGFR, HDAC1, HDAC2 og HDAC3. (D) Lysates over sammenkoblede humane normale og maligne kolon vev ble utsatt for western blotting ved hjelp av anti-EGFR, anti-HDAC3 og anti-Actin antistoffer. Korrelasjonen mellom EGFR og HDAC3 uttrykk nivåer ble evaluert av korrelasjonskoeffisienter.
SP1 er avgjørende for EGFR transkripsjon og HDAC hemmer forstyrrer bindingen av SP1 til EGFR arrangøren
Det er flere SP1 bindingsseter på EGFR arrangører og våre tidligere studier viste at HDACi påvirker bindingen av SP1 til ADAMTS1or p21 arrangører [22], [23]. Derfor kan SP1 delta i HDACs-mediert EGFR-ekspresjon. Faktisk, hemming av SP1 av mitramycin A (MTM) og siRNA betydelig redusert EGFR-ekspresjon (Fig.5A). Videre MTM drastisk redusert EGFR promoter aktivitet (Fig.5B), noe som indikerer den kritiske rollen SP1 i EGFR-genet transkripsjon. Bindingen av SP1 til EGFR arrangøren er videre undersøkt av kromatin immunoprecipitation (chip). Fem primerpar (A, B, C, D og E) ble utviklet for å jevnt dekke regionene (-1200 til 1000 bps) rundt transkripsjon start hotellet (Fig.6A). Våre data viser at bindingen av SP1 til områdene C og D ble signifikant redusert etter behandling med Saha (Fig.6B). Videre acetylering av Histone H3 og H4 på EGFR-promoteren var i stor grad redusert, særlig i områder i nærheten av transkripsjonsstartsetet (Fig.6B). Statusen for histone metylering som H3K4Me2, H3K9Me3 og H3K27Me3 ble også undersøkt. Saha ikke endre residensen til disse metylering markører på EGFR arrangøren tross av anriket H3K4Me2 ble funnet (Fig.6B og data ikke vist). Siden acetylering av histon H3 og H4 falt dramatisk etter HDAC hemning, belegg av histon acetyltransferase (HAT) eller HDAC på EGFR arrangøren undersøkt. Vårt resultat viser at rekrutteringen av CBP til region D ble betydelig redusert med Saha (Fig.6B). Interessant, bindingen av HDAC3 til området D ble svekket, også (Fig.6B). Disse data viste dissosiasjon fra SP1, CBP og HDAC3 fra EGFR promotor samtidig (figur 7), noe som tyder på at disse proteinene kan påvirke hverandre og påvirke deres binding til EGFR-promoteren.
(A) celler ble behandlet med 1 pM mitramycin A (MTM) i 18 eller 36 timer, da den totale cellelysat ble fremstilt. Celler ble transfektert med 0, 400 eller 800 pmol SP1 siRNA, og de totale cellelysatene ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse med antistoffer som er spesifikke for EGFR og SP1. (B) Celler ble transfektert med EGFR-Luc og deretter behandlet med 0,1, 1 eller 5 uM mitramycin A (MTM) i 16 timer. Luciferasepreparater aktiviteter ble målt som beskrevet under «Materiale og metode». Resultatene ble normalisert til den Renilla luciferase-aktivitet og uttrykt som gjennomsnitt ± SE. For tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer.
(A) Illustrasjon av EGFR arrangøren og chip primer. (B) Celler ble behandlet med Saha i 8 timer, deretter fast, sonikert og utsatt for Chromatin Immunoutfelling ved hjelp av Ab spesifikk mot SP1 og acetylert histon H3. Histone H4 acetylering H3K4 dimetylering, CBP og HDAC3 på EGFR arrangøren ble målt ved chip analyser som beskrevet under «Materiale og metode».
I basal staten, HDAC3, CBP og SP1 ble begge rekruttert til promoter region og som er ansvarlig for transkripsjon av EGFR (A).
