Abstract
Bakgrunn
epidermal vekstfaktor reseptor-tyrosinkinasehemmere (EGFR-TKI) og anaplastic lymfom kinase (ALK) hemmere har dramatisk endret strategien for medisinsk behandling av lungekreft. Pasienter bør undersøkes for nærvær av EGFR mutasjon eller echinoderm microtubule-assosiert protein-lignende 4
(EML4
) –
ALK
fusjonsgenet før kjemoterapi å forutsi deres kliniske respons. Den succinatdehydrogenase hemming (SDI) test og kollagen gel dråpe forankret kultur medikament følsomhet test (CD-DST) er etablert
in vitro
narkotika sensitivitetstester, som kan forutsi følsomheten av pasienter til cytotoksiske kreft narkotika. Vi søkte
in vitro
narkotika sensitivitetstester for cyclopedic prediksjon av kliniske reaksjoner på ulike molekylære rettet mot narkotika.
Metoder
Den veksthemmende effekten av erlotinib og crizotinib ble bekreftet for lunge kreftcellelinjer ved hjelp av SDI og CD-DST. Sensitiviteten av 35 tilfeller av kirurgisk reseksjon lungekreft overfor erlotinib ble undersøkt ved hjelp av SDI eller CD-DST, og sammenlignet med EGFR mutasjonsstatus
Resultater
HCC827 (Exon19: E746-A750 del). og H3122 (
EML4-ALK
) celler ble hemmet av lavere konsentrasjoner av erlotinib og crizotinib, henholdsvis enn A549, H460, og H1975 (L858R + T790M) celler var. Levedyktighet av kirurgisk reseksjon lungekreft var 60,0 ± 9,8 og 86,8 ± 13,9% i EGFR-mutanter vs vill typer i SDI (p = 0,0003). Cellen levedyktighet var 33,5 ± 21,2 og 79,0 ± 18,6% i EGFR mutanter vs vill type saker (p = 0,026) i CD-DST.
Konklusjoner
In vitro
narkotika følsomhet vurderes av enten SDI eller CD-DST korrelert med EGFR-genet status. Derfor kan SDI og CD-DST være nyttige prediktorer for potensielle kliniske respons på de molekylære kreft narkotika, cyclopedically
Citation. Miyazaki R, Anayama T, Hirohashi K, Okada H, Kume M, Orihashi K (2016 )
in vitro
Drug sensitivitetstester for å forutsi Molecular Target Drug Responses i Kirurgisk reseksjon lungekreft. PLoS ONE 11 (4): e0152665. doi: 10,1371 /journal.pone.0152665
Redaktør: Yiqun G. Shellman, University of Colorado, School of Medicine, USA
mottatt: 03.11.2015; Godkjent: 17 mars 2016; Publisert: 12. april 2016
Copyright: © 2016 Miyazaki et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Vår støtte informasjonsfilen inneholder minimal anonymisert datasett nødvendig å gjenskape våre studie funn
Finansiering:. studien ble fullfinansiert av ubegrenset offisielle fondet levert av Kochi Medical School, Kochi University, Japan, http: //www.kochi -ms.ac.jp/
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet i mange utviklede land, mens adenokarsinom representerer 70% av tilfellene av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). I japanske pasienter, ca. 50 og 5% av adenocarcinomer har en mutasjon i den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) [1] og echinoderm mikrotubulus-assosiert protein-like 4-anaplastisk lymfom kinase (
EML4-ALK
) fusjonsgenet, hhv. Molekylære mål-anticancer legemidler, slik som EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer (TKI) og ALK-inhibitorer er dramatisk endret strategien for klinisk behandling av kreft.
fleste EGFR mutasjon-positiv lunge-kreft er følsomme for EGFR-TKI, som bidrar å utvide progresjonsfri overlevelse (PFS) og total overlevelse (OS) av pasientene [1-4]. Men ikke EGFR mutasjon-positive tilfeller ikke alltid utvise god klinisk respons på EGFR-TKI behandling. Omtrent 30% av EGFR mutasjon tilfeller er resistente mot EGFR-TKI [3, 4]. Mutasjonen av Kirsten rotte sarkom viral onkogen homolog (K-RAS) og serin /treonin-protein kinase B-Raf (B-RAF) eller andre mutasjoner som T790M er kjent for å korrelere med motstand mot EGFR-TKI. [5] på den annen side, omtrent 10% av EGFR villtype tilfeller oppviser kliniske responser på EGFR-TKI [4]. Videre EGFR-TKI er også effektive i tilfeller av plateepitelkarsinom som ofte ikke viser EGFR mutasjon [6]. Derfor er det noen populasjoner av EGFR-TKI respondere som ikke er vist for EGFR mutasjoner.
EML4-ALK
-positivt lungekreft er en primær ondartet lungetumor som består av celler som med en karakteristisk unormal konfigurasjonen av DNA hvor
EML4
genet er smeltet til anaplastisk lymfom kinase (
ALK
) genet.
ALK
-inhibitors (crizotinib eller alectinib) er for tiden tilgjengelig for klinisk bruk. Det er vanlig å bekrefte tilstedeværelsen av
EML4-ALK
ved anvendelse av en fluorescens in situ hybridisering (FISH) analyse, men med høy følsomhet og immunfarging ble alternativt anvendt for screening av
EML4-ALK
. Men FISH og farging ikke nødvendigvis er knyttet til den kliniske responsraten til
ALK
hemmere i praksis [7-9]. Utviklingen av molekylære mål narkotika for nye driver mutasjoner bør pålegges å inkludere undersøke av den ansvarlige genmutasjon. Det er i dag ingen etablert metode omfattende forutsi effekten av molekylære målsøkende midler som virker på ulike punkter i de ulike signalveier.
Det er in vitro anticancer narkotika sensitivitetstester som succinatdehydrogenase hemming (SDI) test , histoculture narkotika respons analyse (HDRA) -metoden, og kollagen gel dråpe forankret kultur medikament følsomhet test (CD-DST). Interessant, rekkefølgen jenta kjemoterapi med kreftmedisiner, som ble spådd så effektiv, faktisk utstilt høyere kliniske respons enn konvensjonell kjemoterapi gjorde [10-12]. Videre er det en rapport som tyder på at in vitro-medikamentsensitivitet test kan være nyttig for å forutsi effekten av kjemoterapi i NSCLC. [13] Det har imidlertid ikke vært noen tidligere rapport om klinisk anvendelse av in vitro-medikamentsensitivitetstester for prediksjon av de potensielle effektene av EGFR-TKI eller
ALK
hemmere i kirurgisk reseksjon ferske kreft vevsprøver lunge. Formålet med denne studien var å utvikle en in vitro kulturbasert medikamentsensitivitet test for å forutsi følsomheten av kirurgisk reseksjon lungekreft til flere molekylære mål medikamenter.
Materialer og metoder
A. Verifikasjon av hemmende effekt av molekylære mål narkotika i lungekreft cellelinje
De optimale doser av erlotinib og crizotinib (Funakoshi Co Ltd, Tokyo, Japan) som brukes i både 3- (4,5-2 -yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium (MTS) analyse og CD-DST ble titrert ved hjelp av følgende udødeliggjort human lungecancercellelinjer: HCC827 (adenokarsinom, EGFR mutasjon videre Exon19, E746-A750 sletting), H1975 (adenokarsinom, EGFR mutasjon, Exon 21 L858R + T790M), H3122 (adenokarsinom,
EML4-ALK
fusjonsgenet), A549 (adenokarsinom), og H460 (stor celle karsinom ). A549, ble H460, HCC827 og H1975 innhentet fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia USA). H3122 ble vennlig levert av Dr. Pasi A. Janne fra Harvard Medical School (Boston, MA, USA).
A- (1) MTS analysen i humane lungekreftcellelinjer.
kreft celler ble overført til 96-brønns flatbunnede kulturplater ved en tetthet på 4,0 x 10
4 til 6,0 x 10
4 celler /brønn med økende konsentrasjoner av erlotinib (0,002, 0,02, 0,2, 2,0, og 20 uM) og crizotinib (0,006, 0,06, 0,6 og 3 pM), og inkubert ved 37 ° C i 72 timer utsatt for 5% CO
2. Etter tilsetning av 20 ul av celle Titer (Promega Corporation, Madison, WI, USA) til kulturmediet, ble kreftcellene inkubert i 90 minutter, og absorbansen ble målt ved 490 nm.
A- (2) immunoblotanalyse.
immunoblotanalyse ble utført som tidligere beskrevet [14, 15] Cellene ble vasket med PBS, høstet, og lysert i RIPA-buffer (Nacalai Tesque inc., Kyoto, Japan) med fosfatase Inhibitor Cocktail (Nacalai tesque inc., Kyoto, Japan). For Western blot analyse, ble 30μg av samlede ekstrakter suspendert i 20 ul Sample Buffer Solution med 2-ME for SDS-PAGE (Nacalai Tesque inc., Kyoto, Japan), ble elektro løst på denaturerende polyakrylamidgeler, Transferd til nitrocellulose. Membranene ble blokkert med Blokkering En eller Blokkering One-P (Nacalai Tesque inc., Kyoto, Japan), og probet med kanin monoklonale antistoffer mot fosforylert humant ALK (Y1604), for å ALK, den fosforylert EGF-reseptor (Y1068), og for å EGF reseptoren (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Deretter ble membranene inkubert i anti-kanin-sekundært antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA). Hvert bånd ble skannet av LAS -4000.mini (FUJIFILM, Tokyo, Japan).
A- (3) CD-DST i humane lungekreftcellelinjer.
CD-DST var utført i henhold til en tidligere rapportert fremgangsmåte [16]. I korthet kreftcellelinjer ble behandlet med en celle dispersjon enzymløsning (EZ, Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japan) i 2 timer. Deretter ble bare levedyktige celler som klebet til kollagen gelen oppsamlet og suspendert i det rekonstruerte type I kollagen-oppløsning (Cellmatrix Type CD, Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japan) til en endelig tetthet på 1 x 10
5 celler /ml. Tre dråper av kollagen-celleblandingen (30 pl /dråpe) ble plassert i hver brønn i en 6-brønns multiplate i en 60 mm skål og tillatt å gel ved 37 ° C i en CO2-inkubator i 1 time. Den endelige konsentrasjonen var ca 3 x 10
3 celler /kollagen-gel dråpe. Dyrkningsmediet ble belagt i hver brønn og platen ble inkubert i en CO
2 inkubator ved 37 ° C over natten. Tre kollagen dråper ble plassert på bunnen av 6-brønns plater for å muliggjøre dyrking i en tredimensjonal (3-D) miljø, og ble inkubert i 7 dager i serumfritt medium i nærvær av de samme konsentrasjonsområder for erlotinib og crizotinib brukes i MTS-analysen. Deretter ble cellene fiksert med 10% bufret formalin (Nacalai Tesque inc., Kyoto, Japan), og farget med nøytral Rød (Kurabo, Osaka, Japan). Bilder av de faste celler ble tatt med mikroskop fotografering. Bildene inkludert både kreftceller (dypt farget) og fibroblaster (lett farget) farget med nøytral rød ble kjøpt, fibroblaster ble valgt ut og eliminert som uniform spindel celler med små dimensjoner kjerner, deretter antall levedyktige kreftceller ble kvantifisert ved hjelp av en dedikert programvare (Primege, versjon 1.01, Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japan) [17, 18]. Levedyktighet av erlotinib eller crizotinib-behandlede celler ble sammenlignet med de ubehandlede kontrollceller.
B. Klinisk studie med kirurgisk reseksjon frisk lungekreft vevsprøver
Denne studien ble godkjent av den etiske komiteen av Kochi Medical School Hospital (Ethics omtale godkjenningsnummer: ERB-100866), og ble gjennomført fra juni 2013 til august 2014 . de alle deltakerne gitt sitt skriftlige samtykke til å delta i denne studien i henhold til samtykke prosedyren. Trettifem pasienter med kirurgisk resectable NSCLC (SDI og CD-DST, n = 23 og 12, henholdsvis) ble inkludert i den kliniske studien. Etter kirurgisk fjerning, en del av friske kreft vevsprøver, sjekket tumorcelle ved berøring smøre cytologi, ble oppnådd for in vitro legemiddelfølsomhetsanalyser som beskrevet i de neste avsnittene.
B- (1) SDI prediksjon av følsomheten overfor erlotinib for klinisk prøve lungekreft vev.
SDI er den protokoll basert på MTS analyse for bulk ferske vevsprøve, inkludert både kreftceller og ikke-cancerceller [19, 20]. I korthet, den friske kirurgiske prøver (10 ml terninger: 1 ml) ble hakket til en pasta, som ble behandlet med en celle dispersjon enzym ved 37 ° C i 2-3 timer, sentrifugert, og deretter ble supernatanten ble fjernet. Levedyktige lungekreftceller ble deretter overført til 96-brønners plater i en tetthet på 1,0 x 10
6 celler /brønn og inkubert i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C med 5% CO
2 i 72 timer. Cellene ble utsatt for det samme konsentrasjonsområdet erlotinib anvendt i MTS-analysen. Deretter ble 20 ul av celle titer tilsatt til hver brønn, og platene ble inkubert i 150 minutter, etterfulgt av måling av absorbansen ved 490 nm for å kvantifisere cellenes levedyktighet.
B- (2) CD-DST prediksjon av følsomheten overfor erlotinib for kliniske lungekreft vevsprøve
Ferske vevsprøver (3 milliliter cubed: 27μL). innhentet fra kirurgisk skåret lungekreft vev ble hakket fint å bruke en skalpell og fordøyd i en celle spredning enzym løsning (EZ, Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japan) i 2 timer. De dispergerte Cellene ble vasket to ganger, oppsamlet ved sentrifugering ved 2400 rpm i 3 minutter, filtrert gjennom et 80 um nylonnett for å oppnå mer enn 1,0 x 10
5-celler, som ble inkubert i en kollagen-gel belagt kolbe (CG- kolbe, Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japan) i en CO
2 inkubator ved 37 ° C i 24 timer. De gjenvundne celler ble så innesluttet i en kollagen dråpe å dyrkes i et 3D-miljø. Levedyktige lungekreftceller ble deretter inkubert med 0,2 pM erlotinib (optimal dose ble bestemt i A- (2)) i 7 dager. Klare kulturmedia (PCM) 2 ble anvendt i den standard protokoll for CD-DST. Imidlertid signifikante funn ble ikke oppnådd ved anvendelse av den foregående testmetoden [21], og derfor PCM4 (Kurabo, oosaka, Japan), en vekstfaktor-redusert kulturmedium ble anvendt i denne studien.
B- (3)
EGFR
genmutasjon analyse.
screenes for EGFR-mutasjonen ved hjelp av peptid-nukleinsyre-låst nukleinsyre polymerase kjedereaksjon (PNA-LNA PCR) klemme-metoden [22, 23] . Den detaljerte genmutasjon status av hver prøve ble bekreftet ved hjelp av direkte sekvenseringsmetode. EGFR mutasjoner i det ekstraherte DNA ble undersøkt ved å bruke PCR-baserte direkte sekvensering av exoner 19 og 21. Sekvensering ble utført ved anvendelse av Applied Biosystems PRISM fargestoffterminatorsyklussekvenseringsmetode (Perkin-Elmer Corp., Foster City, CA, USA) med en ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
C. Statistisk analyse
Vi beskrev den dose-responskurve av molekyl målrettet mot legemidler for lungecancercellelinjer. Korrelasjonen mellom somatisk genmutasjoner av
EGFR
i kreftcellene og narkotika følsomhet overfor erlotinib ble sammenlignet. Pasientene ble delt i to grupper: villtype og mutante EGFR-grupper. Resultatene av medikamentsensitivitetstest av begge grupper ble statistisk sammenlignet ved hjelp av Mann-Whitneys U-test. Vi henvist til statistisk signifikant som p 0,05. Den ideelle avskåret verdien av celle levedyktighet utpekt til å forutsi kreftceller som er følsomme for elrotinib ble bestemt ved hjelp av en mottaker som opererer karakteristikk (ROC) kurve. Dose-respons og ROC kurver ble konstruert ved hjelp av GraphPad Prism versjon 6.0 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Resultater
A. Hemmende effekt av molekylære mål narkotika i lungekreft cellelinje
A- (1) MTS analysen i lungekreftcellelinjer.
levedyktighet av lungekreft cellelinjer etter eksponering for 2,0 mikrometer av erlotinib i 3 dager, var 98,9 ± 9,3, 99,4 ± 10,7, 85,7 ± 10,7 og 31,9 ± 1,6 (%) for H460, A549, H1975, og HCC827, respektivt. Veksten av HCC827 (med
EGFR
mutasjon, del E746_A750), men ikke for de andre cellelinjer uten mutasjon eller med to
nd resistent mutasjon (T790M) cellelinje ble betydelig hemmet etter eksponering til erlotinib (p = 0,030, figur 1-a). Tilsvarende, levedyktigheten av de cellelinjer etter eksponering til 0,60 uM av crizotinib i 3 dager var 103,2 ± 5,67, 96,9 ± 8,05, og 35,8 ± 3,24% for H460, A549, og H3122, respektivt. H3122 (med
EML4-ALK
fusjonsgenet) viste betydelig veksthemming etter eksponering for crizotinib (fig 1-b)
(a) Eksponering for erlotinib i MTS analysen. HCC827 (EGFR ekson 19 sletting) viste betydelig veksthemming mens A549 og H460 (wild EGFR) eller H1975 (EGFR T790M motstand andre mutasjon) var ikke følsom for elrotinib. (B) Eksponering for crizotinib i MTS analysen: H3122 (
EML4-ALK
fusjon) viste betydelig veksthemming, mens andre kreftceller uten fusjonsgenet ikke var følsomme for crizotinib. (C) Uttrykk for EGFR protein og hemming av fosforylering av erlotinib hos NSCLC cellelinjer i western blot analyse: Erlotinib hemmet fosforylering av EGFR (pEGFR) i HCC827, men ikke hemme den i H1975. (D) Uttrykk for ALK og hemming av fosforylering av crizotinib hos NSCLC cellelinjer i western blot analyse: H3122 uttrykt ALK og crizotinib hemmet fosforylering av ALK (Palk). (E) Eksponering for erlotinib i CD-DST. (F) Eksponering for crizotinib i CD-DST. Sammenlignet med MTS analysen, CD-DST kreves lavere doser av erlotinib å vise signifikant forskjell i vekst mellom cellelinjer.
EGFR
, epidermal vekstfaktor reseptor genet;
EML4-ALK
, pigghuder microtubule-assosiert protein-like 4-anaplastisk lymfom kinase genet.
A- (2) Immunoblotting analyse.
Vi undersøkte EGFR og ALK-ekspresjon i tumorcellene og effekten av erlotinib og crizotinib på fosforyleringen av EGFR og ALK ved Western blotting. Alle cellelinjer uttrykte EGFR. EGFR fosforylering ble undertrykt av erlotinib i HCC827. På den annen side, erlotinib ikke undertrykke fosforylering av EGFR i H1975 celler (Fig 1-c). H3122 cellene uttrykte ALK, og ALK fosforylering ble undertrykt av crizotinib (fig 1-d).
A- (3) CD-DST i humane lungekreftcellelinjer.
Cellen levedyktighet av hver lungekreft cellelinje etter eksponering til 0,2 mikrometer av erlotinib i 7 dager var 87,1 ± 0,56, 72,2 ± 5,20, 55,8 ± 8,1 og 0,63 ± 0,19% for H460, A549, H1975, og HCC827 cellelinjer, henholdsvis (n = 3 hver). HCC827 cellelinjen viste betydelig veksthemming etter eksponering for erlotinib (p = 0,028). På den annen side ble ingen vekst inhiberende virkning observert hos villtype-EGFR-cellelinjer med eksponering til 0,2 pM erlotinib (fig 1-e). Levedyktigheten av hver lungekreft cellelinjen etter eksponering for 0,6 uM crizotinib i 7 dager, var 93,7 ± 3,13 75,5 ± 7,43, og 20,1 ± 2,13% for H460, A549, og H3122 cellelinjer, henholdsvis (n = 3 hver), og H3122 viste signifikant hemming av cellevekst etter eksponering for crizotinib (fig 1-f).
B. Klinisk studie
Totalt trettifem (SDI: 23, CD-DST: 12) pasienter ble inkludert i studien (tabell 1). Fire av 24 tilfeller (16,7%) hos menn og sju av 11 tilfeller (63,6%) hos kvinner uttrykte EGFR mutasjon. Ved histologisk subtype, 8 av 11 tilfeller (72,7%) av den papillære adenokarsinom, 3 av 4 tilfeller (75%) av BAC; bronchiolo-alveolar carcnoma uttrykt i, og en av 7 tilfeller (14,3%) av acinar adenokarsinom uttrykt EGFR mutasjon.
B- (1) SDI for klinisk prøve.
Evaluering av den veksthemmende effekten av erlotinib med SDI-metoden viste at kreftcellen levedyktighet ble redusert konsentrasjonsavhengig i
EGFR
mutasjon-positive tilfeller, men neppe i
EGFR
-negative tilfeller selv ved høy konsentrasjon på opp til 20 mM (data ikke vist). I tillegg til etter eksponering erlotinib 20 uM, levedyktigheten til
EGFR
villtype tilfeller var 86,3 ± 11,2% mens det av mutantene var betydelig lavere ved 60,0 ± 9,8% (p = 0,0004, Fig 2- a).
Distribusjon kartet celleviabilitet evaluert i kirurgisk reseksjon frisk lungekreft vev ved hjelp av (a) SDI etter eksponering til 20 mikrometer erlotinib, med en sak uten
EGFR
mutasjon trykt av 20 mikrometer erlotinib og (b) CD-DST etter eksponering til 0,2 mikrometer av erlotinib. Statistisk signifikans ble observert i celleviabilitet mellom to grupper av
EGFR
mutasjons-positive og villtype (p = 0,026).
B- (2) CD-DST for klinisk prøve.
Etter eksponering til 0,2 mikrometer erlotinib, større livskraft til
EGFR
mutanter og vill-typer ble 33,5 ± 21,2 og 79,0 ± 18,6%, henholdsvis, og det var en signifikant forskjell i cellen levedyktighet (p = 0,026, fig 2-b). De representative CD-DST Resultatene av både
EGFR
mutant og vill-type saker er illustrert i figur 3. De data for EGFR mutasjonstatus og celleviabilitet av hvert kliniske pasienter som var vist i tabell S1.
CD-DST resultatene fra to representative tilfeller med kreftceller i hver dråpe dyrket med eller uten 0,2 mikrometer av erlotinib i 7 dager. Øverste raden viser fotografier av kollagen gel dråper som inneholder kreftceller, viser midterste rad dråper skannet ved hjelp av dedikerte bilde skanning system, og nederste raden viser dråper med elimineres fibroblaster farget svakere enn cut-off point. Tilfellet med exon 19 del i
EGFR plakater (venstre to kolonner) viser antall kreftceller ble redusert til 32,0% av ubehandlet kontroll når de utsettes for 0,2 mikrometer erlotinib. Pasient med
EGFR
villsettekasse (høyre to kolonner) viste 88,4% vekst sammenlignet med kontrollgruppen.
ROC kurve ble laget for å bestemme den cut-off verdi for å forutsi nærværet av
EGFR
mutasjoner fra vekstinhibering hastigheten for in vitro legemiddelsensitivitetstester [24]. I SDI test, arealet under kurven (AUC) for cellenes levedyktighet var 0,958 (figur 4-a). Forholdet viste den beste kombinasjonen av sensitivitet og spesifisitet for prediksjon av medikamentsensitivitet hos verdier 72,7% (93,3 og 100% sensitivitet og spesifisitet, henholdsvis). I CD-DST, ROC-kurven viste at AUC var 0,963 for cellenes levedyktighet (fig 4-b), mens den beste kombinasjonen av sensitivitet og spesifisitet for prediksjon av medikamentsensitivitet var på 55,9% (88,9 og 100% sensitivitet og spesifisitet, respektivt ).
(a) ROC kurver for celleviabilitet evaluert med SDI forutsi
EFGR
mutasjon som viser AUC for 0,958. (B) ROC kurver for celleviabilitet evaluert med kollagen gel dråpe forankret kultur medikament følsomhet test (CD-DST) i å forutsi
EGFR
mutasjon. AUC var 0,963.
Prospektivt, to pasienter med EGFR mutasjon fikk tilbakevendende sykdom etter denne studien. Cellen viabilities av kreft celler avledet fra disse pasientene var 55,6% og 31,4% med eksponeringen av erlotinib i CD-DST. Erlotinib utstilt de gode kliniske svarene for disse pasientene. Den ene pasienten hadde forstørrede metastatiske lymfeknuter. Etter 8 måneder med erlotinib behandling, metastatisk lymfeknute krympet fra 10,5 mm til 3,2 mm og SUV (standardisert opptak verdi) av 18F-FDG (18F-fluorodeoxyglucose) redusert 4,44 til 0,69. Virkningen ble bedømt som CR (fullstendig respons) radiologisk (figur 5-A). Den andre pasienten hadde pleural formidling med heving av CEA (carcinoembryonic antigen); en av de serologiske tumor markører for lungekreft. Som et resultat av erlotinib behandling, graden av CEA redusert 146,0 til 25,6 (ng /ml) (fig 5-b). Effekten av de molekylære rettet mot narkotika for pasienter med positiv følsomhet i in-vitro drugsensitivity tester og negative genet alterlation er å bli avslørt.
(a) Case # 1 hadde utstilt 55,6% av kreftcellevekst med erlotinib eksponering CD-DST. Kreften spredte seg til medianstinal lymfeknute (gule piler). Etter erlotinib behandling, mediastinale lymfeknuter krympet fra 10,5 mm til 3,2 mm i størrelse, og SUV av FDG redusert 4,4 til 0,69. (B) Case # 2 hadde utstilt 31,4% av kreftcellevekst med erlotinib eksponering i CD-DST, Pasienten forårsaket pleural formidling med høy grad av CEA. Erlotinib behandling resulterte i reduksjon av CEA 146,0 til 25,6 (ng /ml). 18F-FDG: 18F-fluorodeoxyglucose. PET: positoron emission tomography. SUV: standardisert opptak verdi. CEA. Carciono-emboryonic antigen
Diskusjoner
I denne studien, må vi først bekreftet at erlotinib og crizotinib viste doseavhengig veksthemming av dyrkede lungekreftceller. Den hemmende effekt av erlotinib var sterkere i lungekreftcellelinjer med
EGFR
mutasjon enn det var i de uten mutasjonen. Tilsvarende crizotinib viste sterkere hemming av lungekreft cellelinjer med en tilbakevendende genet fusjon mellom
EML4 Hotell og
ALK
enn det gjorde i de uten fusjonsgenet. For det andre viste vi at veksten hemmende effekt av erlotinib vurderes av enten SDI eller CD-DST var signifikant korrelert til
EGFR
mutasjonsstatus i den kliniske studien ved hjelp av kirurgisk resected lunge kreft vevsprøver. Cellekultur-basert in vitro legemiddelfølsomhetsanalyser kan være i stand til å forutsi følsomheten av kreftceller til ulike molekylære målet narkotika under utvikling for fremtidig klinisk anvendelse.
SDI utført på kliniske prøver viste veksthemming hos pasienter med
EGFR
mutasjon. Imidlertid SDI kreves høyere konsentrasjoner av erlotinib for inhibering celleproliferasjon enn det som vanligvis oppnås i blodet etter administrering av vanlige orale doser [25]. Videre SDI krevde mer enn seks sett med 1,0 × 10
6 celler, mens CD-DST krevde mindre enn 1,0 × 10
5 celler til å utføre undersøkelser. Med mindre mengde vev kravet, CD-DST påvirker neppe patologisk undersøkelse.
I CD-DST, viste erlotinib veksthemmende effekt med lavere konsentrasjon enn for MTS analysen. HCC827 cellevekst ble undertrykkes nesten fullstendig ved eksponering til 0,01 uM erlotinib, mens det av H460, A549 og H1975 cellene ble noe undertrykket etter eksponering for 0,2 uM, hvoretter den økte konsentrasjonen avhengig måte. Disse resultater antyder at CD-DST detektert forskjellen i de veksthemmende effekter i alle tilfeller ved en konsentrasjon av erlotinib så lav som 0,2 uM, noe som er lavere enn serumkonsentrasjoner av pasienter som regelmessig ble administrert 150 mg erlotinib daglig [25].
en kontroversiell resultat ble rapportert 0,35 mikrometer av gefitinib unnlatt å hemme tumorvekst hos pasienter som er mutasjon-positive i en tidligere studie som undersøkte sammenhengen av
EGFR
mutasjon og narkotika følsomhet ved bruk av CD DST [21]. Vår studie brukte PCM4 serumfritt dyrkningsmedium med reduserte vekstfaktorer i stedet for den konvensjonelle PCM2, dette kanskje grunnen til at resultatet vårt utstillings korrelasjon EGFR mutasjon med deres følsomhet vellykket. Men sammensetningen av PCM4 ikke frigjøres på grunn av beskyttede patent.
histoculture legemiddelrespons-analyse (HDRA), er en annen medikamentsensitivitet test som bruker en tredimensjonal kollagen gel, og dose-responskurve av gefitinib for lungekreft ble rapportert ved bruk av denne metoden. Men den undersøkelsen ikke omfatter korrelere
EGFR
mutasjon og effekter av gefitinib [26].
I fremtiden kan nye molekylære forandringer bli avdekket sammen med forventet utvikling av relevant molekylær målrettet legemidler for deres behandling. Derfor er det et presserende behov for å utvikle metoder som samtidig kan forutsi den kliniske respons til hver molekylær målrettede stoff til en rimelig pris. Nylige fremskritt i genetisk søketeknikker har aktivert rapportering av omfattende gene expression profilering systemer [27, 28]. Imidlertid er disse systemer som det uvanlig. Videre, for forutsigelse av følsomheten til ALK-inhibitorer,
EML4-ALK
skal påvises ved FISH eller IHC snarere enn genmutasjon analyse [29, 30]. Det er komplisert å utføre ulike typer screening er nødvendig for å påvise genet endringer. Cell-kultur basert in vitro vekstanalyser har fordel fordi de undersøke narkotika på samtidig. CD-DST i særdeleshet, har fordelen av å være å minimalisere volumet av kreftvev (3 mm isbiter) ved evaluering av kliniske prøve vev, sammenlignet med den SDI (10 mm terninger)
Study begrensninger:. I denne studien demonstrerte vi at in vitro-medikamentsensitivitet ble signifikant korrelert til
EGFR
mutasjonstatus. Men både
EGFR
mutasjon analyse og in vitro legemiddelfølsomhetsanalyser er de potensielle forutsi faktorer av kliniske tiltak mot EGFR-TKI behandling. Derfor gyldigheten av de forutsi faktorer bør til slutt vurderes ved å undersøke deres korrelasjon til kliniske respons, noe som krever avklaring i fremtidige prognose relaterte undersøkelser.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Kjennetegn på kliniske pasienter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0152665.s001 product: (PDF)
bekreftelser
Forfatterne ønsker å takke Prof. Kazuhiko Nakagawa av Institutt for Medical Oncology, Kinki Universitetet medisinske fakultet Osaka-Sayama, Japan og Dr. Isamu Okamoto av Research Institute for sykdommer i brystet, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, Fukuoka, Japan for bes gi lungekreft cellelinjer. Forfatterne erkjenner også Mr. Takehiro Tatenuma, Ms Mai Taguchi, og Ms Yoko Asakura for deres tekniske assistanse in vitro legemiddelfølsomhetsanalyser.
