Abstract
15-deoksy-delta-12,14-prostaglandin-J
2 (15d-PGJ
2), en arakidonsyre metabolitt og en naturlig PPARy agonist, er kjent for å indusere apoptose i tumorceller. I denne studien undersøkte vi nye terapeutiske potensialer av 15d-PGJ
2 ved å bestemme dens anticancer-effekter i villtype og doxorubicin-resistente ovarian carcinoma celler. Til tross for høy ekspresjon av resistens-induserende gener som MDR1, BCL2 og Bcl-xl, 15d-PGJ
2 sterkt indusert apoptose i doxorubicin-resistente (A2780 /AD) celler i likhet med vill-type (A2780). Dette ble funnet å være relatert til kaspase-3 /7- og NF-kB reaksjonsveier, men ikke til dens PPARy-agonistisk aktivitet. 15d-PGJ
2 også var i stand til å redusere motstanden av doxorubicin A2780 /AD-celler ved lave doser som bekreftet ved inhibering av genekspresjon av MDR1 (p-glykoprotein) og SIRT1 (et medikament senescens genet). Vi undersøkte også effekten av 15d-PGJ
2 på cellemigrasjon og transformasjon ved hjelp av en sårhelende analysen og morfologiske analyser, henholdsvis. Vi fant ut at 15d-PGJ
2 hemmet migrasjon mest sannsynlig på grunn av NF-kB hemming og indusert transformasjon av runde formen A2780 /AD celler i langstrakte epitelceller grunn HDAC1 hemming. Ved hjelp av en 15d-PGJ
2 analoge, har vi funnet virkningsmekanismen til disse nye aktiviteter 15d-PGJ
2 på SIRT1 og HDAC1 genekspresjon og enzymaktivitet. Konklusjonen er at denne studien viser at 15d-PGJ
2 har en høy terapeutisk potensial til å drepe resistente kreftceller, og den nylig beskrevet hemmende virkningene av dette cyklooksygenase produktet på SIRT1 og HDAC vil gi nye muligheter for kreft therapeutics
Citation:. de Jong E, Winkel P, Poelstra K, Prakash J (2011) kreft effekter av 15d-prostaglandin-J
2 i Wild-Type og Doxorubicin-Resistant eggstokkreft celler: Novel handlinger på SIRT1 og HDAC. PLoS ONE 6 (9): e25192. doi: 10,1371 /journal.pone.0025192
Redaktør: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians-universitetet, Tyskland
mottatt: 26 april 2011; Godkjent: 29 august 2011; Publisert: 21.09.2011
Copyright: © 2011 de Jong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av EU-prosjektet Innovativ handlingsprogrammet Groningen, Nederland, og etter en Vici stipend fra den nederlandske Technical Foundation (STW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
prostaglandiner (PG) er en familie av biologisk aktive endogene metabolitter av arakidonsyre. De kontrollerer et stort utvalg av fysiologiske funksjoner slik som regulering av glatt muskeltonus, inflammasjon, cellevekst og differensiering [1]. 15-deoksy-Δ
12,14-prostaglandin J
2 (15d-PGJ
2) er et derivat av dehydrering PGD
2, som også er kjent som en naturlig agonist av den nukleære reseptor peroksisom proliferator-aktivert reseptor gamma (PPARy). 15d-PGJ
2 har blitt rapportert å vise flere farmakologiske aktiviteter (anti-inflammatorisk, anti-fibrotiske og apoptotiske aktiviteter) enten gjennom PPARy avhengige trasé eller PPARy-uavhengige trasé som Nuclear Factor-kappaB (NF-kB) – , Keap-Nrf2-, STAT1, og p53-avhengig trasé [2], [3]. I vår siste undersøkelse, har vi vist at 15d-PGJ
2 var i stand til å hemme tumorprogresjon betydelig
in vivo
i tumorbærende mus. Dens effektivitet ble funnet å være styrt av sin sterke men reversibel serumalbumin binding og ved den etterfølgende gjennomtrengning av albumin i de tumorene som var avhengig av tumorvaskulatur [4]. Også andre grupper har rapportert anti-tumoraktiviteten til 15d-PGJ
2 in vivo i forskjellige tumormodeller [5], [6]. Disse resultater antyder at en potensiell bruk av 15d-PGJ
2 for terapeutiske formål som et anticancermiddel kan tenkes.
Vi har vist at 15d-PGJ
2 induserer apoptose i forskjellige kreftceller via PPARy-uavhengig NF-kB og kaspase-avhengige reaksjonsveier [4], som også er vist av andre studier [7], [8]. Å vite involvering av NF-kB bane i reguleringen av multimedikamentresistens (MDR1) og anti-apoptotiske gener (Bcl-2 og Bcl-xl) [9], vi nå som mål å undersøke hvorvidt 15d-PGJ
2 er i stand for å indusere apoptose i doxorubicin-resistente kreftceller sammenlignet med vill-type. Vi videre undersøkt om effekten indusert av 15d-PGJ
2 ble formidlet gjennom PPARy avhengige og /eller NF-kB-avhengige veier. Chu og medarbeidere har vist at Stille Informasjon regulator, type 1 (SIRT1), en klasse III histon-deacetylase (HDAC), er over-uttrykt i forskjellige kjemoresistent tumorer i kreftpasienter og hemming av SIRT1 genekspresjon som fører til reduksjon i MDR1 ekspresjon og økning i medikamentsensitivitet [10]. Vi sammenlignet derfor SIRT1 uttrykk i menneskelig villtype og doksorubicinresistente eggstokkreft kreftceller og undersøkte effekten av 15d-PGJ
2 på denne SIRT1 genuttrykk. I løpet av disse forsøkene, la vi merke til at 15d-PGJ
2-behandlet doksorubicin-resistente celler transformert fra runde-formet celler til en langstrakt type. Vi undersøkte videre denne fenotypisk endring og funnet ut at 15d-PGJ
2 indusert disse effektene ved å hemme klasse-I HDAC enzymer. Mange farmakologiske aktiviteter 15d-PGJ
2 f.eks inhibering av PPARy, NF-kB, p53 og NRF-keap trasé blir indusert ved å lage et stabilt kompleks med frie cystein i disse proteinene gjennom en av de elektrofile karbonatomer [11]. For å avgjøre om hemmende effekter av 15d-PGJ
2 på SIRT1 og HDACs ble også knyttet til sistnevnte mekanismen, vi utført flere
in vitro
eksperimenter ved hjelp av en analog av 15d-PGJ
2 . Våre resultater viser mange nye aktiviteter av denne endogene arachidonsyremetabolitt på kreftceller og belyse virkningsmekanismen av cyklooksygenase produktet.
Metoder
Cell eksperimenter
Wild -type (A2780) og doxorubicin-resistente (A2780 /AD) menneskelige ovarialcancer cellelinjer ble hentet fra University Medical Centre Groningen, Nederland. A2780 og A2780 /AD (doxorubicin-resistent) cellelinjer ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, BioWhittaker, Verviers, Belgia) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) og antibiotika (penicillin, 50 enheter /ml pluss streptomycin, 50 ng /ml) ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2. A2780 /AD-celler ble dyrket i nærvær av doksorubicin (2 uM). To uker før forsøkene en separat kolbe av doxorubicin-resistente celler ble opprettholdt uten doksorubicin. Disse cellene ble brukt for videre eksperimenter for å unngå påvirkning av doksorubicin på våre eksperimenter. Siden 15d-PGJ
2 in vitro taper sin aktivitet i nærvær av FCS, ble alle forsøk utført i FCS-fritt medium.
cellenes levedyktighet studier.
Cellene ble sådd ut i 96-brønns plate som 1 x 10
4 celler /brønn i 200 ul medium med 10% FCS. Etter 48 timer ble cellene vasket med serumfritt medium og deretter inkubert med forskjellige konsentrasjoner av 15d-PGJ
2 i serumfritt medium i 48 timer. Ved behandling med den irreversible PPARy-antagonist GW9662 (2-klor-5-nitrobenzanilide, sigma), cellene ble pre-inkubert med GW9662 (10 uM) i 3 timer og deretter inkubert med en blanding av 15d-PGJ
2 (Cayman kjemikalier, Ann Arbor, Michigan) og GW9662 i 48 timer. Levedyktighet av cellene ble bestemt ved bruk av Alamar blå fargestoff (Serotec, Oxford, UK) som måler det antall celler på basis av mitokondriell aktivitet. Etter 48 timer av inkubasjon ble medium inneholdende Alamar blue fargestoff (fortynnet 1:10) tilsatt til cellene og inkubert i ytterligere 4 timer. Deretter metaboliseres fargestoff (fluorescerende) ble oppdaget med en fluorimeter på Eksitasjon 560 nm og Emission 590 nm.
caspase 3/7 enzymanalyser.
Caspase-3 og -7 enzymer aktivitet ble bestemt ved hjelp av caspase 3/7 Glo analysen kit (Promega, Medison, WI). 1 x 10
4 celler ble sådd i 96-brønners plate i 200 ul dyrkningsmedium. Etter 48 timer ble cellene vasket med serumfritt medium og inkubert med forskjellige konsentrasjoner av 15d-PGJ
2 i 100 ul medium i 5,5 timer. Deretter ble 100 ul av caspase 3/7-rekonstituert reagens tilsatt til cellene og inkubert i 30 minutter i inkubatoren. Den luminescens ble bestemt ved et luminometer (Lumicount, Packard, Meriden, CT).
Annexin V-farging.
Annexin V-farging ble utført på cellene for å bestemme induksjonen av apoptose etter behandling med 15d-PGJ2. 1 × 10
4 celler ble sådd i en åtte-brønns plate (Lab-tek, Nunc, Roskilde, Danmark) i 400 ul dyrkningsmedium. Etter 72 timer ble cellene vasket med serumfritt medium og inkubert med forskjellige konsentrasjoner av 15d-PGJ
2 i 200 ul medium i 6 timer. Deretter ble cellene inkubert med 100 ul av annexin V-FITC (Roche, Mannheim, Tyskland) i 15 minutter ved romtemperatur, vasket og fiksert med 4% paraformaldehyd. Deretter ble cellene montert med DAPI holdig monteringsløsning og farging ble undersøkt under et fluorescerende mikroskop.
Gene uttrykk studien.
1 × 10
5 celler per brønn ble sådd i 12 -godt plate og dyrket i 48 timer og deretter inkubert med forskjellige forbindelser i 48 timer. Cellene ble lysert ved hjelp av en lysebuffer og RNA ble isolert ved hjelp Absolutt RNA microprep kit (Stratagene, La Jolla, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA-konsentrasjonene ble kvantifisert ved hjelp av et UV-spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE). Deretter cDNA ble syntetisert fra like mengder av RNA ved hjelp av Superscript III første tråd syntese-sett (Invitrogen, Carlsbad, CA). De primere for menneskearten ble oppnådd fra Sigma-Genosys (Haverhill, UK). Primersekvensene er vervet i Tabell 1. genuttrykk nivåer for forskjellige gener ble målt ved hjelp av kvantitativ real-time RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) med SYBR Grønn som en fluorescerende probe (Applied Biosystems). Til slutt ble de terskel syklusnummer (CT) som brukes til å beregne den genekspresjon for hvert mål ved normalisering til huset-holder genet GAPDH.
Transfeksjon og Luciferase-analyse for NF-kB aktivitet.
NF-kB aktivitet ble bestemt ved bruk av et luciferase reporter basert analyse som beskrevet tidligere [4]. I korte trekk, PNF-kB-Luc (Clontech, Mountain View, CA) inneholdende en spesifikk bindingssekvens for NF-kB og en tom Luciferase plasmid, pTAL-Luc (kontroll) ble anvendt for transfeksjon studier. 1 x 104 celler per brønn ble sådd ut i hvite 96-brønners plater, og transfeksjon av plasmider ble utført ved anvendelse Fugene 6 transfeksjon reagens (Roche) etter 24 timer. Celler ble behandlet med et kompleks av 0,17 ug DNA /0,5 ul Fugene 6 i 100 ul normal media med 10% FCS i 24 timer. Deretter ble cellene vasket med serumfritt medium og inkubert med 15d-PGJ
2, BAY 11-7082 (Sigma), ciglitazon med eller uten TNF-α (Peprotech, Rocky Hill, NJ) i 4 timer. Deretter ble cellene vasket med PBS og lysert med 20 pl cellelyseringsbuffer, og supplert med 100 ul Luciferase substrat (Promega). Luciferase-aktivitet ble målt med et luminometer (Lumicount, Packard). De luminescens andelsverdier av PNF-kB-Luc ble nøytralisert ved å trekke pTAL-Luc verdier.
sårtilheling analysen.
1 × 10
5 celler per brønn ble sådd i 12 -godt plate og dyrket i 48 timer i dyrkningsmedium. Deretter ble en ripe (sår) introdusert i konfluent celle laget ved hjelp av en gul spiss plasseres i et stillas, slik at standardisering av scratch. Cellene ble vasket tre ganger med medium for å fjerne frigjorte celler. Cellene ble deretter inkubert med forskjellige forbindelser i 48 timer, og bilder av en definert viklet flekk ble gjort med datamaskinassistert fasekontrast-mikroskop (Olympus) ved t = 0, 24 og 48 timer. Arealet av såret i de mikroskopiske bildene ble målt ved hjelp av Image J programvare (National Institutes of Health, MD) ved ulike tidspunkt. Den prosentvise sårheling etter 24 timer eller 48 timer ble beregnet i forhold til det totale sårområdet ved t = 0 h av den samme såret sted.
SIRT1 og HDAC1 enzymaktivitetsanalyser.
SIRT1 og HDAC1 enzymhemming ble utført for å bestemme effekten av 15d-PGJ2 på sin virksomhet ved hjelp av kommersielle kits fra Cayman Chemicals (Ann Arbor, Michigan). De SIRT1 og HDAC1 enzymanalyser ble utført i mikro i henhold til produsentens instruksjoner. For det første undersøkelsesbuffer, SIRT1 eller HDAC1 enzym og løsningsmidlet (DMF) eller forskjellige konsentrasjoner av behandlinger (15d-PGJ2 eller CAY-10410 oppløst i DMF) ble blandet. CAY-10410 (9,10-dihydro-15-deoksy-Δ
12,14-Prostaglandin J
2), en analog av 15d-PGJ
2, ble kjøpt fra Cayman kjemikalier. Deretter ble substratet består av p53-sekvensen Arg-His-Lys-Lys (e-acetyl) -AMC peptid og ko-substrat NAD + til SIRT1 aktivitet tilsatt til enzymblanding og inkubert ved romtemperatur i 45 min. For å måle HDAC1 aktivitet, ble et acetylert lysin substrat tilsatt til enzymblanding og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter stopp /fremkallingsløsningen, inneholdende en blanding av en utvikler, og nikotinamid (SIRT1 inhibitor) eller Trichostatin A (HDAC1 inhibitor) ble tilsatt til mikroplate og inkubert i 30 minutter og 15 minutter, henholdsvis ved værelsestemperatur. Deacetylert peptid reagerer med utbygger og lanserer en fluorophore. Fluoroforene for begge analyser ble analysert under anvendelse av en eksitasjonsbølgelengde på 350 nm og en emisjonsbølgelengde på 450 nm. 100% aktivitet av enzymet ble beregnet ved å inkubere med DMF alene, og den prosentvise inhibering av SIRT1 eller HDAC1 aktivitet ble beregnet i forhold til de tilsvarende oppløsningsmiddelkonsentrasjoner.
Statistiske analyser
Data er presentert som gjennomsnitt ± standardfeil (SEM), med mindre annet er nevnt. De statistiske analyser ble utført ved anvendelse av uparede to-halet t-test med
p
0,05 som det minimale nivå av betydning. Cell-levedyktighet data ble montert i henhold til sigmoidal dose-responskurve for å beregne IC
50 ved bruk av GraphPad Prism 4 programvare (La Jolla, California).
Resultater
15d-PGJ
2 induserer apoptose i begge A2780 og A2780 /AD celler PPARy-uavhengig
Vi bekreftet at A2780 /AD-celler er svært motstandsdyktig mot doksorubicin i forhold til villtype-A2780-celler som IC
50 av doksorubicin i A2780 og A2780 /AD var 1,3 og 120 mikrometer, henholdsvis (fig 1A.). Men behandling med 15d-PGJ
2 forårsaket celledød i begge A2780 celler (IC
50 = 4,3 mikrometer) og A2780 /AD celler (IC
50 = 2,6 mm) etter 48 timers inkubering. 15d-PGJ
2 er et kjent PPARy-agonist, men vi har funnet at induksjon av celledød i begge celletyper var PPARy-uavhengig som forbehandling med den irreversible PPARy-antagonist GW9662 ikke reversere effektene av 15d-PGJ
2 verken i vill-type (fig. 1B) og heller ikke i resistente (fig. 1C) cellelinjer. Videre har vi funnet at 15d-PGJ
2-indusert apoptose i både villtype og doxorubicin-resistente celler gjennom aktiveringen av caspase reaksjonsveien som caspase-3/7 enzymaktiviteter ble signifikant indusert ved 15d-PGJ
2 i disse celler etter 5,5 timers inkubering (fig. 1D). Selv om A2780 /AD (-resistente celler) var noe mer følsomme overfor 15d-PGJ
2 i cellelevedyktigheten assay, var noe lavere induksjon av caspase-aktivitet i disse cellene i forhold til A2780-celler, noe som indikerer deltakelse av kaspase-uavhengige analyser. Induksjon av apoptose i disse celler, ble også bekreftet med annexin V-farging, en markør for tidlig apoptose. Vi har funnet at begge celletyper ble positiv for annexin V-farging (grønt) etter behandlingen med 15d-PGJ
2 og antallet av positive celler ble øket ved høyere konsentrasjoner i begge cellelinjer (fig. 1E).
(A) doksorubicin drept A2780 celler helt 5 mikrometer, mens A2780 /AD celler var svært motstandsdyktig mot doxorubicin. I motsetning til dette, 15d-PGJ
2-indusert celledød i både villtype A2780 (B) og doxorubicin-resistente A2780 /AD (C) cellelinjer doseavhengig etter 48 timer. Disse effektene var ikke PPARy avhengige som pre-inkubasjon med en irreversibel PPARy antagonist GW9662 (10 mm) ikke blokkere disse effektene. Data er presentert som% av kontroll som ble beregnet ved å anta ubehandlede celler 100% levedyktige som bestemt ved Alamar blue analysen. (D) 15d-PGJ
2 forbedrede kaspase 3/7 enzymer aktivitet (ved t = 5,5 h) i begge celletyper i en konsentrasjonsavhengig måte. Data representerer middelverdi ± SEM av gjennomsnittet av minst 3 separate eksperimenter. Forskjeller versus kontroller er vist som *
p
0,05, **
p
0,01. (E) Representative mikrofotografier som viser annexin V-farging (grønt), en indikator på apoptose-induksjon, på A2780 og A2780 /AD cellelinjer etter behandlingen med 15d-PGJ
2-konsentrasjon avhengig. DAPI farging (blå farge) indikerer det totale antall celler. Forstørrelse, 200 ×. Boksene viser bildene ved høyere forstørrelse på 480 ×.
15d-PGJ
2 induserer apoptose ved å hemme NF-kB veien
Siden apoptose indusert av 15d-PGJ
2 var PPARy-uavhengig, vi undersøkte involvering av NF-kB vei, en viktig regulator av celle overlevelse og spredning, i A2780 og A2780 /AD celler ved hjelp av NF-kB luciferase reporter analysen. Vi indusert NF-kB aktivitet i disse celler med humant rekombinant TNF-α som er en direkte aktivator av NF-kB pathway. Vi har funnet at behandling med TNF-α (100 ng /ml) signifikant forbedret NF-kB aktivitet i begge celletyper, men mer utpreget i A2780 (13 ganger) i forhold til A2780 /AD (6,0-fold) (Fig. 2A) . Behandling med 15d-PGJ
2 betydelig redusert basal og TNF-α-indusert NF-kB aktivitet i begge celletyper på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 2B og 2C). Likevel, den hemmende effekten var sterkere i A2780 /AD enn A2780 som kan bli lagt merke til på 2,5 og 5,0 mikrometer konsentrasjoner. Disse data indikerer at apoptose-induserende virkninger av 15d-PGJ
2 ble formidlet via NF-kB pathway. I tillegg hadde ikke PPARy agonist ciglitazon ikke hemmer den basale NF-kB aktivitet ved 10 uM konsentrasjon, men bare ved høyere konsentrasjoner. I videre forsøk med ciglitazon vi brukte derfor konsentrasjoner som overtale bare PPARy-spesifikke effekter (EF
50 = 3,0 mikrometer) [12] og ikke NF-kB-medierte effekter. Et velkjent NF-kB-spesifikke inhibitor, det vil si BAY-11-7082 inhiberte NF-kB aktivitet i begge celletyper på lignende måte, og denne inhibitor ble anvendt i ytterligere forsøk for å bestemme virkningen av NF-kB-inhibering i disse celler.
for å måle NF-kB aktivitet, ble begge A2780 og A2780 /AD celler transient transfektert med et plasmid som inneholder NF-kB arrangøren med en luciferase reporter element (PNF-kB-Luc) i 24 timer. Etter 24 timer, 15d-PGJ
2, ciglitazon eller BAY-11-7082 ble inkubert med og uten TNF-α i 4 timer og deretter luciferaseaktivitet ble målt ved anvendelse av en luminescens analyse for å bestemme den NF-kB aktivitet. (A) NF-kB veien aktivator, TNF-α (100 ng /ml), induserte NF-kB aktivitet i begge celletyper selv om økningen var høyere i A2780 celler. Behandling med 15d-PGJ
2 i betydelig grad hemmet NF-kB aktivitet både A2780 (B) og A2780 /AD-celler (C) som var mer uttalt i TNF-α-aktiverte celler. Ciglitazon hemmet NF-kB bare ved høyere konsentrasjoner eller i TNF-a-aktivert A2780 /AD-celler. BAY-11-7082 hemmet NF-kB aktivitet i begge celletyper med tilsvarende effekt. Data representerer gjennomsnittet av minst 3 separate eksperimenter. Statistiske forskjeller versus de respektive kontrollene er vist som *
p
0,05 og **
p
. 0,01
15d-PGJ
2 reduserer mRNA uttrykk av Bcl-2, BCL-XL, MDR1 og SIRT1
Etter genekspresjon analyser, fant vi at A2780 /AD celler hadde betydelig induksjon av anti-apoptotiske gener som BCL-2 (120- fold) og Bcl-xl (to ganger) sammenlignet med ikke-resistente A2780 celler (fig. 3A). Behandling med lave konsentrasjoner av 15d-PGJ2 (1,0 og 2,5 mm) for 48 timer redusert Bcl-2 og Bcl-xl uttrykk nivåer i A2780 /AD sterkere enn i A2780 celler (fig. 3a), som også kan forklare den høyere celledød potens i A2780 /AD celler. Disse effektene var ikke på grunn av PPARy-agonistisk aktivitet eller NF-kB inhiberende virkninger av 15d-PGJ
2 som den velkjente PPARy agonist ciglitazon og selektiv NF-kB-inhibitor hadde liten effekt i forhold til 15d-PGJ
2 (fig. 3A).
(A) A2780 /AD celler hadde høyere genuttrykk av Bcl-2 og Bcl-xl i forhold til A2780 celler. Effekter av 15d-PGJ
2, ciglitazon og BAY-11-7082 på genekspresjon ble bestemt etter 48 timers inkubering i begge celletyper. A2780 /AD-celler hadde også høyere ekspresjon av MDR1 (B) og SIRT1 (C) i forhold til A2780-celler. MDR1 genuttrykk var ikke påviselig (ND) i A2780 celler. Effekter av 15d-PGJ
2, ciglitazon og BAY-11-7082 på MDR1 uttrykk ble bestemt bare i A2780 celler (B), mens effektene på SIRT1 uttrykk ble målt på begge celletyper (C). Data representerer middelverdi ± SEM i minst 3 eksperimenter. Statistiske forskjeller versus de respektive kontrollene er vist som *
p
0,05 og **
p
. 0,01
I tillegg har vi funnet at det ble en oppregulering av multiresistens (MDR1) og klasse III-HDAC Sirtuin-2 homologen (SIRT1) mRNA-ekspresjon i doxorubicin-resistent A2780 /AD-celler sammenlignet med villtype-A2780-celler (fig. 3B og 3C). MDR1 nivåene i A2780 celler var under deteksjonsnivå. Interessant, behandling med 15d-PGJ
2 vesentlig hemmet MDR1 uttrykk i resistente celler og disse effektene ble mest sannsynlig tilskrives den NF-kB hemmende effekter som BAY-11-7082 også hemmet uttrykket, mens ciglitazon hadde ingen effekt (fig. 3B). 15d-PGJ
2 også hemmet SIRT1 uttrykk i begge celletyper, men disse hemmende effekter ble ikke sett med BAY-11-7082 (Fig. 3C). På den annen side, ciglitazon redusert SIRT1 uttrykk bare i A2780 /AD hvor SIRT1 nivåer ble forhøyet.
15d-PGJ
2 hemmer sårtilheling prosessen
Siden kjemoterapeutiske resistente celler kan har forskjellig vandringsadferd enn vill-type-versjonen har vi dessuten undersøkt effekten av indusert motstand på disse parameterne ved hjelp av
in vitro
til sårbehandling assay. Analysen måler typisk migrering av celler ved å måle avviklingen av en standard skrape i tid. Vi fant at A2780 /AD celler hadde betydelig tregere migrering enn A2780 celler (fig. 4A og 4B). 15d-PGJ
2 redusert migrering av begge celletyper på en doseavhengig måte (fig. 4C). Selv 15d-PGJ
2 reduserte celle levedyktighet i A2780 /AD celler på 2,5 mikrometer konsentrasjon (Fig. 1C), fikk vi ikke se celledød i disse forsøkene som kan være på grunn av sammenflytende cellelag brukt i disse forsøkene. Vi fant tidligere at i sammenflytende cellelaget 15d-PGJ
2 hadde ingen effekt på cellelevedyktigheten til A2780 /AD (data ikke vist). Fravær av celledød i disse forsøk er også tydelig i de representerte bilder (fig. 4A). De hemmende effekt på sårtilheling ble også sett med BAY-11-7082, men ikke med ciglitazon indikerer effekten av 15d-PGJ2 kan være på grunn av sin NF-kB hemmende effekter.
For å fastslå effekten av 15d- PGJ
2 på cellemigrering, ble en sårheling analyse utført på A2780 og A2780 /AD-celler som beskrevet i materialer og metoder. (A) Representative bilder som viser scratch (sår) ved t = 0 t og t = 48 t med /uten ulike behandlinger. Et merke (visualisert i disse bildene på øvre eller nedre side) ble plassert for å finne det samme området på scratch, bildene ble gjort ved hjelp av en invertert mikroskop og det åpne området ble beregnet på angitte tidspunkter. Forstørrelse, 40 ×. (B) Grafen viser% sårtilheling i A2780 og A2780 /AD celler uten behandling. A2780 cellene hadde høyere migrasjon hastighet i forhold til A2780 /AD celler. Data representerer gjennomsnitt ± SEM for 3 forskjellige eksperimenter. **
p
0,01 versus A2780 /AD. (C) Behandling med 15d-PGJ
2 og BAY-11-7082 hemmet sårtilheling respons etter 48 h inkubasjon mens ciglitazon ikke viste noen hemmende effekter. Data representerer gjennomsnitt ± SEM for 3 forskjellige eksperimenter. *
p
0,05 og **
p
. 0,01 versus verdier ved t = 0 h
Effekt av 15d-PGJ
2 på cellemorfologi
i løpet av inkubasjon med 15d-PGJ
2, la vi merke til at cellene ble forvandlet til forstørret og langstrakte celler. Dette fenotypiske endringen var mest fremtredende synlige i DOX-resistente A2780 /AD celler. Disse cellene ble først avrundet og krympet, men etter transformasjon de oppnådd mer cytoplasma med forskjellige cellulære grenser og vises en opptreden av epitel-lignende struktur (Fig. 5A). Behandling med ciglitazon eller BAY-11-7082 indusert ingen endring i celle morfologi indikerer ingen rolle PPARy og NF-kB veier. Siden det ble rapportert i litteraturen at den HDAC-inhibitoren trichostatin A kunne forvandle ovarian carcinoma celler [13], behandlet vi cellene med trichostatin A og fant at celler ble transformert på en lignende måte som med 15dPGJ
2 (fig. 5A ). Selv A2780 celler også sett mer strukket med 15d-PGJ
2 og trichostatin A, forskjeller versus kontrollceller var ikke stor (Fig. 5B).
(A) Representative bilder som viser endringen i cellen morfologi A2780 /AD etter inkubasjon med 15d-PGJ
2 (2,5 mm) og trichostatin A (70 nM). I kontrast, gjorde andre behandlinger som ciglitazon og BAY-11-7082 ikke påvirke morfologi. Piler påpeke de transformerte celler som hadde mer cytoplasma og epitelceller struktur. Forstørrelse, 200 × (B) Representative bilder av A2780 celler etter inkubasjon med ulike behandlinger. Behandling med 15d-PGJ
2 (2,5 mm) og trichostatin A (70 nM) førte til en klar økning i cytoplasma. Forstørrelse, 200 × (C) Forhold av sneglen til e-cadherin genuttrykk i A2780 og A2780 /AD celler. Data representerer gjennomsnitt ± SEM for 3 forsøk.
Siden transformasjon av celler kan være relatert til epitel-mesenchymale overgang (EMT) prosess, undersøkte vi uttrykket av sneglen og e-cadherin transkripsjoner og fant at forholdet mellom sneglen til e-cadherin ble økt i begge celletyper etter eksponering på 2,5 mikrometer 15d-PGJ
2 om forskjellene ikke var statistisk signifikant. Disse dataene indikerer at endring i celle morfologi indusert av 15d-PGJ
2 kan skyldes induksjon av EMT prosessen.
15d-PGJ
2 hemmer uttrykk HDAC 1, 2 og 3 mRNA
Siden celletransformasjons virkningene av 15d-PGJ
2 ble også indusert ved HDAC-inhibitor, undersøkte vi effekten av 15d-PGJ
2 på HDAC i begge celletyper. Først må vi sammenlignet mRNA-nivåene av HDAC1, 2 og 3 i A2780 og A2780 /AD-celler og fant at HDAC2 var signifikant nedregulert i de resistente celler sammenlignet med villtype-celler (Fig. 6A). Behandling med 15d-PGJ
2 inhiberte HDAC1, 2 og 3 mRNA uttrykk i begge celletyper doseavhengig måte (fig. 6B og 6C). Effekten var mest uttalt i resistente celler. Disse hemninger ble ikke funnet med ciglitazon og BAY-11-7082, men det var en økning i HDAC1 uttrykk etter NF-kB hemming med BAY-117082.
(A) i sanntid qPCR data viser forskjellene mellom basal genuttrykk nivåer av HDAC 1, 2 og 3 i A2780 og A2780 /AD celler. **
p
0,05 versus A2780 celler. Virkning av forskjellige behandlinger på HDAC-genene ble bestemt på A2780 (B) og A2780 /AD-celler (C) etter 48 timers inkubering. Data representerer gjennomsnitt ± SEM for 3 separate eksperimenter. Statistiske forskjeller versus de respektive kontrollene er vist som *
p
0,05 og **
p
. 0,01
15d-PGJ
2 hemmer SIRT1 og HDAC enzymer aktiviteter på grunn av sine elektrokarbonatomer
Siden vi fant ut at 15d-PGJ
2 kunne hemme genuttrykket av SIRT1 og andre HDACs, vi lurte på om 15d-PGJ
2 var i stand til å hemme disse enzymaktiviteter direkte. Vi brukte en p53 sekvens basert substrat (Arg-His-Lys-Lys (e-acetyl) -AMC) analyse for å bestemme SIRT1 aktivitet og for HDAC1 vi brukt et acetylert lysin-substrat-baserte analysen. For å finne ut om den C9 elektrofil karbonatom er ansvarlig for virksomheten, inkludert vi 15d-PGJ
2 analoge CAY-10410 som mangler elektrofile på C9 (Fig. 7A). Vi fant ut at 15d-PGJ
2 hemmet SIRT1 aktivitet doseavhengig med opp til 71% hemming mens CAY-10410 viste bare bare moderat hemming av 23%, mens ciglitazon viste ingen hemming i det hele tatt (Fig. 7B). I HDAC1 enzym assay, 15d-PGJ
2 førte til 40% hemming men CAY-10410 og ciglitazon viste ingen hemming (Fig. 7C).
(A) Kjemiske strukturer av 15d-PGJ
2 (15-deoksy-Δ
12,14-prostaglandin J
2), og dens analoge CAY-10410 (9,10-dihydro-15-deoksy-Δ
12,14-prostaglandin J
2). Stjerne indikerer de elektrofile karbonatomer som kan være involvert i Michael-addisjonsreaksjon. Panel (A) og (B) viser konsentrasjonsavhengige effekter av 15d-PGJ
2, CAY-10410 og ciglitazon på deacetylase aktivitet SIRT1 og HDAC1, henholdsvis ved hjelp av
in vitro
enzymanalyser.
# P 0,01 versus ciglitazon,
† p 0,05 og
†† p 0,01 versus CAY-10410. (D) Effekt av CAY-10410 på cellelevedyktigheten til A2780 og A2780 /AD celler som målt med en Alamar blå analyse. (E) Behandling med CAY-10410 (2,5 mm) ikke induserer celletransformasjon etter 48 timers inkubering. Forstørrelse, 200 ×.
Vi videre undersøkt om effekten av 15d-PGJ
2 ble vist på grunn av C9 elektrofil atom, vi testet effekten av CAY-10410, mangler elektrofile på C9 karbonatom, på cellenes levedyktighet og transformasjon. Vi fant ut at CAY-10410 gjorde verken indusere en celle død eller transformasjon av celler (Fig. 7D og 7E).
Diskusjoner
I denne studien har vi demonstrert effekten av 15d -PGJ
2, et produkt av cyklooksygenase-aktivitet og som en endogen PPARy agonist, på apoptose, medikamentresistens, cellemigrering og transformasjon av kreftceller. Vi undersøkte effektene på villtype samt doksorubicin-resistente eggstokkreft celler.
