Abstract
Den mest dødelige fase i kreft progresjon er metastatisk konvertering. Epitelial til mesenchymale overgang (EMT) er en viktig prosess der kreftceller erverve invasive og metastaserende fenotyper. For å gyte makroskopiske metastaser, vil spres kreftceller synes å kreve selvfornyelse evne. Imidlertid er den underliggende mekanisme som avgrenser disse prosessene dårlig forstått. En mulig mekanisme underliggende metastaser er fusjon mellom myeloide celler og kreftceller. I denne studien fant vi at spontant dannede tumorigene hybrider mellom benmargavledede mesenchymale stamceller (MSC) og tre ulike ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer bidratt til svært ondartet subpopulasjoner med både EMT og stamcelleliknende egenskaper. Hybrider mistet sin epitelial morfologi og antatt en fibroblast-lignende utseende. Oppregulering av vimentin, α-glattmuskel aktin (α-SMA), og fibronektin, og nedregulering av E-cadherin og pancytokeratin ble observert i tumorigen hybrider. Disse cellene også utstilt økt uttrykk av stamcelleforskningen markør prominin-en (CD133) og over-uttrykk for transkripsjon faktorer OCT4, Nanog, BMI1, Notch1, ALDH1 samt Sox2, alle gener ansvarlig for å regulere og opprettholde stamcelle fenotype. I tillegg, i spontant dannede hybrider tumorigene, økt pneumosphere dannende kapasitet og svulst-dannende evne i NOD /SCID-mus var påvisbare. Således tilveiebringer cellefusjon mellom lungekreftceller og MSC en nonmutational mekanisme som kan bidra til en avvikende genuttrykksmønster og gi opphav til svært maligne subpopulasjoner begge i stand til EMT og med egenskaper av kreft stamceller (cscs).
Citation: Xu MH, Gao X, Luo D, Zhou XD, Xiong W, Liu GX (2014) EMT og Oppkjøp av stamcelle-lignende egenskaper er involvert i Spontan Dannelse på karsinogent Hybrider mellom lungekreft og Bone Marrow-avledet stamceller . PLoS ONE 9 (2): e87893. doi: 10,1371 /journal.pone.0087893
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 17 august 2013; Godkjent: 06.01.2014; Publisert: 06.02.2014
Copyright: © 2014 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (81071728). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lungekreft, spesielt ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), forblir den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet over hele verden. De vanligste formene for såkalt NSCLC inkluderer adenokarsinom, plateepitelkreft og store celle karsinom [1], [2]. Tumormetastaser er den primære årsaken til død på grunn av NSCLC. Men forblir de mekanismene som er involvert i tumormetastase dårlig forstått.
epitel-mesenchymale overgang (EMT) er et trans-differensiering prosess der cellene gjennomgår en morfologisk overgang fra epiteliale polarisert fenotype til mesenchymale fibroblastoid fenotype, og innebærer tap av celle polaritet, redusert celle-til-celle-adhesjon, og økt bevegelighet og evne til migrering [3]. EMT har blitt foreslått å være et viktig skritt i kreftcelle spredning og metastasering. Under prosessen med tumormetastase, som ofte aktivert ved en EMT, ville disseminerte kreftceller ser ut til å kreve selvfornyelse evne, for å gyte makroskopiske metastaser. Nyere arbeid viste at prosessen med EMT genererer celler med stemlike egenskaper i melkecellepopulasjonen [4]. Koblingen mellom EMT og oppkjøp av stamcelleliknende egenskaper av kreftceller kan forklare hvorfor EMT induserer tumorprogresjon. Men mekanismene som induserer og deretter opprettholde denne mesenchymale /stamcelle tilstand fortsatt uklare.
Oppkjøpet av metastatisk evne ved kreftceller er ansett som en sen hendelse i utviklingen av ondartede svulster, der metastatisk celle er antas å oppstå gradvis og trinnvis å akkumulere ytterligere mutasjoner som kreves for bevegelighet. Nylig har imidlertid dette paradigmet blitt utfordret. Nye bevis tyder på at ondartede cellene kan spre på et mye tidligere stadium enn tidligere er ført i tumorigenesis [5], [6]. Dette tyder på at en tidligere trigger må være drivkraften i utviklingen av bevegelige fenotype, slik at noen av disse cellene til å bryte fri fra den primære svulsten, invadere microvasculature, reise og etablere foci i fjerne områder. Dannelse av hybrider mellom kreftceller og normale benmarg-avledede celler i tumorassosiert stroma er blitt forfektet som en nonmutational mekanisme som kan bidra til en avvikende genuttrykksmønster forbundet med høyt maligne subpopulasjoner [7] -. [11]
Cell fusjon er en fundamental prosess som skjer i både helse og sykdom, hvor to eller flere celler blir en ved å slå sammen sine plasmamembraner og omorganisere sine kjernefysiske innholdet. Avkommet av cellefusjon er kjent som hybrider. Slike fusjons hybrider deler de genetiske og funksjonelle egenskaper begge foreldreceller [7], [9], [12]. Genomet av kreftceller kan bidra tumorigenicity til hybrider, mens myeloide celler kan bidra uttrykk for mesenchymale gener og økt metastatisk potensial.
I løpet av det siste tiåret, flere forskjellige undergrupper av tumor-infiltrerende myeloide celler har vært beskrevet [ ,,,0],13], blant hvilke mesenchymale stamceller (MSC) har trukket oppmerksomhet for å ha en rolle i progresjon av kreft [14] – [16]. MSC er en liten bestand av celler i mesenchymale stromal cellerommet som har kapasitet til å fornye seg selv og til å differensiere i flere celle linjene. MSC infiltrasjon er vanlig i NSCLS [17]. I de fleste tilfeller, tumor-infiltrerende MSC tilveiebringe forskjellige funksjonsmidler for å fremme malignitet, som strekker seg fra strukturell støtte til å lage en pre-metastatisk miljø [18], [19].
Til sammen utgjør disse forskjellige linjer bevis tyder på hypotesen om at fusogene myeloid celle-populasjoner, slik som MSCer, kunne lette muligheten for tumorceller til å erverve mesenchymale og stamcelle-lignende egenskaper ved å overføre forskjellige cellulære funksjoner i løpet av en fysisk blanding arrangement med kreftceller. Derfor er målet med denne studien var å finne ut om hybrider dannet ved fusjon mellom humane lungekreftceller og benmarg-avledede MSC kan bli en ressurs for mesenchymale /kreft stamceller-lignende celler.
Resultater
Spontan Dannelse av MSC-lunge kreft Hybrider
Kultur MSC utstilt fibroblast-lignende celle morfologi (Figur S1 A), typiske fenotyper og var positive for CD44, CD105 og negativ for CD34 (figur S1B), og har multipotency til å differensiere i osteoblaster, adipocytter og chondrocytes etter osteogene, adipogenic og chondrogenic induksjon differensiering (figur S1C-E).
Vi vurderte først om spontant dannede heterotypic hybrider kan bli funnet i en co-kultur eksperiment. Den MSC ble fluorescens-tagget av retrovirale transduksjon med RFP-uttrykke vektorer, og lungekarsinom celler ble tagget av EGFP-uttrykke vektorer. Vi co-dyrkede humane MSC med menneskelig A549, H460, eller SK-MES-1 lungekreftceller. Etter 72 timer, celler som uttrykker både EGFP og RFP ble påvist (figur 1A). Som cellefusjon kommet, observerte vi MSC gradvis snu grønt og lungekreftceller gradvis snu rød, dermed dually fluorescerende celler, med tydelig stromal morfologi og utslipp gul fluorescens, dukket opp (figur 1B). Nærvær av to eller flere kjerner ble påvist i de fleste av disse cellene. Den heterotypic blanding befolkning utgjøres 2,91 ± 0,35% 1,23 ± 0,13% eller 3,20 ± 0,48% av de totale celler i MSC-A549 ko-kultur, MSC-H460 ko-kultur eller MSC-SK-MES-1 ko-kultur, respektivt , som målt ved flow-cytometri (figur 1C). Men et kontrollforsøk viste at cellefusjon var relativt ikke-detekterbar når co-dyrkning av humane MSCer med BEAS-2B (normal human bronkial epitelcellelinje) eller MRC-5 (normal fibroblast cellelinje human lunge), respektivt.
(A) Fluorescerende mikrografer av et ko-kultur av A549-EGFP (grønn) og MSC-RFP (red), som viser dannelsen av dobbeltmerket hybridcelle med to kjerner og en fibroblastisk form (piler). Scale bar, 50 mikrometer. (B) Fluorescent mikrobilder, tatt på to timers mellomrom, for co-kulturer av SK-MES-1-EGFP (grønn) med MSC-RFP (red), viser tydelig engasjement fra cellefusjon (piler) og endring i farge i samspillet av lungekreft celler med MSC. Scale bar, 10 mikrometer. (C) Kvantifisering av spontan hybridisering mellom lungekreftceller (A549-EGFP, H460-EGFP eller SK-MES-1-EGFP) og MSC-RFP i høy tetthet co-kultur. Antallet av hybrider ble undersøkt ved flowcytometrisk analyse og uttrykt som en prosentandel av de totale celler. Data representerer gjennomsnittet ± SEM av tre eksperimenter. (D) FISH analyse av HCC827 /MSC co-kulturer. Mann MSC ble dyrket med kvinnelig HCC827 lungekreftceller i 8 dager og fikset. FISH (Spectrum rød-Y-kromosom og Spectrum grønn-X kromosom) ble utført og kjerner ble farget med DAPI (blå). Grønne pilene viser X-kromosomer og røde piler, Y-kromosomer. Mann MSC uttrykt en Y-kromosom og ett X-kromosom, mens kvinnelige HCC827 cellene uttrykte bare X-kromosomer. I HCC827 /MSC hybrider: eksempel på to celler, en husing to kjerner og den andre med en kjerne. Disse to celler hver ha en Y-kromosom som indikerer en MSC-avledet celle. Scale bar, 25 mikrometer.
For å bekrefte rollen som fusjon, kjønns særpregede MSC og HCC827 celler ble dyrket og heterotypic hybrider ble evaluert av FISH av kjønnskromosomer. For disse eksperimentene, ble kvinnelige HCC827 celler gjengis puromycin motstandsdyktig ved lentiviral transduksjon. De HCC827 /MSC-hybrider ble selektert ved eksponering til 1 ug /ml puromycin, noe som forårsaket fullstendig forsvinning av mannlige MSC. Etter 5 dager med valget, var forekomsten av mannlige-avledet hybrider med stromal morfologi oppdaget. Noen av hybrider inneholdt en enkelt kjerne med en y-kromosom og flere X-kromosomer, noe som indikerer at kjernen av en mannlig MSC hadde smeltet sammen med kjernen til et kvinnelig HCC827 celle. Noen celler inneholdt to kjerner, en med en y-kromosom, og den andre uten en y-kromosom, som indikerer at membranen av en mannlig MSC hadde smeltet sammen med membranen av en kvinnelig HCC827 celle uten sammensmelting av de to kjerner (figur 1D). Andre celler inneholdt en enkelt kjerne med ett Y-kromosom og ett X-kromosom, noe som tyder mitose av smeltet multinucleated celler som gir opphav til MSC-avledet mononukleærerte datterceller (figur S2A).
For å bekrefte forekomsten av fusjon
in vivo
, kjønns særpregede MSC og HCC827 celler ble nylig blandet i samme forhold som den som brukes i
in vitro
analyser da xenopodet ved subkutan injeksjon i NOD /SCID immunsvikt mus. Cell fusjon mellom MSC og HCC827 celler ble evaluert av FISH av kjønnskromosomer. Fem uker etter xenografting, ble spontant dannede manns avledet tumorigene hybrider registrert (Figur S2B). Sammen er disse dataene indikerer at spontant dannede MSC-lungekreft hybrider kan observeres både
in vitro Hotell og
in vivo
.
Fusion mellom MSC og lungekreft celler induserer morfologiske forandringer og vekst Hemming
på 5 til 7 dager etter utløpet av puromycin behandling, isolert vi puromycin-resistente fluorescerende hybrider av fluorescens-aktivert cellesortering. Etter fusjon med MSC-RFP, A549-EGFP celler mistet sin epitelial morfologi. De ble spredt og antatt en fibroblast-lignende utseende med en langstrakt form og front-to-back polaritet. Den samme effekt ble observert med H460-EGFP og SK-MES-1-EGFP-celler (figur 2A). Disse hybridene uttrykt både EGFP og RFP (figur 2B), og to eller flere kjerner ble påvist i de fleste av disse cellene. Våre observasjoner tyder på at en overgang fra epitelial til mesenchymale-lignende morfologiske egenskaper ble indusert ved fusjon.
(A) Phase kontrast av heterotypic hybrider og respektive foreldrelungekreftceller. Etter fusjon med MSC, lungekreft celler spredt, mistet sin epitelial morfologi og antatt en fibroblast-lignende utseende med langstrakt form og front-to-back polaritet. Scale bar, 500 mikrometer. (B) Confocal lasermikroskopi bildebehandling. A549 /MSC hybrider antatt en fibroblast-lignende utseende og uttrykk både EGFP og RFP. Scale bar, 25 mikrometer.
Deretter testet vi hypotesen om at fusjon med MSC kan påvirke kreftcelle spredning. I alle cellelinjene som ble testet (A549, H460 og SK-MES-1), sammensmelting med MSC-indusert veksthemming. Hybrider begynte å vokse langsommere enn de respektive sperrelungekreftceller fra dag 2, og differansen av veksthastigheten mellom de to gruppene var signifikant etter 4 dager (figur S3). Disse funnene tyder på at proliferativ potensialet av hybrider redusert vesentlig sammenlignet med respektive foreldre lungekreft celler på hvert tidspunkt etter Dag 2.
Fusion med MSC Fremmer en Shift fra epithelial til Mesenchymale Phenotype i lungekreftceller
i lys av de morfologiske endringer av MSC-lungekreft hybrider, neste undersøkte vi om de kjøpte et skifte i uttrykk fra en epitelial til mesenchymale repertoar. Vi brukte immunfluorescens og QRT-PCR for å undersøke uttrykk og distribusjon av E-cadherin, pancytokeratins, vimentin, α-glatt muskel aktin (α-SMA) og fibronektin i heterotypic hybrider og i sine respektive foreldrelungekreftceller. Vi brukte også QRT-PCR for å undersøke uttrykket av EMT-induserende transkripsjonsfaktorer som sneglen, Slug, Zeb1, Zeb2, Foxc2 og Twist gener.
immunfluorescens farging viste at sammenlignet med foreldrelungekreftceller, MSC -lung kreft hybrider viste en sterk reduksjon i protein uttrykk for E-cadherin og pancytokeratins samt betydelig økt uttrykk av vimentin, α-SMA og fibronektin i alle tre NSCLC cellelinjer (figur 3A-E).
de MSC og lungekreft celler ble fluorescens-tagget av retrovirale transduksjon med RFP- og EGFP-uttrykke vektorer, henholdsvis. Spontant dannede heterotypic hybrider uttrykt både EGFP og RFP. Immunfarging ble utført med primære antistoffer mot (A) E-cadherin (E-Cad), (B) pancytokeratin (PCK), (C) vimentin (Vim), (D) α-SMA, og (E) fibronektin (fibro) og avdekket ved hjelp AlexaFluor 647-merket sekundære antistoffer (lilla); kjerner ble farget med DAPI (blå). Scale bar, 25 mikrometer. (F) Uttrykket nivåer av mRNA som koder E-cadherin, vimentin, α-SMA, fibronektin, Foxc2, Slug, sneglen, Twist, Zeb1 og Zeb2 i spontant dannet A549 /MSC, H460 /MSC, SK-MES-1 /MSC heterotypic hybrider i forhold til respektive foreldrelungekreftceller som fastsatt av QRT-PCR. GAPDH mRNA ble anvendt for å normalisere variasjonen i malen lasting. Dataene er angitt som middelverdi ± SEM.
QRT-PCR-analyser viste at, i forhold til uttrykket i parenlungekreftceller, ble nivået av E-cadherin mRNA i hybrider sterkt redusert, mens ekspresjon av mRNA som koder mesenchymale markører ble markant økt (figur 3F). Det var også en betydelig økning i uttrykket av EMT-induserende transkripsjonsfaktorer (figur 3F).
For å bestemme kapasiteten på lungekreft celler til å erverve mesenchymale egenskaper uten fusjonsbegivenheter, EGFP-uttrykklungekreftceller og RFP-uttrykk MSC ble platet ut i topp og bunn brønner i en 0,4 pm-cellekultur innsatsen. Etter indirekte ko-kultur i 8 dager, lungekreftceller oppviste lignende ekspresjon av E-cadherin, vimentin, α-SMA og fibronektin i alle tre NSCLC-cellelinjer sammenlignet med foreldrelungekreftceller som ble dyrket alene (data ikke vist). Resultatene viste at MSC-lungekreft hybrider uttrykt markører assosiert med celler som har gjennomgått en EMT.
Hybrider tilegne seg økt motilitet og Invasivitet
For ytterligere å undersøke en annen funksjonell kjennetegnet av mesenchymale /stamcelle staten, gjennomførte vi
in vitro
motilitet analyser. I migrerings analyser, A549 /MSC hybridene var mer vandrende (5,5 ganger) sammenlignet med foreldre A549 celler, H460 /MSC hybridene var mer vandrende (5,9 ganger) sammenlignet med foreldre H460-celler, og SK-MES-1 /MSC hybridene var mer vandrende (4,1 ganger) sammenlignet med foreldre SK-MES-1-celler (figur 4A). I invasjons analyser, A549 /MSC hybridene var mer invasive (3,8 ganger) sammenlignet med moder A549 celler, H460 /MSC hybridene var mer invasive (5,9 ganger) sammenlignet med foreldre H460-celler, og SK-MES-1 /MSC hybridene var mer invasive (5,8 ganger) sammenlignet med moder SK-MES-1-celler (Figur 4B). Til sammen tyder våre observasjoner som spontant dannede hybrider mellom lungekreftceller og MSC representerer en subpopulasjon anriket for bevegelige celler.
trekkende og invasive potensial av cellene ble bestemt ved telling av antall celler som hadde migrert til den nedre overflate av filteret i 12 tilfeldig valgte mikroskopiske felt per innsats. (A) Migrasjons analyser: mikroskopiske bilder og kvantifisering. (B) Invasion analyser: mikroskopi bilder og kvantifisering. Dataene er angitt som middelverdi ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. Stjernene viser statistisk signifikante forskjeller mellom de heterotypic hybrider og respektive foreldrelungekreftceller (*
P
0,001). Scale bar, 50 mikrometer.
Gene Expression Profilering av Stemness Markers in hybrider
stamcelle markør prominin-en (CD133), en pentaspan membran protein, kan ikke være den eneste markør, men det er fortsatt den mest rapporterte markør for kreft stamceller (cscs) av lungekreft, og har blitt validert av ulike grupper [20] – [22]. Vi vurderte videre uttrykk for CD133 på MSC-lungekreft hybrider ved hjelp av flowcytometri og QRT-PCR. Flow cytometri analyse viste at i paren A549-celler, som uttrykker den prosentvise CD133 var omtrent 0,94% av den totale cellepopulasjon. Etter fusjon med MSC, uttrykk for CD133 økt 30 ganger. I tillegg øket CD133 ekspresjon i hybrider sammenlignet med deres respektive foreldre H460 og SK-MES-1-cellelinjer (figur 5A). QRT-PCR-analyser avslørte også at, i forhold til uttrykket i parenlungekreftceller, ble nivået av CD133 mRNA i hybrider signifikant øket (figur 5B). Disse dataene gir ytterligere bevis på at spontant dannet tumorigene hybrider mellom lungekreftceller og MSC skaffe over-uttrykk for stamcellemarkører ledsaget av passasje gjennom en EMT.
(A) Flowcytometri analyse av CD133 uttrykk i heterotypic hybrider og respektive foreldrelungekreftceller. Prosenter av CD133
+ celler er angitt i kontrollantistoff og spesifikke antistoff-farget celler. Grå og sort linje indikert negativ kontroll og prøve, henholdsvis. (B) Et uttrykk nivåer av mRNA som koder for CD133, Nanog, BMI1, Notch1, ALDH1, Sox2 og OCT4 i spontant dannede A549 /MSC, H460 /MSC og SK-MES-1 /MSC heterotypic hybrider i forhold til respektive foreldre lungekreft -celler som bestemt ved QRT-PCR. GAPDH mRNA ble anvendt for å normalisere variasjonen i malen lasting. Dataene er rapportert som gjennomsnitt ± SEM.
For å undersøke gener ansvarlig for regulering og vedlikehold av stamcelle fenotype av A549 /MSC hybrider, utførte vi QRT-PCR for OCT4, Nanog, BMI1, Notch1 , ALDH1 og Sox2. Interessant, transkripsjonsfaktorer OCT4, Nanog, BMI1, Notch1, ALDH1 og Sox2, som er kjent for å være tilstrekkelig til å omprogrammere mus eller humane somatiske celler til udifferensierte, pluripotente stamceller, ble funnet å være signifikant øket i hybrider sammenlignet med foreldrelungekreftceller, indikerer deres stemness fenotype (figur 5B). Disse funnene tyder på at selvfornyelse gener er over-uttrykt i spontant dannede hybrider mellom lungekreftceller og MSC.
Evne til å danne Tumor Spheres er Økt in hybrider
Den myke agar assay serverer som en
in vitro
surrogat måling av tumorgenisitet [23], mens den pneumosphere assay måler forankrings-uavhengig proliferasjon ved klonal tetthet
in vitro
og har vært forbundet med nærværet av stamcellepopulasjoner [ ,,,0],24]. Vi utsettes derfor disse cellene til både myke agar og pneumosphere analyser. Interessant, observerte vi at heterotypic hybrider dannet i det minste 7,5 ganger flere kolonier i bløt agar suspensjonskultur enn gjorde kontrollparenlungekreftceller (figur 6A og fig S4A). Like viktig er hybridceller viste signifikant øket evne til å danne pneumospheres sammenlignet med foreldrelungekreftceller, som danner i det minste 7,3 ganger mer enn pneumospheres deres parentale celler (figur 6B). Den pneumosphere størrelse av hybridceller var også signifikant større enn den til foreldrelungekreftceller. Ved dissosiering de innledningsvis dannede mammospheres og gjeninnføre disse cellene inn i sekundær mammosphere kulturer, ble det observert en moderat økning i sfære dannelsen av hybrider (fig S4B). Basert på denne analysen, konkluderte vi med at spontant dannede tumorigene hybrider mellom lungekreftceller og MSC skaffe enda en egenskap av cscs
(A) soft agar analyser:. Enkeltceller (1 × 10
3 per brønn) ble sådd ut i bløt agar i 6-brønns plater i triplikat. Mikroskopiske bilder og kvantifisering av heterotypic hybrider og respektive foreldre A549, H460 eller SK-MES-1 celler. Dataene er angitt som middelverdi ± SEM. (B) Pneumosphere analysen: Mikroskopiske bilder og kvantifisering av heterotypic hybrider og respektive foreldre A549, H460 eller SK-MES-1 celler; n = 12. Dataene er angitt som middelverdi ± SEM. Stjernene viser statistisk signifikante forskjeller mellom de heterotypic hybrider og respektive foreldrelungekreftceller (*
P
0,001). Scale bar, 100 mikrometer.
Heterotypic Hybrider Exhibit forbedret tumorigenitet og reprodusere Human Tumor
in vivo
For å teste om fusjon med MSC lykkes i endring tumor-initiering frekvens av lungekreftceller, injiserte vi A549 /MSC hybrider, H460 /MSC-hybrider, så vel som SK-MES-1 /MSC hybrider og respektive parenlungekreftceller inn i NOD /SCID-mus. Som angitt i tabell 1, har vi funnet at injeksjon av så få som 10
4 hybrider gående resulterte i veksten av tumor-xenografter med morfologiske egenskaper nøye ligner den tumorindusert av de respektive sperrelungekreftceller, som vist med hematoxylin og eosin farging (figur 7A). Volumet av tumor som genereres av hybridene var betydelig større enn den som resulterer fra parentale celler (figur 7B). Disse resultatene bekrefter at spontant dannet tumorigene hybrider mellom lungekreftceller og MSC representerer en undergruppe beriket for lungekreft initiere celler.
(A) MSC-lungekreft hybrider er tumorigent og regenerere lignende svulster til sine respektive foreldre lungekreftceller i NOD /SCID-mus. Hematoxylin og eosin (H E) farging utført på vevsprøver som stammer fra foreldrenes svulst eller fra svulster som genereres ved subkutan injeksjon av MSC-lungekreft hybrider i NOD /SCID mus (xenograft). Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (B)
Øvre panel:
Svulst potensialet til 1 × 10
3 A549 /MSC sammenlignet med 1 × 10
4 foreldre A549 celler. -Celler ble samtidig injisert i høyre (A549 /MSC) og venstre flanke (A549) av den samme mus og mus bildet ble tatt 12 uker etter injeksjon.
Nedre panel:
Gross patologi av tumor generert ved subkutan injeksjon av A549 /MSC hybrider i øvre panel. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Scale bar, 100 mikrometer.
Hybrider Cells reacquire Epitelial-lignende Morfologiske kjennetegn
in vitro Hotell og
in vivo
Ved Differensiering
etter 3 måneder i kultur, en generalisert overgang fra mesenchymale til epitelial-lignende morfologiske egenskaper ble observert for MSC-lungekreft hybrider (figur 8A). En lignende morfologisk endring ble også observert under vekst av tumorxenotransplantater. Celle form av hybrid xenografter var mye mer som foreldrelungekreftceller i utseende. Sterk membran uttrykk for pancytokeratins og E-cadherin in hybrid xenografter, sammenlignbare med uttrykket i foreldrenes lungekreft xenografter, og cellemorfologi var tankevekkende av epithelial naturen av svulstene, mens forbedret uttrykk for vimentin, α-SMA og fibronektin foreslo en MSC bidrag til hybrid-fenotypen (figur 8B). Disse dataene antyder ustabilitet av hybridene. Ettersom tiden går, en reversering av den blandede fenotype og omvendte prosessen kalles mesenchymale-epitel overgang (MET) finner sted.
(A) bilder ved suksessive tidspunkter, viser hjemfall av fibrinoblast morfologiske kjennetegn A549 /MSC hybrider til en epitelial, A549-lignende utseende i kultur. Skala barer: 500 mikrometer. (B) Immunhistokjemisk farging for de angitte antigener utført på vevsprøver hentet fra foreldre A549 svulst eller fra svulster som genereres ved subkutan injeksjon av A549 /MSC hybrider i NOD /SCID-mus. Explants av tumorxenotransplantater av A549 /MSc hybrider og foreldre A549 celler vises tilsvarende lungekreft som morfologiske egenskaper. Scale bar, 100 mikrometer.
Diskusjoner
Funnene presenteres her beskriver en uventet konvergens av EMT og stamcelleegenskaper i spontant dannede tumorigene hybrider mellom lungekreft celler og bein marrow- avledet MSC. Epitel-mesenchymale overgang (EMT) har blitt beskrevet gjennom det siste tiåret som en kritisk normal prosess under utvikling og sårheling, men nylig egenskaper EMT har vært innblandet i menneskelig patologi, inkludert kreft metastase [25]. Uavhengig av disse funnene har studier beskrevet bevis på stamceller i en rekke krefttyper. Mani
et al.
Først funnet en link mellom disse to sett av fenomener i brystsvulstceller i 2008 [4]. Men ingen forskning har ennå avslørt mekanismene bak dem, eller identifisert kilden til cellene med både EMT og stamcelleegenskaper. I denne studien demonstrerer vi for første gang at lungekreftceller kan skaffe mesenchymale egenskaper og stamcelleegenskaper gjennom en fusjon mekanisme med MSC. Oppdagelsen av spontant dannede tumorigene hybrider mellom lungekreftceller og benmarg-avledede MSC med mange av egenskapene til både EMT og selvfornyende stamceller holder løftet om å løse et stort problem i kreft biologi. Under prosessen med tumormetastase, kan EMT egenskaper muliggjøre spredning av tumorceller fra primærtumor inn i omkringliggende stroma og således til fjerne områder [26]. Hvis imidlertid det store flertallet av celler som er spredt mangler selvfornyelse evne, er deres evne til å fant makroskopiske metastaser kompromittert fra begynnelsen på grunn av deres begrensede proliferative potensial. Utviklingen av hvilken denne hemmelighet kan løses, i det minste delvis, av de foreliggende funn, ettersom de spontant dannede hybrider mellom kreftceller og MSC skaffe både EMT og stamcelle-lignende egenskaper, gjør det mulig for kreftceller for å formidle fra en primærtumor og for å danne kolonier på avstand.
Nylig, koblingen mellom kreft progresjon og infiltrasjon med myeloide celler har blitt anerkjent i en rekke kreftformer [13]. Infiltrasjon med myeloide celler er vanligvis forbundet med dårligere kliniske utfall [27] – [29]. Betennelse er en viktig bestanddel av det lokale miljøet av tumorer [30]. Kjemokiner og cytokiner er avgjørende elementer, som bidrar til kreft-relaterte inflammasjon [31], [32]. Tiltrukket av kjemokiner, er en rekke av MSC fra benmargen rekruttert til kreft områder, og spille en rolle i å tilrettelegge lungekreft progresjon [17]. Nyere arbeider indikerer at kronisk betennelse kan fremme cellefusjon [33] – [35]. Foreliggende studie demonstrerer for første gang at MSC kan fremme EMT og spredning ved hjelp av fusjon med lungekreftceller. Det gir også en mekanistisk forklaring på lang anerkjent koblingen mellom betennelse og kreft progresjon.
Denne studien viser at cellefusjon mellom MSC og lungekreftceller resulterer i en undergruppe stiller mesenchymale morfologiske egenskaper og cytogenetiske abnormiteter, sammen med invasive funksjoner og selvfornyelse evne. Åpenbart genomet av lungekreftceller bidro tumorgenisitet til hybridene, mens MSC bidro ekspresjon av gener mesenchymale og økt metastatisk potensial. Noen av hybrider kan også få kapasitet til å fornye seg selv og til å differensiere i flere celle linjene fra benmargen-avledet MSC. Interessant, i en tidligere studie, spontant dannede tumorigene hybrider mellom MSC og brystkreftceller hadde en mesenchymale-lignende utseende og blandet uttrykk for mesenchymale og bryst karsinom gener [9]. Våre data er i samsvar med tidligere rapporter som spontant-smeltet tumorigene hybrider mellom MSC og kreftceller kan deretter vedta fenotype av mottakercellene [9], [12].
in vivo
tumorigent analysen bekreftet sine tumorigene egenskaper, mens økt uttrykk av vimentin, α-glatt muskel aktin (α-SMA) og fibronectin, og overekspresjon av transkripsjonsregulerende gener, for eksempel Slug, sneglen, Zeb1 , Zeb2, Foxc2 og Twist, tyder på at hybrider kan erverve mesenchymale eiendommer fra MSC. Videre overekspresjon av selvfornyelse gener som Bmi1, ALDH1 og oktober-4 viser at lungekreft celler kan erverve stamcellelignende egenskaper fra MSC ved fusjon.
Cogle
et al.
viste ingen tegn til en fusjon karyotype mellom epitelceller og benmargceller ved hjelp av konfokal mikroskopi og XY telling siden donor-avledet (Y kromosom positiv) celler oppdages av FISH inneholdt bare ett X-kromosomer [36]. Den paradoksale resultater som er nevnt ovenfor kan på grunn av ustabilitet av hybrider. Innen 3 måneder, både
in vitro Hotell og
in vivo
, de morfologiske egenskapene til hybridcellene endret. Dette indikerer at hybrider er ustabile.
