Abstract
De fleste av prostatakreft (PCA) pasient som fikk androgen ablasjon terapi etter hvert utvikle kastrering resistent prostatakreft (CRPC). Vi har tidligere rapportert at androgen behandling undertrykker Skp2 og c-myc gjennom androgen reseptor (AR) og indusert G1 cellesyklus arrest i androgen-uavhengig LNCaP 104-R2 celler, et sent stadium CRPC cellelinje modell. Imidlertid er mekanismen for regulering av androgene Skp2 i CRPC-celler ble ikke fullt ut forstått. I denne studien undersøkte vi androgene regulering av Skp2 i to AR-positive CRPC cellelinje modeller, LNCaP 104-R1 og PC-3
AR Cells. Den tidligere en er et tidlig stadium androgen-uavhengig LNCaP celler, mens de senere ene er PC-3 celler gjen uttrykker enten villtype AR eller mutant LNCaP AR. Spredning av LNCaP 104-R1 og PC-3
AR-celler er ikke avhengig av, men blir undertrykket av androgen. Vi har observert i denne studien som androgen behandling reduserte protein ekspresjon av Cdk2, Cdk7, syklin A, cyclin H, Skp2, c-Myc, og E2F-1; minsket fosforylering av Thr14, Tyr15, og Thr160 på Cdk2; redusert aktivitet i Cdk2; indusert protein nivå av p27
Kip1; og forårsaket G1 cellesyklus arrest i LNCaP 104-R1 celler og PC-3
AR celler. Overekspresjon av Skp2 protein i LNCaP 104-R1 eller PC-3
AR celler delvis blokkert akkumulering av p27
Kip1 og økt Cdk2 aktivitet i henhold til androgen behandling, som delvis blokkert androgene undertrykkende effekt på spredning og cellesyklus. Analysere on-line-genet tabellens data av 214 normale og PCA prøver indikerte at genekspresjon av Skp2, Cdk2, og cyklin A positivt korrelerer med hverandre, mens Cdk7 negativt korrelert til disse genene. Disse observasjonene antydet at androgen undertrykker spredning av CRPC celler delvis gjennom hemming av cyclin A, Cdk2, og Skp2
Citation. Kokontis JM, Lin HP, Jiang SS, Lin CY, Fukuchi J, Hiipakka RA, et al. (2014) Androgen Undertrykker spredning av androgen reseptor-positiv Kastrering resistent prostatakreft celler via Hemming av Cdk2, CyclinA, og Skp2. PLoS ONE 9 (10): e109170. doi: 10,1371 /journal.pone.0109170
Redaktør: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, USA
mottatt: 17 juli 2014; Godkjent: 28 august 2014; Publisert: 01.10.2014
Copyright: © 2014 Kokontis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet av CA58073 og AT00850 fra National Institute of Health i U.S.A. for SL; CS-103-PP-14 (National Health Research Institutes), CA-103-SP-01 (Helse- og velferds), MEST 103-2325-B-400-001 (Ministry of Science and Technology) i Taiwan for CPC og Nasjonal Kjerne Facility Program for bioteknologi fra Taiwan (NSC 102-2319-B-400-001). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Tilsvarende forfatter Dr. Chih-Pin Chuu er en PLoS ONE Editorial styremedlem, men forfatterne bekrefte at dette ikke endrer tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
i 1941 Charles Huggins rapportert at androgen ablasjon terapi forårsaket regresjon av primær og metastatisk androgen-avhengig prostata cancer (PCA) [1]. Androgen ablasjon terapi, ved hjelp av luteiniserende hormon-frigjørende hormon agonister (LH-RH) eller bilaterale orchiectomy, har blitt en primær behandling for metastatisk prostatakreft [2]. De fleste pasientene opplever en innledende rask nedgang i PSA fulgt av en langsommere nedgang til nadir [2]. Men 80-90% av pasientene etter hvert utvikle kastrering resistent prostatakreft (CRPC) 12-33 måneder etter androgen ablasjon terapi med en samlet median overlevelse på 12-24 måneder [3]. Androgen reseptor (AR) spiller viktig rolle i utvikling, progresjon, og metastasering av prostata kreft [4]. Økning i AR mRNA og protein er observert i CRPC tumorer sammenlignet med de primære prostatakreft [5], [6].
LNCaP er en vanlig brukt cellelinje etablert fra en human lymfeknutemetastatisk svulst i prostata adenokarsinom. LNCaP-celler uttrykker androgenreseptoren (AR) og prostataspesifikt antigen (PSA) [7], [8]. Tidligere har vi utviklet PCA progresjon modell ved hjelp av LNCaP celler. Androgen-avhengige LnCap 104-S-celler ble dyrket i androgen-utarmet betingelser for å etterligne pasienter som behandles med androgen-ablasjon [9] – [11]. En liten populasjon av kastrerings-resistente celler heter LNCaP 104-R1 fremkom etter 10 måneder [9] – [11]. Etter ytterligere 8 måneder dyrking i androgen-utarmet medium, LNCaP 104-R1-celler ga opphav til LNCaP 104-R2-celler som prolifererte mye raskere enn 104-R1-celler [10]. Spredning av LNCaP-104 R1 og R2 104-celler er androgen-uavhengige, men blir undertrykket ved fysiologiske konsentrasjoner av androgen [9], [10], [12], [13]. LNCaP-104 R1 og R2 104-celler etterligne tidlige og sene CRPC celler, henholdsvis [14]. Etter androgen behandling, majoriteten av LNCaP 104-R1 og 104-R2 celler gikk G1 celle celler arrestere og døde til slutt med bare en liten populasjon av celler overlevde og fortsatte å vokse, heter R1Ad [10] og R2Ad [15], henholdsvis. Imidlertid proliferasjon av celler R1Ad er androgen-avhengig og kan styres av androgen ablasjon [12], mens proliferasjon av celler R2Ad er androgen-insensitive og reagerer ikke lenger hormonbehandling [15]. Derfor kan pasient med tidlig stadium CRPC svulster nytte av androgen behandling. Vi har tidligere rapportert at androgen behandling undertrykker S-fase kinase-assosiert protein 2 (Skp2) og c-myc gjennom AR i LNCaP 104-R2 celler, og dermed indusere G1 cellesyklus arrest og veksthemming [15]. Onkogene aktivitet og androgene regulering av c-myc er blitt studert intensivt. Imidlertid er androgene regulering av Skp2 i CRPC celler mindre forstått.
Skp2, en F-box protein, og dens kofaktor Cks1 er underlaget målretting subenheter av SCF (Skp1 /Cul1 /F-box protein) ubiquitin ligase kompleks. SCF er en E3 ubiquitin ligase kompleks som regulerer S-fasen oppføring av celler ved å fremkalle nedbrytning av cyclin-avhengige kinaser p21
Cip1 og p27
Kip1 [16], [17]. Skp2 mål p27
Kip1 av fosforylere p27
Kip1 på T187 for ubiquitinering og degradering [18] – [20]. Skp2 danner et stabilt kompleks med cyklin A-cyklin-avhengig kinase 2 (Cdk2) [20]. Skp2 blir fosforylert av Cdk2 ved Ser64 [20] og ved Akt ved Ser72 [21]. Fosforylering av Ser64 og Ser72 på Skp2 bidrar til stabilisering av Skp2 ved å forhindre dets assosiasjon med APC /CCdh1 [17], [18], [20], [21]. Både luminal og basal epitelceller i normal prostata viser svært lave Skp2 nivåer, men Skp2 nivåene øker dramatisk i både prostata intraepitelial svulst (PIN) og PCa [22], [23]. Oppregulering av Skp2 korrelerer til lavere p27
Kip uttrykk, høyere Gleason score, og mer avansert patologisk stadium av PCa [22], [24]. Oppregulering av Skp2 i PCa er også uavhengig assosiert med en høyere risiko for PCa tilbakefall etter kirurgi [22], [24]. Skp2 overekspresjon i PCA celler stimulerer PCa celleproliferasjon og øker tumorigenesis i xenograft tumor modell [25].
Cdk2 er medlem av cyclin-avhengig kinase familien av Ser /Thr proteinkinaser [26]. Kompleks av Cdk2-cyclin E er nødvendig for overgangen fra celler fra G1 til S-fasen, mens bindingen mellom Cdk2 og cyklin A er nødvendig for å komme seg gjennom S-fasen [26]. Aktivering av Cdk2 komplekser krever defosforylering av Thr14 og Tyr15 på Cdk2 av cdc25 fosfatase og fosforylering av Thr160 på Cdk2 [26], [27], som blir mediert av CAK, et kompleks av Cdk7 og cyclin H [28]. Cyklin A er et medlem av familien cyclin, en gruppe proteiner som fungerer ved regulering av progresjon gjennom cellesyklusen. Transkripsjon av cyklin A er tett regulert og synkronisert med cellesyklusprogresjon av transkripsjonsfaktoren E2F i en negativ tilbakekoplingssløyfe [29].
LNCaP-celler uttrykker en mutant AR (T877A) som viser avslappet ligandbinding spesifisitet [30 ], [31], vi dermed generert AR-positive PC-3 celler ved overekspresjon enten villtype AR (PC-3
AR) eller LNCaP mutant AR (PC-3
LNCaP-AR) i AR-negative PC-3 celler som andre CRPC celle heftelser. Vi brukte LnCap 104-R1-celler, en modell simulerer tidlig stadium CRPC, samt PC-3
AR og PC-3
LNCaP-AR-celler for å undersøke den androgene regulering av Skp2 og relaterte cyclin-avhengige kinaser ( CDK) samt celleproliferasjon i disse CRPC cellene.
Materialer og metoder
Material
Syntetisk androgen R1881 og antiandrogen Casodex (bikalutamid) ble hentet fra Perkin Elmer (Boston , MA, USA) og Astrazeneca (Wilmington, DE, USA), henholdsvis. [A-
32P] dCTP (3000 Ci /mmol) og [g-
32P] ATP (5000 Ci /mmol) var fra Amersham (Arlington Heights, IL, USA). Peptider ble syntetisert ved University of Chicago Cancer Research Center oligopeptide syntese studio.
Cell kultur
LNCaP 104-R1 celler og PC-3 underlinjer var gaver fra Dr. Shutsung Liao (The University of Chicago, IL, USA). LNCaP 104-R1-celler ble avledet fra paren androgen-avhengige LNCaP 104-S-celler, som ble generert fra LNCaP FGC klon (ATCC CRL-1740). De LNCaP 104-R1-celler og PC-3 underlinjer er blitt beskrevet i tidligere publikasjoner [10] – [13], [15], [32] – [34]. LNCaP 104-R1, PC-3, PC-3
AR, og PC-3
LNCaPAR celler ble opprett i DMEM med 10% trekull-strippet FBS (CS-FBS).
Western blotting analyse
LNCaP 104-R1-celler eller PC-3 underlinjer ble vasket med PBS og lysert i 2 x Laemmli-buffer uten bromfenol blått fargestoff. Proteinkonsentrasjonen i cellelysatene ble bestemt ved hjelp av Bradford-reagens (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Antistoff for Skp2 og p21
cip1 /waf1 var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffer for cyclin E, Cdk2, og fosfor-Cdk2 Thr160 var fra Cell Signaling (Danvers, MA, USA). Cyclin A og E2F-1-antistoffer var fra Millipore (Billerica, MA, USA). Den p27
Kip1 antistoff var fra BD Transduksjon Laboratories (Lexington, Kentucky, USA). Fosfo-Cdk2 Tyr15 og fosfor-Cdk2 Thr14 antistoffer ble kjøpt fra Epitomics (Burlingame, CA, USA). Cdk7 og Cyclin H var fra Abnova (Taipei, Taiwan). Påvisning av α-tubulin (Sigma, St. Louis, MO, USA) eller β-aktin (Novus, Littleton, CO, USA) ble brukt som kontroll lasting. For SDS-PAGE av Cdk2, justering av pH-verdien i skille gelbuffer til 8,5 var nødvendig for oppløsning av den hurtigere-migrering isoformen. Intensiteten av båndene for ulike proteiner ble kvantifisert med Epson Stylus TX130 bruker FN-SCAN-IT gel 6.1 software.
Celleproliferering analysen
LNCaP 104-R1 celler eller PC-3 underlinjer ble sådd på en tetthet på 3 x 10
3 celler /brønn i 96-brønners plater med 100 ul DMEM medium inneholdende 10% CS-FBS. Proliferasjonsanalyser ble utført som beskrevet tidligere [13], [15], [33] – [39]. Alle avlesninger ble normalisert til gjennomsnittet av kontroll tilstanden i hvert enkelt eksperiment. Forsøket ble gjentatt tre ganger. Ti brønner ble anvendt for hver betingelse. Middelverdien og standardavvik representerer gjennomsnittet og standardavvik henholdsvis av resultatene fra alle 30 brønner i de tre forsøkene.
flowcytometrisk analyse
Celler ble sådd med en tetthet på 5 x 10
5 celler i 6 cm retter. Flowcytometrisk analyse ble utført som tidligere beskrevet [13], [15], [35] -. [37], [39]
Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction
Total RNA ble isolert ved anvendelse av TRIzol Reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) og ble behandlet med DNase i (DNA-free; Ambion, Austin, TX). Revers transkripsjon ble utført med tilfeldige heksamer og Moloney murine leukemi virus revers transkriptase (Omniscript, Qiagen, Valencia, CA). Den TaqMan primer /probe er designet ved hjelp av Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, California). 5′-enden av proben ble merket med reporter-fluorescerende fargestoff FAM. 3′-enden av proben ble merket med fargestoff quencher TAMRA. Sekvensene til primerne CDKN1B, 5′-CCGGTGGACCACGAAGAGT-3 «og 5′-GCTCGCCTCTTCCATGTCTC-3′; CDKN1B sonde, 5»-AACCCGGGACTTGGAGAAGCACTGC-3 «. Real-time PCR ble utført på en ABI PRISM 7700 system (Applied Biosystems) ved hjelp av QuantiTect Probe PCR-protokollen (Qiagen). Den rRNA Styresettet (Applied Biosystems) ble anvendt for å normalisere transkripsjonsnivåer mellom prøvene.
Isolering av cDNA Skp2
A Skp2 cDNA ble isolert ved PCR-amplifisering fra et LNCaP 104-R1 Lambda ZAP- II cDNA-bibliotek ved å bruke de følgende primere avledet fra Skp2 sekvens: 5′-CAGCTCTGCAAGTTTAATGC-3 «og 5′-AAGAAGAGACACCATCCTGC-3». Følgende program ble anvendt: pre-amplifisering ved 94 ° C 5 minutter, 55 ° C 2 minutter, 30 sykluser av 72 ° C 2 minutter, 94 ° C 0,5 minutter, 55 ° C 0,5 minutter, etterfulgt av 7 minutter ved 72 ° C. Pfu (Stratagene) ble anvendt som DNA-polymerase og dimetylsulfoksyd ved 10% endelig konsentrasjon ble anvendt i amplifikasjonsreaksjonen. Et 1345 bp amplifikasjonsprodukt ble innsatt inn i EcoRV-spaltet pBluescript II vektor for automatisert dideoksy-sekvensanalyse. Ett Skp2 klon ble valgt for sekvensverifisering, og ble benyttet i alle etterfølgende eksperimenter. Den Skp2 cDNA ble overført fra denne pBluescript klone til pMV7 retroviral vektor for konstitutiv ekspresjon i LNCaP 104-R1 celler.
Stall retroviral infeksjon Skp2
104-R1 celler ble infisert med pMV7 retrovirus inneholder Skp2 innstikk som ble generert i ΦNX-Ampho emballasje celler ved hjelp av prosedyrene som er beskrevet tidligere [10]. Den ΦNX-Ampho emballasje cellelinje ble gitt av Garry Nolan ved Stanford University. Stabilt infiserte celler ble valgt av G418.
Uttrykk av GST-Skp2 protein
Smal-HindIII fragmenter av Skp2 cDNA ble satt inn i Smal-HindIII snitt pGEX-KG [40]. De plasmider ble transfektert inn i E. coli-BL-21-CodonPlus-RIL celler (Stratagene) for isopropyl thiogalactosid-indusert ekspresjon av glutation svovel transferase (GST) -Skp2 fusjonsproteiner.
In Vitro
assay av Cdk2 aktivitet
Cellelysater ble fremstilt av LNCaP 104-R1 celler infisert med virus MV7 tom og LNCaP 104-R1-celler som overuttrykker Skp2 dyrket i 3 dager i nærvær eller fravær av 10 nM R1881. Assay av Cdk2-aktivitet ved bruk av histon H1 som substrat ble tidligere beskrevet [10]. For Cdk2 fosforylering av et syntetisk peptid Skp2, to 12 rester peptider (GHPESPPRKRLK og GHPEAPPRKRLK) svarende til stillinger 60 til 71 av villtype-proteinet Skp2 og ble anvendt som substrater i kinase-reaksjoner med immunopresipitert Cdk2. Cellelysater ble gjort fra LNCaP 104-R1-celler dyrket i 4 dager i nærvær eller fravær av 10 nM R1881. Aliquoter av lysat (1 mg totalprotein) fremstilt som beskrevet tidligere [10] ble inkubert med 2 mg Cdk2 antistoff bundet til protein G-agarose perler. Etter vasking 3 ganger i lyseringsbuffer og 2 ganger i kinasebuffer (50 mM HEPES pH 7,5; 10 mM MgCl2, 0,5 mM DTT og 0,02% Triton X-100), kulene ble inkubert med 10 mCi [g-32P] ATP og 20 mM peptid i et totalt volum på 25 ml i 30 minutter ved 30 ° C. Reaksjoner ble avsluttet ved tilsetning av 3 ml 0,5 M EDTA og 10 ml aliquoter ble oppdaget på 2,5 cm P-81 filterskiver (Whatman). Plater ble vasket 5 ganger med 0,5% H3PO4 og en gang med 50% etanol /0,05% H3PO4 å fjerne unincorporated ATP. Innlemmede markør ble bestemt ved væske-scintillasjons-spektrofotometri. Blanks besto av kinase reaksjoner ved bruk av antistoff-lastet agaroseperler ikke inkubert med cellelysat. Reaksjonene ble utført i fire eksemplarer.
AR og Skp2 over-ekspresjon i PC-3-celler
PC-3-celler ble transfektert med LNCX-2-plasmid inneholdende vill-type human AR eller LNCaP-celler «mutant AR cDNA og valgt med neomycin G418 som tidligere beskrevet [32]. PC-3 celler overekspresjon villtype AR eller LNCaP mutant AR ble deretter betegnet som PC-3
AR eller PC-3
LNCaP-AR. PC-3
AR celler ytterligere transfektert med LPCX plasmid som inneholder Skp2 cDNA eller LPCX kontroll plasmid ble valgt med puromycin. Antibiotikaresistente kolonier ble utvidet og undersøkt for økt target protein uttrykk ved Western blot analyse.
Public domain data
Expression profiler av selektive gener fra datasett som inneholder svulsten og nærliggende normalt vev fra PCA pasienter, inkludert GSE6919 [41], som inneholder 23 normal prostata og 89 prostata karsinom vev og Singh prostata datasett [42], som inneholder 50 normale prostatakjertel prøver og 52 prostatakarsinom prøver, ble lastet ned fra Oncomine (http: //www.oncomine Com) uten ytterligere behandling.
data Analysis
data er presentert som gjennomsnittet +/- SD av minst tre forsøk, eller er representativt for forsøk gjentas minst tre ganger. Student t-test (to-tailed, paret) ble brukt til å evaluere den statistiske betydningen av resultatene fra spredning analyse eksperimenter.
Resultater
Androgen behandling trykkes spredning av AR-rik CRPC celler
Behandling med syntetisk androgen R1881 doseavhengig trykt celleproliferasjon av AR-rik LNCaP 104-R1, PC-3 overekspresjon villtype AR (PC-3
AR), og PC-tre overekspresjon LNCaP mutant AR (PC -3
LNCaPAR) celler, men ikke kontroll AR-negative PC-3-celler (PC-3
LNCX-2) (fig. 1A). Antiandrogen Casodex blokkert androgene undertrykkelse, som bekrefter at androgene hemming på celleproliferasjon var gjennom AR (Fig. 1a). Behandling med 10 nM R1881 redusert andel av cellepopulasjonen i S-fasen og indusert G1 fase cellesyklus arrest i LNCaP 104-R1, PC-3
AR, og PC-3
LNCaPAR celler, men ikke kontrollere PC-3
LNCX-2 celler (fig. 1B, 1C).
(A) LNCaP 104-R1 celler, PC-3 celler med kontroll plasmid LNCX-2 (PC-3
LNCX-2) , PC-3 celler overekspresjon villtype AR (PC-3
AR), og PC-3 celler overekspresjon LNCaP AR (PC-3
LNCaP-AR) ble behandlet med økende konsentrasjon av syntetisk androgen R1881 eller antiandrogen Casodex for 96 timer. Relative celleantall ble bestemt ved fluorometrisk DNA-analysen beskrevet i Materialer og Metoder, og ble normalisert til celletallet av kontrollcellene (ingen behandling). LNCaP 104-R1, PC-3
LNCX-2, PC-3
AR, og PC-3
LNCaP-AR-celler ble behandlet med eller uten 10 nM R1881 i 96 timer. Prosentandel av celle-populasjon av LNCaP 104-R1, PC-3
LNCX-2, PC-3
AR, og PC-3
LNCaP-AR celler i S-fasen (B) og G1 fase (C- ) ble bestemt ved PI-farging strømningscytometri. Verdier representerer gjennomsnitt +/- standard feil som stammer fra 5 uavhengige forsøk. Asterisk *, ** og *** angir signifikant forskjell
p
0,05,
p
0,01,
p
0,001, henholdsvis av behandlede celler sammenlignet med kontrollceller.
androgen behandling påvirker cellesyklus regulerende proteiner i CRPC celler
androgen behandling noe økt AR uttrykk, men dramatisk økt cellesyklusen inhibitor p27
Kip1 i LNCaP 104-R1, PC-3
AR, og PC-3
LNCaPAR celler (fig. 2). I den motsatte, redusert androgen behandling protein ekspresjon av Skp2, Cdk2, fosfo-Cdk2 Tyr15, fosfo-Cdk2 Thr14, fosfo-Cdk2 Thr160, Cdk7, cyklin A, cyclin H, og c-Myc i LNCaP 104-R1, PC-3
AR, og PC-3
LNCaPAR celler (fig. 2). Protein nivået av p27
Kip1 ble invers-korrelert til Skp2 i disse CRPC-celler, som var i overensstemmelse med det faktum at Skp2 rettet mot p27
Kip1 for ubiquitinering og degradering [18] – [20]. Overflod av p21
Cip1 ble svakt redusert i LNCaP 104-R1 celler, men ble økt i PC-3
AR og PC-3
LNCaPAR celler ved androgen. Overflod av E2F-en var litt redusert i LNCaP 104-R1 celler, men ble dramatisk redusert i PC-3
AR og PC-3
LNCaPAR celler ved androgen. Overflod av cyclin E ble ikke signifikant påvirket av androgen behandling. Aktivering av Cdk2 komplekser krever defosforylering av Thr14 og Tyr15 på Cdk2 av cdc25 fosfatase og fosforylering av Thr160 på Cdk2 [26], [27], som blir mediert av CAK, et kompleks av Cdk7 og cyclin H [28]. Selv fosforylering av Thr14 og Tyr15 ble litt redusert med androgen behandling, ble fosforylering av Thr160 dramatisk undertrykt av androgen behandling, muligens på grunn av reduksjon av Cdk7 og cyclin H protein uttrykk (Fig. 2). Androgen behandling økt p27
Kip1, cyclin A, og c-myc mens redusert p21
Cip1 og Skp2 i kontroll AR-negative PC-3
LNCX-2 celler. Siden androgen ikke påvirker spredning og cellecyklusprogresjonen av PC-3
LNCX-2 celler, rollene til disse proteinene i PC-3
LNCX-2 celler var ikke klart. Skp2 mål p27
Kip1 for ubiquitinering og degradering [18] – [20]. Men under behandling på 0,1 og 10 nM R1881, genekspresjon nivå av CDKN1B (p27
Kip1) økte 1,3 og 1,7 ganger i henholdsvis (figur 3A.). Som c-myc er blitt rapportert å undertrykke FOXO3a-mediert transkripsjon av CDKN1B [43], reduksjon av c-Myc forårsaket av androgen behandling kan bidrar til økningen av CDKN1B genekspresjon (fig. 2). Vi mener derfor at reduksjon av protein degradering og økning av gentranskripsjon begge bidratt til økningen av p27
Kip1 protein nivå, som kan derfor indusere G1 cellesyklus arrest i CRPC celler.
Protein uttrykk for AR, Skp2, Cdk2, fosfor-Cdk2 Tyr15, fosfor-Cdk2 Thr14, fosfor-Cdk2 Thr160, Cdk7, cyclin E, cyclinA, cyclin H, p21
CIP, p27
Kip, c-myc, og E2F-en var bestemt ved Western blotting-analyse i LNCaP 104-R1, PC-3
LNCX-2, PC-3
AR, og PC-3
LNCaP-AR-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av R1881 i 96 timer. Protein overflod av α-tubulin ble brukt som lasting kontroll.
(A) Gene uttrykk for CDKN1B ble bestemt i LNCaP 104-R1 celler behandlet med 0, 0,1, eller 10 nM R1881 i 96 timer ved hjelp QRT-PCR. LNCaP 104-R1-celler ble behandlet med 10 nm R1881 i nærvær eller fravær av 5 um anti-androgen Casodex i 96 timer. Stjerne * angir signifikant forskjell
p
0,05 av de behandlede celler sammenlignet med kontrollceller. (B) Relativ celle nummer ble bestemt ved fluorometrisk DNA-analyse. (C) Prosent av cellepopulasjonen i S-fase ble bestemt ved strømningscytometri-analyse. Stjerne * angir en signifikant forskjell (
p
0,05) av de behandlede celler sammenlignet med kontrollceller. (D) Histone H1 fosforylering ble analysert ved bruk av Cdk2 immunopresipitert fra cellelysat inneholdende 2 mg protein. Relativ radioaktivitet ble bestemt ved å skanne med en Storm 860 phosphoimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA). Proteinekspresjon nivå av Cdk2, p27
Kip1, og β-actin ble bestemt ved Western blotting av de samme cellelysatene. Overflod av β-aktin protein ble brukt som lasting kontroll.
Androgen behandling trykkes Cdk2 aktivitet
Cdk2 er en histon H1 kinase ansvarlig for fosforylering av histone under cellesyklusen overgangen fra G1 til S-fasen [44] – [46]. For å bekrefte at Cdk2 aktivitet ble undertrykt av androgen behandling, brukte vi histon H1 som substrat for den kinase aktivitetsanalyse. Reduksjon av celleproliferasjon (fig. 3B) og reduksjon i S-fasen cellepopulasjon (fig. 3C) i LNCaP 104-R1 celler forårsaket av androgen behandling var nært knyttet til nedgangen av Cdk2 aktivitet som påvist ved reduksjonen i fosforyleringen av histon H1, lessening av en raskere migrering form av Cdk2, og en økning av CDK inhibitor p27
Kip1 overflod (fig. 3D). Jo raskere-migrerende Cdk2 ble tidligere identifisert som en aktiv form for Cdk2 som fosforyleres ved Thr160 [47]. Antiandrogen Casodex behandling blokkerte effektene av androgen på celleproliferasjon, cellesyklus, fosforylering av histon H1, og aktiviteten av Cdk2 (fig. 3B, C, D).
Overekspresjon av Skp2 blokkert androgene undertrykkelse i LNCaP 104- R1 celler
Skp2 fosforyleres og aktiveres av Cdk2 [20], så vel som danner et stabilt kompleks med cyklin A og Cdk2 [20]. Vi har tidligere rapportert at overekspresjon av Skp2 delvis blokkert spredning av LNCaP 104-R2 celler [15]. I denne studien fant vi ut forholdet mellom overekspresjon Skp2 og Cdk2 aktivitet. Overekspresjon av Skp2 i LNCaP 104-R1 celler lettet androgene undertrykkelse av Cdk2 aktivitet som analyseres av
in vitro
fosforylering av histon H1 immunopresipitert med Cdk2 (fig. 4A). Måling av kinaseaktivitet i Cdk4 immunutfelninger fremstilt fra disse cellene viste ingen forskjell (data ikke vist). Overekspresjon av Skp2 i LNCaP 104-R1-celler partielt redusert induksjon av p27
Kip1 (fig. 4A), veksthemning (Fig. 4B), og G1 cellesyklus-stans (fig. 4C) forårsaket av androgen behandling. Den basale nivået av p27
Kip1 i Skp2-overuttrykt 104-R1-celler ble mye mindre sammenlignet med kontroll 104-R1-celler (Fig. 4A). Dette kan forklare hvorfor de 104-R1-celler som overuttrykker Skp2 proliferert 1,42 ganger raskere enn kontrollen 104-R1-celler (Fig. 4B).
(A) Protein ekspresjonsnivå av Skp2 og p27
Kip1 i LNCaP 104 R1-celler infisert med pMV7 tom retrovirus (kontroll) eller pMV7 retrovirus inneholdende Skp2 ble bestemt ved Western blotting. Celler ble dyrket i 3 dager i nærvær eller fravær av 10 nm R1881. Cdk2 aktivitet ble målt med
in vitro
fosforylering av histon H1 hjelp Cdk2 immunpresipitatene. Overflod av β-aktin protein ble brukt som lasting kontroll. (B) celle proliferasjon av LNCaP 104-R1 celler infisert med pMV7 tom retrovirus (kontroll) eller pMV7 retrovirus inneholdende Skp2 behandlet med eller uten 10 nM R1881 i 96 timer ble bestemt ved anvendelse av fluorometriske DNA-analyse og ble normalisert til cellen antall styre gruppe (ingen behandling). (C) Prosent av LNCaP 104-R1-celler i S-fase ble bestemt ved flow-cytometri. Celler ble dyrket i 3 dager i nærvær eller fravær av 10 nm R1881. Asterisk betegner en signifikant forskjell (
p
0,05) fra kontrollceller. (D) LNCaP 104-R1-celler ble behandlet med eller uten 10 nM R1881 i 3 dager. Fusjonsproteiner av kontroll GST (kolonnene 1-3) og bakterielt-uttrykt GST-Skp2 (sporene 4-6) bundet til glutation-agarose perler ble inkubert med 200 pg helcellelysater fra ubehandlede og androgen-behandlede 104-celler i R1 nærvær av 10 uCi [
32P] -ATP i 30 minutter ved romtemperatur. «Nl» representerer ikke som noen lysat. Fosforylerte proteiner ble eluert i Laemmli-gel lastebuffer og separert på en 10% SDS-PAGE-gel som deretter ble tørket og eksponert for Kodak X-OMAT AR film i 3 dager. (E) 104-R1-celler ble behandlet med eller uten 10 nM R1881 i 3 dager. Fosforylering av eluerte GST (kolonnene 1-3) og GST-Skp2 (kolonnene 4-6) fusjonsproteiner ble bestemt ved immunopresipitert Cdk2. Cdk2 ble immunopresipitert fra prøver av lysat som inneholdt 1 mg protein fremstilt fra ubehandlede (banene 2, 5 og 8) eller R1881-behandlede (banene 3, 6 og 9) 104-R1-celler. Kontroll baner (banene 1, 4 og 7) merket «ni» indikert ingen immunopresipitert Cdk2. Cdk2 aktivitet ble bestemt ved hjelp av metoder som er beskrevet i materialer og metoder.
Androgen regulerer fosforylering av Skp2 gjennom Cdk2
Dessverre, antistoffer oppdager fosforylering av Ser64 eller Ser72 på Skp2 ikke er kommersielt tilgjengelig . For å bestemme om androgen behandling påvirker fosforylering av Skp2, vi inkubert bacterially-uttrykt GST-fusjonsproteiner Skp2 bundet til glutation-agarose perler med helcellelysater fra ubehandlede og androgen-behandlede LNCaP 104-R1-celler i nærvær av [g-
32P] ATP. Vi fant at lysat fra androgen-behandlede 104-celler som inneholdt mindre R1 kinase-aktivitet er i stand til å fosforylere på 74 kDa GST-Skp2 fusjonsproteiner sammenlignet med lysat fra ubehandlede celler (fig. 4D). Dette resultatet indikerer at androgen behandling reduserte totale fosforylering på Skp2. Vi undersøkte om Cdk2 faktisk phosphorylate Skp2. Når GST-Skp2 fusjonsproteiner ble anvendt som substrater i kinase-reaksjoner med Cdk2 immunoutfelt fra LNCaP 104-R1 cellelysater, ble lignende resultater observert som det av fig. 4D (fig. 4E). Dette resultat viste at Cdk2 fosforylert Skp2 og aktiviteten av Cdk2 til å fosforylere Skp2 ble undertrykket ved androgen behandling i LNCaP 104-R1-celler.
Overekspresjon av Skp2 blokkert androgene undertrykkelse i PC-3
AR og PC- 3
LNCaPAR celler
i likhet med LNCaP 104-R1 celler, overekspresjon av Skp2 delvis blokkert doseavhengige effekter av androgene hemming på celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon av PC-3
AR-celler ( fig. 5).
(A) Protein ekspresjon av Skp2 ble analysert ved Western blotting i PC-3-celler gjen uttrykker villtype AR (PC-3
AR) celler og overuttrykker enten kontroll eller vektor Skp2 i fravær eller nærvær av 10 nM R1881 i 96 timer. Effekt av androgen på celleformering (B) eller cellesyklusprogresjon (C) av disse klonene som ble behandlet med økende konsentrasjon av R1881 i 96 timer ble bestemt ved 96-brønners proliferasjonsanalyse og PI-farging strømningscytometri-analyse, respektivt. Stjernene * og ** angir en signifikant forskjell
p
0,05 og
p
. 0,01, henholdsvis mellom behandling og kontrollcellene
korrelasjon mellom Skp2, Cdk2, cyklin A, og Cdk7 i PCA tumorer
i henhold til det faktum at ekspresjon og aktivitet av Skp2 reguleres av Cdk2 og cyklin A i PCA-celler, og at Skp2, Cdk2, og cyklin A koordinert regulere celleformering i PCA celler, hypotese vi at genuttrykk nivå av Skp2 (SKP2), Cdk2 (CDK2), og cyclin A (CCNA2) kan vise god positiv korrelasjon i PCA svulster. Faktisk analyse av oncomine data indikerte at genekspresjon nivået av SKP2, CDK2, og CCNA2 positivt korrelert godt i begge GSE6919 [41] (fig. 6A) og Singh prostata tumor datasett [42] (fig. 6B). Som fosforylering av Thr160 på Cdk2 formidles av Cdk7 [28], bestemt vi om genuttrykket til CDK7 korrelert til CDK2, SKP2, og CCNA2 i PCA svulster. Overraskende, genekspresjon av CDK7 negativt korrelert til CDK2, SKP2, og CCNA2 i begge GSE6919 [41] (Fig. 7A) og Singh prostata svulst datasett [42] (Fig. 7b).
Spredningsplott som viser sammenhengen av indikert gener i GSE6919 (A) og Singh prostata datasett (B). R verdien angitt korrelasjonskoeffisient. Probe ID for CCNA2, CDK2, og SKP2 var 40697_at, 1792_g_at, og 1941_at i GSE6919, og 1943_at, 1792_at, og 39449_at i Singh prostata datasett.
Spredningsplott som viser korrelasjon av indikert gener i GSE6919 ( A) og Singh prostata datasett (b). R verdien angitt korrelasjonskoeffisient.
