Abstract
Bakgrunn
programmert celledød 4 (PDCD4), opprinnelig identifisert som neoplastisk transformasjon inhibitor, ble svekket i ulike krefttyper. Vår tidligere studie vist en kontinuerlig nedregulering av PDCD4 uttrykk i sekvensen av normal-borderline-maligne ovarian vevsprøver og en signifikant korrelasjon av PDCD4 uttrykk med sykdomsfri overlevelse. Målet med denne studien var å undersøke ytterligere funksjon og modulering av PDCD4 i eggstokkreft celler.
hovedfunnene
Vi viste at ektopisk PDCD4 uttrykk betydelig hemmet celleproliferasjon ved å indusere cellesyklus arrest ved G
en scene og opp-regulering av cellesyklus inhibitorer av p27 og p21. Celle migrasjon og invasjon ble også hemmet av PDCD4. PDCD4 over-uttrykke celler viste forhøyet fosfatase og tensin homolog (PTEN) og hemmet protein kinase B (p-Akt). I tillegg ble ekspresjon av PDCD4 oppregulert og det ble eksportert til cytoplasma på serum uttak behandling, men det ble raskt oppbrukt via proteasomal nedbrytning ved serum gjen administrering. Behandling av en fosfoinositid 3-kinase (PI3K) inhibitor hindret nedbrytningen av PDCD4, noe som indikerer involveringen av PI3K-Akt bane i modulering av PDCD4.
Konklusjon
PDCD4 kan spille en kritisk funksjon i stoppecellesyklusutvikling ved nøkkel sjekkpunktet, og dermed hemme celleproliferasjon, så vel som å undertrykke tumormetastase. Den PI3K-Akt veien var underforstått å være involvert i reguleringen av PDCD4 nedbrytning i eggstokkreft celler. Som svar på stress tilstand, endogene PDCD4 var i stand til å shuttle mellom cellekamre til å utføre sine viderekoblet funksjoner
Citation. Wei N, Liu SS, Chan KKL, Ngan HYS (2012) Tumor undertrykkende funksjon og Modulation av programmert celledød 4 (PDCD4) i eggstokkreft. PLoS ONE 7 (1): e30311. doi: 10,1371 /journal.pone.0030311
Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Storbritannia
mottatt: 12. mai 2011; Godkjent: 13 desember 2011; Publisert: 17 januar 2012
Copyright: © 2012 Wei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en intern stipend fra University of Hong Kong Seed Funding Programme for grunnforskning [til KKLC], og av en donasjon fra Wong Sjekk Hun Charitable Foundation [til HYSN]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
PDCD4 ble opprinnelig identifisert som neoplasmic transformasjon inhibitoren i JB6 mus epidermal cellelinje-modell [1]. PDCD4 transgene mus viste lavere tumorforekomst og papilloma-til-karsinom omdannelse frekvens [2]. Senere rapporter har antydet PDCD4 er hemmende rolle på protein oversettelse gjennom hemming av eukaryote initiering faktor 4A (eIF4A) helicase, samt forstyrre foreningen av eIF4A med eIF4G, noe som resulterer i svikt i dannelsen av oversettelses initieringskomplekset [3], [4 ], [5]. Siden den gang har flere studier blitt gjennomført for å undersøke hvilken rolle PDCD4 under tumorgenesen. PDCD4 ble funnet å være i stand til å regulere transkripsjonen. Over-ekspresjon av PDCD4 resulterte i undertrykkes karsinoid celleproliferasjon gjennom undertrykker transkripsjonen av mitose-fremmende faktor cyklin-avhengig kinase (CDK) 1 /cdc2 via inntil regulering av p21
Waf1 /Cip1 [6], [7]. PDCD4 hemmet tykktarmskreftcelle invasjon gjennom undertrykke mitogen-aktivert protein kinase kinase kinase kinase 1 (MAP4K1), som fører til undertrykket AP-1-avhengig transkripsjon [8]. Rollen til PDCD4 i celle apoptose er også blitt undersøkt i forskjellige studier. PDCD4 ble foreslått å være et molekyl som er involvert i proapoptotiske transformerende vekstfaktor beta-1 (TGF-beta 1) induserte apoptose i hepatocellulær karsinom (HCC) [9]. Redusert PDCD4 uttrykk deregulert den normale DNA-skade respons, og dermed hindrer DNA-skadede celler fra gjennomgår apoptose [10].
Til tross for de tumorsuppressorgener egenskaper som er nevnt ovenfor, er rollen til PDCD4 i tumorprogresjon har blitt foreslått å være celletype spesifikk [11]. Over-ekspresjon av PDCD4 hadde ingen effekt på enten proliferasjon eller apoptose i HEK293-celler [12], så vel som i RKO tykktarmskreftceller [8]. Tidligere studier rapporterte den utarmede PDCD4 ekspresjon i kreft sammenlignet med normalt vev [13], [14], [15], og PDCD4 ble målrettet til nedbrytning i løpet av tumorvekst [16], men mekanismene for modulering av PDCD4 var ikke klart ennå.
de undersøkelser på rollen PDCD4 i eggstokkreft kreft var ganske begrenset. Ifølge våre tidligere funn, ble tapet av PDCD4 uttrykk funnet i borderline og ondartede eggstokk vevsprøver, og forbundet med en negativ sykdom utfall [17]. For ytterligere å undersøke hvilken rolle PDCD4 i eggstokkreft, i denne studien, undersøkte vi de potensielle tumor suppressor funksjonene PDCD4 i eggstokkreft celler, og plausible mekanismen som regulerer PDCD4.
Resultater
PDCD4 hemmet eggstokkreft celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon
for å undersøke funksjonen av PDCD4 i eggstokkreft, to PDCD4 over-uttrykke stabile kloner 433-PDCD4c1 og 433-PDCD4c2, ble etablert i eggstokkreft celle OVCA433. En PDCD4 over-uttrykke stabile klone SKOV3-PDCD4, ble etablert i eggstokkreft celle SKOV3 (figur 1A). Etableringen av PDCD4 overuttrykkende stabile kloner ble indikert ved den ekstra bånd, sammenlignet med foreldreceller. pEGFP over-uttrykker stabile kloner (433-EV og SKOV3-EV) ble også etablert som den tom vektorkontroll og anvendt i de følgende eksperimenter. Kvantifisering av de vestlige blotting båndene ble presentert i Data S1.
(A) PDCD4 over-uttrykke stabile kloner 433-PDCD4c1, 433-pdcd4c2, og SKOV3-PDCD4, ble etablert i eggstokkreft celler OVCA433 og SKOV3 . 433-EV og SKOV3-EV: GFP over-uttrykke tomme vektor stabile kloner for kontroll. (B) 433 PDCD4c1 og 433 PDCD4c2 utstilt betydelig tregere spredning rente sammenlignet med kontrollgruppen (* p 0,01 og ** p 0,05, henholdsvis) i henhold til XTT (venstre panel) og klonogene analyse (p 0,05) (høyre panel). (C) PDCD4 indusert cellesyklus arrest i G1 fasen. Representative data er fra et av tre uavhengige eksperimenter. De prosenter av celler som var i G1 fasen for OVCA433 c1 og c2 var 84,6% (± 2,1%) og 80,9% (± 2,2%), henholdsvis. Begge var signifikant høyere sammenlignet med kontrollgruppen (69,9% ± 3,1%) (p = 0,004 og P = 0,01, henholdsvis). Prosentandelen av celler som var i G1 fasen for SKOV3-PDCD4 var 66,7% (± 1,8%), som var signifikant høyere sammenlignet med kontrollgruppen (37,5% ± 2%) (p = 0,008). (D) PDCD4 overuttrykkende stabile kloner, så vel som kontroll tom vektor stabile kloner ble opprettholdt i MEM med 10% FBS, og deretter høstet for proteinekstraksjon. Protein uttrykk for et panel av cellesyklus regulatorer inkludert p53, p21, p27, cdc25a ble cyclinA og cyclinE analysert. Intensiteten av båndet ble bestemt ved densitometrisk scanning. Kvantifisering av bandene ble presentert i Data S1. GAPDH ble inkludert som intern lasting kontroll. Tre uavhengige eksperimenter ble utført.
Celleproliferering ble vurdert ved XTT og klonogene analysen. Ifølge XTT resultater, begge de to OVCA433-PDCD4 celler viste signifikant lavere proliferasjonsrate sammenlignet med kontrollgruppen (p 0,05 for OVCA433-PDCD4c1 og p 0,01 for OVCA433-PDCD4c2 henholdsvis figur 1B, venstre panel). Klonogene analysen viste også lignende resultater: antall kolonier dannet for OVCA433-PDCD4c1 og c2 var 33% og 58% mindre sammenlignet med kontrollen (GFP bare tom vektor kontroll), henholdsvis (p 0,05, figur 1B, høyre panel).
for å utforske de underliggende mekanismene for hemmende effekter av PDCD4 på eggstokkreft celleproliferasjon, vurdert vi effekten av PDCD4 på cellesyklusprogresjon ved hjelp av flowcytometri analyse. I kontroll OVCA433, prosentandelen av celler i G1 fasen var 69,9% (± 3,1%). Forholdsvis er prosentandelen av celler i G1 trinnet var 84,6% (± 2,1%) og 80,9% (± 2,2%) for OVCA433-PDCD4c1 og C2 henholdsvis, som begge signifikant høyere enn kontroll (p = 0,004 og P = 0.01, henholdsvis). Det var en tilsvarende reduksjon av prosentandelen av celler i S-fasen i den OVCA433-PDCD4c1 (10,3% ± 2,4%) og c2 (15,7% ± 2%)) sammenlignet med kontroll (25,9% ± 2,1%, figur 1C).
over-uttrykk for PDCD4 i SKOV3 også påvirket sin cellecyklusprogresjonen. I kontroll SKOV3-celler, prosentandelen av cellene i G1 trinn var 37,5% (± 2%). Forholdsvis, i SKOV3-celler PDCD4, prosentandelen av celler i G1 trinn var 66,7% (± 1,8%), som var signifikant høyere enn kontroll (p = 0,008). Det var en tilsvarende reduksjon av prosentandelen av celler i S-fasen i SKOV3-celler PDCD4 (20,9% ± 2,5%) sammenlignet med kontroll (46,2% ± 1,9%).
strømningscytometri-analyse indikerte at over uttrykking av PDCD4 indusert cellesyklus arrest i hovedsak på G1 fasen; 1,2 (p = 0,01) og 1,8 (p 0,01) ganger økning i andelen av cellene ved G1 stadium i OVCA433-PDCD4 og SKOV3-PDCD4 eggstokkreft kreftceller, henholdsvis (p = 0,01).
for å identifisere potensielle molekyler som er involvert i de ovennevnte hemmende effekter av PDCD4 på cellecyklusprogresjonen, vurdert vi uttrykk for flere cellesyklus regulatorer inkludert p21, p27, p53, cyclinA, cyclinE, cdc25a. I OVCA433-PDCD4c1 og c2, ble p53 uttrykk knapt endret og p21 ble betydelig opp regulert, mens i p53-null SKOV3-pdcd4 celler, ble p21 ikke oppdaget. P27 uttrykk ble opp regulert i begge OVCA433-PDCD4 og Skov-PDCD4 celler. I tillegg observerte vi en økning av cdc25a uttrykk i de to 433 PDCD4 overuttrykkende stabile kloner, og en økning på cyclinA ekspresjon i 433 PDCD4 c2, men ikke i c1 (figur 1D). Men bare en litt nedgang på cdc25a ble observert i Skov-PDCD4 celle, og cyclinA nivået ble forblitt den samme i både stabile klone og vektor kontroll av SKOV3 celler. Kvantifisering av de vestlige blotting båndene ble presentert i Data S1.
PDCD4 hemmet eggstokkreft celle migrasjon og invasjon
For å utforske mulige effekter av PDCD4 på eggstokkreft celle migrasjon, to ulike tilnærminger var anvendt. For det første ble sårheling test som benyttes for å overvåke den tid som er nødvendig for lukking av såret i kontroll og PDCD4 overuttrykkende eggstokkreft celler. Før analysen ble cellene forbehandlet med mitomycin C, et DNA-syntese og atom divisjon inhibitor, for å sikre lukking av såret var utelukkende på grunn av cellemigrering, men ikke celleproliferasjon. Resultatene viste at PDCD4 overuttrykkende celler oppviste langsommere migrasjonsrate. Den riper sår i begge kontrollcellene ble stengt i 23 timer etter innføringen av såret, mens en åpning ble fortsatt observert i PDCD4 overuttrykkende celler (figur 2A).
(A) Både kontroll og PDCD4 over-uttrykkende celler ble behandlet med mitomycin C (10 ug /ml) i tre timer før innføring av såret. Bilder ble tatt ved angitte tidspunkter (0, 5, 8 og 23 h). PDCD4 over-uttrykker stabile kloner oppviste langsommere sårheling prosess sammenlignet med kontrollen. (B) eggstokk-kreft-cellene ble tillatt å migrere gjennom den mikroporøse membran i 9 timer i transwell migrasjon assay. Det antall celler migrert gjennom for PDCD4 overuttrykkende stabile kloner var betydelig mindre, sammenlignet med kontroll (* p 0,01 og ** p 0,05, henholdsvis). (C) eggstokk-kreft-cellene ble tillatt å invadere gjennom ECMatrix i 72 timer i transwell invasjon analysen. Antallet celler invaderte gjennom for PDCD4 overuttrykkende stabile kloner var betydelig mindre, sammenlignet med kontroll (* p 0,05). Forsøk ble utført i tre eksemplarer.
For å vurdere kvantitativt celle migrasjon rate, transwell migrasjon analysen ble brukt. OVCA433-PDCD4c1 og c2 viste 35% og 63% mindre migrering, henholdsvis enn den for kontrollceller (p 0,01 figur 2B). SKOV3-PDCD4-celler viste 22% mindre migrering enn den for kontrollceller (p 0,05, figur 2B)
PDCD4 har også virkning på eggstokkreft celle invasjon vist ved transwell invasjon assay.. OVCA433-PDCD4c1 og c2 viste 27% og 30% mindre invasjon sammenlignet med kontrollgruppen (p 0,05 figur 2C). SKOV3-PDCD4 viste 19% mindre invasjon sammenlignet med kontrollgruppen (p 0,05, figur 2C).
Modulation av PDCD4
PDCD4 ble rapportert som en oversettelse inhibitor. Som proteintranslasjon kan bli stimulert av serum og hemmes når cellene ble sultet i fravær av vekstfaktorer, vi derved undersøkte effekten av serum på overflod av PDCD4. Både OVCA433 og SKOV3 var sultet i serumfritt medium i 48 timer før serum ble gjenopptas ved angitte tidsintervaller, inkludert 1 time, 2 timer, 6 timer og 24 timer. I begge celler, ble PDCD4 forhøyet når sultet. Imidlertid ved en gjentatt administrering av serum, PDCD4 gradvis redusert i en tidsavhengig måte i SKOV3 og hurtig forsvant i løpet av 1 time i OVCA433 (figur 3A). Kvantifiseringen av Western blotting båndene ble presentert i data S2.
(A) OVCA433 og SKOV3 var fratatt fra serum (SD) i 48 timer før serum ble gjen administrert i 1 time, 2 timer, 6 timer og 24 timer. Det var en dramatisk økning av PDCD4 protein uttrykk på serum deprival behandling. PDCD4 raskt forsvant etter serum ble re-administreres. P-Akt og p-ERK ble nedregulert når serum ble trukket tilbake og gradvis gjenopptatt etter serum ble lagt tilbake. Total Akt og ERK ble ikke påvirket i løpet av behandlingen. (B) PDCD4 ble forhøyet i serum fratatt celler (SD) og utarmet når serum ble lagt tilbake (SA, serum tillegg) for 2 og 4 timer. Administrasjonen av enten proteasominhibitor MG132 (S + MG132), eller PI3K inhibitor LY294002 (S + LY294002) forhindret uttømming av PDCD4. DMSO ble også inkludert som kontroll (S + DMSO). Negativ kontroll (-ve) som er angitt for celler dyrket med medium inneholdende serum. (C) Et uttrykk for PTEN, p-Akt og p-ERK ble forandret i alle PDCD4 over-ekspresjon stabile kloner, mens uttrykket av total Akt og ERK forble uendret. Tre uavhengige eksperimenter ble utført. Kvantifisering av de vestlige blotting båndene ble presentert i Data S2.
Å utforske mulige veier som er involvert i modulering av PDCD4 i over behandlingen de uttrykk for PTEN, p-Akt og p-ERK ( ekstracellulære signalregulerte kinase) ble undersøkt. PTEN ble løftet etter at serumet var blitt fjernet, og det var ingen ytterligere forandring etter re-tilsetning av serumet til opp til 24 timer. Det var en betydelig reduksjon av p-Akt når serum ble fjernet i begge OVCA433 og SKOV3-celler, etterfulgt av gjenopptakelse ved 6 timer etter serum re-tilsetning i OVCA433. I SKOV3, utvinning av p-Akt var hurtig som 1 time. En liten reduksjon av p-ERK ble observert i begge celler i fravær av serum, og en ytterligere reduksjon ble også observert i begge cellene når serum ble gjen innlagt i 1 time. Ekspresjonen av p-ERK ble gjenopptatt etter 2 timer og serum administrering og etter hvert kommet til det opprinnelige nivå på 24 timer. Ingen dyptgripende endring ble observert i noen av total Akt eller ERK (figur 3A).
For å bekrefte potensialet involvering av PI3K-Akt og MEK-ERK stier i reguleringen av PDCD4, Specific PI3K inhibitor LY294002, og MEK inhibitor U0126 ble introdusert til sultet cellene sammen med serum og inkubert i 2 timer og 4 timer etter 48 timers behandling sult. Når p-Akt ble spesielt nedregulert ved behandling av LY294002, ble uttømming av PDCD4 forhindres (figur 3B). Men den administrering av U0126 ikke utviser noen effekt på forebygging av PDCD4 degradering (figur S1). I tillegg, når proteasominhibitor MG132 ble introdusert til de sultet cellene, uttømming av PDCD4 ble også forhindret (figur 3B). Ingen effekt ble observert i DMSO kontrollceller. Våre resultater viste at uttømming av PDCD4 etter re-tilsetning av serum i eggstokkreft celler var på grunn av proteasomet-mediert degradering. Kvantifisering av de vestlige blotting båndene ble presentert i Data S2.
I PDCD4 over-uttrykker eggstokkreft celler, PTEN var opp regulert, og p-Akt og p-ERK var signifikant nedregulert, mens total Akt og ERK ble ikke påvirket (figur 3C). Kvantifisering av de vestlige blotting båndene ble presentert i Data S2.
Intracellulær translokasjon av PDCD4
Vår forrige immunhistokjemi studie viste en differensial cellulær lokalisering mønster av PDCD4 mellom normale og maligne eggstokkreft celler [17] Dette tyder på at PDCD4 kan translocate fra kjernen til cytoplasma under eggstokkreft utvikling. Andre studien viste også den intracellulære translokasjon av PDCD4 under visse stress forhold [18]. Vi undersøkte den endogene PDCD4 lokalisering i eggstokkreft celler. To ovarie cancer-cellelinjer, OV2008 og C13, har høyt ekspresjonsnivå av det endogene PDCD4, som ble funnet lokalisert utelukkende i kjernen under normale dyrkingsbetingelser (figur 4). Etter serum sult behandling i 48 timer, ble det endogene PDCD4 funnet å være translokert fra kjernen til cytoplasma (figur 4).
Endogen PDCD4 i begge OV2008 og C13 eggstokkkreftceller ble lokalisert utelukkende på kjernen når de dyrkes i medium med serum. Mer cytoplasma lokalisering av PDCD4 ble observert etter serum sult behandling. Endogen PDCD4 ble påvist ved hjelp av immuno-fluorescensfarging PDCD4 primært antistoff og FITC-merket geite-anti-kanin sekundære antistoffer. Dapi farging indikert kjernefysiske lokalisering. Representant trans ble indikert med piler.
Diskusjoner
En rekke studier har rapportert de hemmende effekter av PDCD4 på protein oversettelse [19], [20], og AP-en avhengig transaktivering [12], [21]. Studier på PDCD4 funksjon på cellesyklus har generert inkonsistente resultater. I brystkreftceller, PDCD4 forårsaket en økt befolkning i G0 til G1 fase uten å påvirke andre faser av cellesyklus som tyder på en mulig rolle i apoptose [22]. I glioma kreftceller, PDCD4 forsinket cellesyklus overgang fra G1-til-S-fasen [23]. En annen gruppe rapporterte at PDCD4 induserte celler i både sub-G1 og G2-S-fasen, noe som indikerer dens virkninger på både apoptose og cellesyklus arrest [24]. Men i tykktarm kreft celler, PDCD4 endret ikke cellecyklusprogresjonen eller indusere apoptose [8]. I denne studien, ektopisk PDCD4 uttrykk indusert cellesyklus arrest i G1 fasen og dermed undertrykt eggstokkreft celleproliferasjon.
Vi vurderte uttrykk for et panel av cellesyklus regulatorer som spiller viktige roller i G1-S overgang i PDCD4 over-uttrykkende celler. PDCD4 indusert ekspresjon av p27 og p21, men ikke de uttrykk for cyclin E. Resultatene var i overensstemmelse med de funn som knockdown av PDCD4 i AML-celler resulterte i nedregulering av p27 [25]; og induksjon av p21 og p27 ved PDCD4 [26]. De cellulære effekter ved PDCD4 ble foreslått å være forskjellig i cellemodeller med eller uten p53-ekspresjon [10], [27]. To eggstokkene cellelinjer som er valgt i denne studien har differensial p53 status, OVCA433 bærer villtype p53, og SKOV3 være null p53. Begge cellelinjene hadde forhøyet uttrykk P27 ved overekspresjon av PDCD4, og den opp-regulering av p21 ble ikke mediert av p53 i OVCA433 celler. Liknende resultater har vært rapportert at induksjon av p21 ved PDCD4 i carcinoid-celler var uavhengig av p53 [7]. Våre funn underforstått at en av de mulige mekanismer for induksjon av cellesyklus-stans ved G1 trinn ved PDCD4 skyldtes opp regulering av p21 og p27. Vi la merke til at det ikke var noen forskjell i cyclin A eller cdc25a uttrykk mellom stabile klone og tom vektor kontroll i SKOV3 cellelinjer. Men for OVCA433 celler, vi har observert en økning på cdc25a uttrykk i de to PDCD4 overuttrykkende stabile kloner, og en økning av cyklin A-ekspresjon i 433 PDCD4 c2, men ikke i c1. Den differensielle ekspresjonen av cyklin A kan være på grunn av de forskjellige proliferative og klonogene aktivitetene til PDCD4-uttrykkende klon c1 og c2. Likevel, ville effekten av PDCD4 på cyclin A og cdc25a trenger videre etterforskning.
I tillegg til spredning, vi også demonstrert hemmende effekter av PDCD4 på eggstokkreft celle migrasjon og invasjon. Lignende effekter er også rapportert i studier utført i tykktarm og HCC celler [8], [20], [28]. PDCD4 ble funnet å være indusert ved behandling av pro-apoptotiske substanser [29], [30]. Undersøkelser på sin rolle i apoptose har generert inkonsistente resultater. PDCD4 er blitt vist å indusere apoptose i bryst og lungekreftceller [22], [26] I motsetning til dette, ikke apoptotiske virkning av PDCD4 ble observert i andre studier [8], [12]. I tillegg ble høyere PDCD4 uttrykk rapportert å være korrelert med økt følsomhet for geldanamycin og tamoxifen [31]. Videre er en fersk undersøkelse utført i prostatakreftceller foreslått økt cisplatin og paclitacel følsomhet av over-uttrykk for PDCD4 [32]. I denne studien, gjorde overekspresjon av PDCD4 ikke induserer apoptose i henhold til flowcytometri og western blot analysen gjennom PARP uttrykk (figur S2). Vi vurderte også den potensielle rolle PDCD4 på cisplatin følsomhet. Det ble imidlertid ikke observert noen signifikant forskjell mellom PDCD4 over-uttrykkende celler og kontrollcellene som respons på cisplatin-behandling (fig S2), som var konsistent til vår tidligere publiserte data at ingen korrelasjon av PDCD4 uttrykk med kjemosensitivitet status for ovarian kreftpasienter ble observert [17]. Gitt at mekanismen for cisplatin, for å drepe kreftceller er å initiere celle apoptose, og PDCD4 viste ingen apoptotisk virkning i eggstokkkreftceller, kan dette være en av grunnene som bidrar til den ovennevnte observasjon.
Som nevnt fra våre resultater, omfanget av suppresjon av ovarial cancer celleproliferasjon, migrering og invasjon var ikke i forhold til de over-ekspresjon nivåer av PDCD4 protein i de stabile kloner. Lignende funn ble også rapportert i studien utført av Yang et al. i mus epidermal JB6 RT101 celler [21]. Vi foreslått at det kan være en konsentrasjonsterskel, da overskrides, den inhiberende funksjon av PDCD4 på tumorprogresjon ville oppstå. Ifølge vår flowcytometri vurdering, over-uttrykk for PDCD4 både OVCA433 og SKOV3 celler indusert cellesyklus arrest i G1 fasen. Men selv om en undertrykkende effekt på celleproliferasjon og kolonidannelse ble observert i PDCD4 over-uttrykker SKOV3 celler, var effekten ikke statistisk signifikant for sammenlignet med foreldrekontrollcellene (Figur S3). Om det var på grunn av den genetiske bakgrunnen til SKOV3 celler eller involvering av andre mekanismer og faktorer var foreløpig ikke klart og krevde videre etterforskning.
De observasjoner av nedregulering av p-Akt og p-ERK i PDCD4 over-uttrykkende celler antydet en mulig involvering av p-Akt og p-ERK baner i reguleringen av PDCD4. For å adressere spørsmålet som om disse to banene er faktisk involvert, fortsatte vi å studere samtidig uttrykk for p-Akt, p-ERK og PDCD4 under serum tilbaketrekking og re-tillegg behandling. Det var en dramatisk økning av PDCD4 på serum uttak, etterfulgt av rask uttømming av PDCD4 etter serum ble administrert på nytt. I løpet av den samme prosessen, en omvendt trend av ekspresjonen av både p-Akt og p-ERK, er de to viktigste celleproliferasjonsprosesser regulatoriske molekyler, ble det observert: en innledende redusert ekspresjon, fulgt av en gradvis gjenopptakelse. Endring av p-Akt og p-ERK kanskje bare konsekvensene av serum deprival behandling. Og likevel, gitt de samtidige endringer av uttrykkene for PDCD4 og p-Akt og p-ERK, og den endrede ekspresjon nivået for begge molekyler observert i PDCD4 overuttrykkende celler, er det en mulighet for at p-Akt og p-ERK trasé var involvert i reguleringen av PDCD4. For ytterligere å bekrefte det, søkte vi PI3K inhibitor LY294002 (som senere blokker Akt fosforylering) sammen med serum, og fant PDCD4 protein ikke lenger var degradert. Innføring av MEK hemmer ikke hindre utarming av PDCD4. Våre resultater viste at p-Akt, men ikke p-ERK var nødvendig for nedbrytning av PDCD4 på serum stimulering, og således PI3K-Akt reaksjonsvei kan spille en direkte rolle i modulering av PDCD4 degradering i eggstokkreft celler. Imidlertid er involvering av p-ERK banen ikke klart på det nåværende og kreves videre undersøkelser. Det har vært studier som rapporterer p-Akt sti på regulering av PDCD4. Dorrello studie implisert rolle S6K1 i reguleringen av PDCD4 degradering i respons til mitogen [23]. Behandling med tumor promoter 12-O-tetradekanoylforbol-13-acetat (TPA) ble redusert PDCD4 uttrykk, som kan tilskrives proteasomal degradering mediert av PI3K-Akt-mTOR-p70
S6K og tilrettelagt av MEK-ERK signalveien [16] . En invers korrelasjon av PDCD4 og p-Akt uttrykk har blitt rapportert i kolorektal kreft vevsprøver [33]. shRNA PDCD4 aktivert Akt vei, som fører til økt uttrykk for p-Akt, mTOR og p70S6K i lungene til mus [34]. Våre resultater var i overensstemmelse med disse funnene og antydet involvering av p-Akt veien i reguleringen av PDCD4 i eggstokkreft celler.
Ved å kombinere det fenomen som nedregulering av p-Akt-ekspresjon ble observert i løpet av PDCD4 -expressing celler, og det faktum at blokkering av p-Akt av PI3K inhibitor hindret nedbrytningen av PDCD4 under serum sult og re-tilsetning prosess, foreslo vi en potensiell tilbakekoplingsstyring av PDCD4 gjennom p-Akt vei: etablering av PDCD4 over uttrykkende stabile kloner som bare kunne oppnås ved degradering av PDCD4 ble hemmet, noe som er nødvendig undertrykkelse av p-Akt uttrykket (figur 5). Imidlertid har de potensielle mekanismer som medierer denne tilbakemeldingen kontroll og molekyler som er involvert ikke er identifisert og videre undersøkelser er nødvendig.
Forhøyet PTEN og undertrykte p-Akt ble funnet i PDCD4 over-uttrykke stabile kloner. Når cellene ble sultet med serumfritt medium, PDCD4 var un-fosforylert grunn av undertrykket p-Akt uttrykk. Un-fosforylert PDCD4 ble ikke anerkjent av proteasome dermed fører til opphopning av PDCD4. Når serum ble gjen administrert til cellene, oppregulert p-Akt fosforylert PDCD4, som deretter ble tømt gjennom proteasomet degradering. Administrasjonen av enten PI3K inhibitor LY294002, i stand til å hindre PDCD4 blir fosforylert av p-Akt, eller proteasominhibitor MG132, hindre utarming av PDCD4, som fører til opphopning av PDCD4.
Våre nåværende resultater viste en translokasjon av endogen PDCD4 fra kjernen til cytoplasma ved serum sult. Vi antok at PDCD4 makt shuttle til cytoplasma å vise sin hemmende funksjon i protein oversettelse når cellene var under ugunstige vekstbetingelse. Ifølge våre tidligere funn, ble det observert en differensial lokalisering av PDCD4 mellom normale og maligne eggstokk vevsprøver: Det ble observert mer cytoplasmisk lokalisering av PDCD4 in ovarian cancer vevsprøver [17]. Når svulsten vokser, kan det være noen områder hvor oksygenkonsentrasjonen er betydelig lavere enn i normale vev, og tumorceller er under en hypoksisk stress. En hypotese er at i disse cellene, PDCD4 kan shuttle til cytoplasma å hemme oversettelse og deretter cellevekst. I det hele tatt, PDCD4 fungerer som tumor suppressor i kjernen i normale celler, men når cellene var under visse miljømessige belastninger eller som gjennomgår potensiell transformasjon fra normal til malign, en av de cellulære respons kan være transportere PDCD4 til cytoplasma. Dette gjør lokalisering av PDCD4 som en indikator på cellene under unormal vekst miljø eller neoplasmic transformasjon. Likevel er trans mekanisme PDCD4 likevel ennå ikke klart og hypotesen må vurderes nærmere.
Materialer og metoder
Cell kultur, serum sult behandling og medikamentell behandling
Eggstokkreft cellelinjer OVCA433 og SKOV3 brukt i denne studien var gaven fra Prof. SW Tsao, Anatomisk institutt, Universitetet i Hong Kong. Ovarian kreft cellelinjer C13 og OV2008 var gave fra professor BK Tsang, Institutt for obstetrikk og gynekologi, University of Ottawa, Canada. Disse cellelinjene ble dyrket i MEM med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA).
cellene under serum sult behandling ble dyrket i MEM uten FBS. Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) hemmer LY294002 (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA), MEK hemmer U0126 (Cell Signaling), proteasominhibitor MG132 (Cell signalering) ble oppløst i DMSO (Sigma Co., St. Louis, MO ) og fortynnes ytterligere før introdusert til cellene. Medium med DMSO alene ble også tatt med som kontroll.
Antistoffer og western blot-analyse
Protein ekstraksjon og western blot-fremgangsmåter var de samme som tidligere beskrevet [17]. PDCD4 antistoff var fra Rockland (Rock immunochemicals, Gilberts, PA); antistoffer av p21, cyclinA, cyclinE og p53 var fra Santa Cruz; antistoffer av PTEN, p-Akt, Akt, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, cdc25a, mTOR var fra cellesignalisering; antistoff av p27 var fra BD Transduction laboratorier.
Bygging av PDCD4 cDNA ekspresjonsvektor
PDCD4 full-lengde cDNA ble forsterket av PCR hjelp Menneskelig PDCD4 cDNA-klon (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) (Genebank adgangsnummer NM_014456.3) som templatet og de følgende primerparene 5’gaattccATGGATGTAGAAAATGAGCAGA 3 «(sense) og 5» gtcgacTCAGTAGCTCTCTGGTTTAAGA 3 «(antisense), som inneholdt EcoRI og Sall-restriksjonsenzymseter. En 1,5-kb, full-lengde PDCD4 PCR-produktet ble så klonet i ramme, inn pEGFP-C1 (Clontech laboratorier, Mountain View, CA).
Etablering av PDCD4 over- uttrykke stabile kloner
PDCD4 plasmid eller GFP-C1 vektor ble transfektert inn OVCA433 og SKOV3 eggstokkreft celler ved hjelp Fugene HD transfeksjon reagens (Roche Molecular biokjemikalier, Manniheim, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. Cellene ble deretter høstet for western blot analyse eller analyse.
